Name: 암세포의 PuraMatrix의 캡슐화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 배우세요 PuraMatrix를 이용한 CAR5 난소암 세포 캡슐화 및 3D 배양 방법을. 이 프로토콜은 생체 환경을 모사하여 미전이성 결절 형태를 연구하는 데 활용됩니다.

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테크니컬 노트 : <ul><li> 겔화는 소금의 추가에 의해 시작됩니다. 따라서 겔화가 원하는 때까지는 아무 소금이 PuraMatrix와 접촉하지 않는 것이 중요합니다, 매우 낮은 이온 강도의 염 (예를 들어, &lt;0.05 M)에 대한 노출은 돌이킬 수 겔화의 원인이됩니다. </li><li> 준비가되어 남은 주식 솔루션들은 소금​​과 접촉하지 않은 제공 나중에 사용할 수 있습니다. 당신은 반복 sonication 걱정할 필요가 없습니다. </li><li> 공기 방울은 원심 분리에 의해 다음 멸균 튜브에 PuraMatrix를 aliquoting 제거할 수 있습니다. </li><li> 흡인 쉽게 PuraMatrix 침대를 중단 수있는 미디어를 변경하는 동안 매우주의하십시오. </li></ul> 자료 : BD PuraMatrix RAD16의 펩타이드 히드로겔 - 1 % (고양이 # 354250) : undiluted 혼합물의 총 펩타이드의 농도는 10 MG / ML입니다. <ul><li> 워터 목욕 Sonicator 또는 소용돌이 </li><li> 96 - 웰 세포 배양 접시 </li><li> 세포 배양 미디어 </li><li> 멸균 필터링 H 2 O </li><li> 무균 필터링된 20 % 자당 </li><li> 셀 (전체 5,000 세포에 / 잘) OVCAR - 5 </li></ul> 모든 단계는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 절차 : <ol><li> 사용하기 전에 점도를 줄이기 위해 30 분 물 목욕 sonicator의 1 % PuraMatrix (RAD16)를 Sonicate. </li><li> 1 % PuraMatrix 솔루션은 이제 미래의 실험을 단순화하기 위해 멸균 튜브에 aliquoted 수 있습니다. <ol class="lalpha"><li> 공기 거품의 형성을 피하, 그들이 양식을 경우에는 간단하게 5 분 1,000 RPM (300 XG)에서 PuraMatrix를 포함하는 멸균 튜브를 스핀 다운. </li><li> undiluted 혼합물의 총 펩타이드의 농도는 10 MG / ML입니다. </li></ol></li><li> 4 웰스 두 세트는 각각 2.5 MG / ML 및 1.25 MG / ML 총 펩타이드 농도에서 도금한다. </li><li> 10 %의 자당의 BD PuraMatrix의 2 배 농도를 달성하기 위해 각각 잘 0.2 μm의 5 MG / ML 2.5 MG / ML 총 펩타이드 농도로 멸균 필터링 20 % 자당 및 13.3 %의 자당 설정된 각 PuraMatrix을 희석. <ol class="lalpha"><li> 20 %의 자당을 만들려면 다음 자당의 10g, 볼륨 50 ML 물로 희석. </li><li> 13 %, 10 %의 자당은 20 % 주식 솔루션을 diluting으로 준비하실 수 있습니다. <ol class="lroman"><li> 13 % 자당 (매 10 ML 용) : 6.5 ML 20 %의 자당 + 3.5 ML 살균 H 2 O. </li><li> 10% 자당 (매 10 ML 용) : 5.0 ML 20 %의 자당 + 5.0 ML 살균 H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> 당신이 접시하고자하는 우물의 숫자에 따라 PuraMatrix의 펩타이드의 마스터 믹스를 준비합니다. (아래 예제 참조). 그리고 마스터 믹스 25 ML을 포함하는 각각의 튜브로 나누어지는. <ol class="lalpha"><li> 그것이 도금하는 동안 세포의 동일한 볼륨에 희석 수로 마스터 믹스는 총 펩타이드의 두배가 원하는 최종 농도에서 준비되어야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"></li></ol></li><li> 세포 monolayer 셀 문화를 trypsinizing하여 셀 suspensions를 준비합니다. <ol class="lalpha"><li> 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML 각 T - 75 플래 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청을 (이전 단계에서 사용되는 트립신의 ML 당 미디어 최소한 2 ML)을 사용합니다. 포함된 세포 배양 매체 이외에 의해 트립신을 중화 </li><li> 세포 펠렛을 만드는 5 분 1,000 RPM (~ 300 XG)에서 세포를 원심 분리기. <ol><li> 10% 멸균 필터링 자당의 세포를 Resuspend. </li><li> 세포를 카운트하고 미디어에있는 소금 성분을 제거하는 5 분 1,000 RPM (~ 300 XG)에서 다시 다운 스핀. </li></ol></li><li> 물론 당 최종 셀 개수는 각 우물에 5,000 세포됩니다 5 전지 / ML 있도록 2.0 X 10 10 %의 자당의 OVCAR - 5 세포를 Resuspend. 다음 단계는 급속하게 수행하여야한다. </li><li> 로 위의 설계도에 표시된 PuraMatrix의 마스터 믹스 25 μl를 포함하는 첫 번째 개인 튜브에 2.0 X 10 5 셀 / ML 정지 25 μl를 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> 신속하게 공기 방울을 도입하지 않고 튜브 pipetting (위, 아래로 ~ 5 배)로 섞는다. </li><li> 다음 96 잘 요리의 적절한 우물에 50 μl 세포 현탁액 / PuraMatrix 혼합물을 피펫. </li><li> 부드럽게 잘 측면 150 μl 세포 배양 미디어 (RPMI + 10% FBS)을 pipetting하여 BD의 PuraMatrix의 겔화을 시작 <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"></li></ol></li><li> 모든 우물이 도금 때까지 8 설명한 단계를 반복합니다. </li><li> 30 분 후에 아주 부드럽게 히드로겔의 산도를 평형에 200 μl 피펫을 사용하여 미디어의 ~ 2 / 3 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 이것은 행렬을 방해하므로 진공 흡인기를 사용하지 마십시오 </li><li> 그래서 우물에 피펫 팁을 플레이스그것은 PuraMatrix 침대를 터치하고 부드럽게 우물에서 미디어를 제거하지 않습니다. </li><li> 치료는 PuraMatrix에서 세포의 문화 중에 매트릭스를 방해하지 않도록 주의해야한다. </li></ol></li><li> 아주 부드럽게 PuraMatrix에 캡슐 잘 들어있는 세포의 측면으로 신선한 세포 배양 매체 150 μl를 추가합니다. </li><li> 신중하게 단계 10 및 11를 반복하여 새로운 문화 매체와 각 잘마다 48 시간 이내에 세포 배양 매체를 변경합니다. </li></ol> 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림은 1. OVCAR - 5 세포는 위의 프로토콜에서 설명한대로 캡슐되었습니다. 사파이어 레이저 750 nm의로 조정 : 이미지는 스펙트럼 - 물리 DeepSee 티 갖춘 거꾸로 올림푸스 FV1000 현미경을 사용하여 인수했다. 이미징 세션은 일 1, 3, 5 7 이후 도금을 실시했다. 40x 목적을 찍기 긴 작동 거리, 물 (올림푸스 LUMPLFLN 0.8 NA)는 PuraMatrix을 통해 이미지로 사용되었습니다. 입체적인 볼륨이 1.47 μm의 축 단계에서 이미지 스택을 인수함으로써 수집되었다. 투 비 descanned 감지기 바이올렛 (440-490 nm의)과 녹색 (510-550 NM) 대역 통과 필터를 사용하여 autofluorescence 방출을 수집했습니다. 최종 이미지와 깊이 스택 영화는 모두 탐지 채널을 결합하여 ImageJ를 사용하여 처리되었습니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

암세포의 puramatrix의 캡슐화

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

증가 증거 recapitulates 종양 생물학의 복잡보다 정확하게 3 차원에 해당 culturing의 암 세포를 제안합니다. 이러한 모델의 대부분은 이러한 세포 배양 모델의 성장에 영향을 미칠 수 성장 요인과 크린 시토킨의 변수 금액을 포함하는 동물에서 파생된 재구성 지하 막을 활용한다. 여기서는 자세하게 설명 PuraMatrix, 동물 파생 자료와 난소암 세포 라인, OVCAR - 5 캡슐하고 전파하는 병원균의 찾아볼 수있는 상용 자기 조립 펩티드 젤의 준비와 사용합니다. 우리는 사용하기 전에 PuraMatrix를 준비하는 방법을 설명하여 시작합니다. 다음, 우리는 제대로 히드로겔에있는 세포를 캡슐로 PuraMatrix와 세포 현탁액을 혼합하는 방법을 보여줍니다. 생리적 환경으로 세포 배양 미디어 또는 분사의 추가시 PuraMatrix의 펩타이드 성분이 빠르게 자체 5-200 NM의 평균 기공 크기가 나노미터 규모의 섬유 구조를 전시하고 3D 히드로겔로 조립<sup&gt; 1</sup&gt;. 또한, 우리는 캡슐 PuraMatrix 재배 문화를 전파하는 방법을 보여줍니다. PuraMatrix에서 캡슐 때, OVCAR - 5 세포는보다 밀접하게 체외 모델에서 monolayer보다 병원에서 관찰 micrometastatic nodules의 형태와 유사한 것을 입체 acinar 구조로 조립. 공촛점 현미경을 사용하여 우리는 하루에 1, 3, 5, 7 게시 도금에 PuraMatrix에 캡슐 대표 OVCAR - 5 세포의 모양을 보여줍니다. 문화 암세포에 PuraMatrix의 사용은 질병의 우리의 이해를 개선하고 우리는 더 많은 임상 예측 모델 시스템의 치료 반응을 평가하기 위해 허용해야합니다.

이 동영상은 PuraMatrix, 펩타이드 젤 조립 시판 자체 캡슐 문화 암세포하는 방법을 보여줍니다.

암세포의 PuraMatrix의 캡슐화

암세포를 3차원으로 배양하는 것이 종양 생물학의 복잡성을 더 정확하게 재현한다는 증거가 점점 더 많이 제시되고 있습니다. 이러한 많은...

단층 세포 배양 모델은 암을 포함한 다양한 질환을 연구하는 데 매우 유용한 도구였습니다. 하지만 이러한 모델은 생체 내에서 관찰되는 3차원 환경을 재현하지 못한다는 한계가 있습니다. 본 영상에서는 상용화된 자기 조립 펩타이드 겔인 pure Matrixx를 사용하여 난소암 세포주인 CAR five를 캡슐화하고 증식시키는 방법을 시연하겠습니다.세포 현탁액을 순수 Matrixx 및 세포 배양액과 혼합합니다. 캡슐화 후 순수 Matrixx에서 배양되어 순수 Matrixx의 Carv 내에서 배양을 시작하기 위해 배지를 첨가합니다. 다섯 개의 세포가 모여 미세전이 결절의 형태와 유사한 3D ASIN R 구조를 형성합니다. 안녕하세요, Adnan Abbi입니다.저는 매사추세츠 종합병원의 여성 광의학 센터(Woman Center for Photo Medicine), TBA Hassan 박사 연구실의 연구원입니다. 오늘은 pure matrix라고 불리는 합성 매트릭스 내에 난소암 세포주를 캡슐화하고 배양하는 프로토콜을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 난소암의 치료 반응을 평가하기 위해 이 모델을 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. BD 1%pure matrix RAD 16 펩타이드 하이드로겔은 사용 전 총 펩타이드 농도가 10 mg/mL입니다. 멸균 상태를 유지하면서 워터배스에서 30분 동안 초음파 처리하여 pur matrix의 점도를 낮추십시오.1% 순수 매트릭스 용액을 멸균 튜브에 분주합니다. 향후 실험을 간편하게 하기 위해 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며, 만약 공기 방울이 형성되면 순수 매트릭스가 담긴 멸균 튜브를 1000 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 본 시연에서는 총 펩타이드 농도를 각각 2.5 mg/mL와 1.25 mg/mL로 하여, 4개의 웰로 구성된 두 세트를 플레이팅하겠습니다. 플레이팅하려는 웰의 수(본 사례에서는 8개)에 따라 순수 매트릭스 펩타이드 마스터 믹스를 두 종류 준비합니다.각 마스터 믹스는 플레이팅 과정에서 동일한 부피의 세포와 희석되므로, 총 펩타이드의 최종 희망 농도의 2배 농도로 준비해야 합니다. 마스터 믹스를 만들기 위해, 멸균된 10% sucrose 및 13.3% sucrose를 사용하여 pure matrix를 각각 5 mg/mL 및 2.5 mg/mL의 총 펩타이드 농도가 되도록 희석하여 10% Sucrose 내 pure Matrixx의 2x 농도를 구현하십시오. 그다음, 마스터 믹스 25 µL를 8개의 개별 튜브에 분주합니다. 이제 세포 캡슐화를 위한 pure matrix 마스터 믹스가 준비되었습니다. 본 실험에서는 난소암 세포주인 CAR5를 캡슐화하여 증식시킬 것입니다. 트립신 처리 전, 세포를 칼슘과 마그네슘이 없는 멸균 PBS 10 mL와 함께 15분에서 20분 동안 배양하십시오.PBS를 흡입하여 제거하고 세포 단층 배양 세포를 트립신 처리한 후, 10% 열 불활성화 태아 송아지 혈청이 포함된 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 이전 단계에서 사용한 트립신 1 mL당 최소 2 mL의 배지를 사용하십시오. 다음으로, 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.원심분리 후, 세포 펠렛을 10% 멸균 여과된 sucrose에 부유시킵니다. 세포 수를 측정하고 1000 RPM에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 배지 내에 존재하는 미량의 염을 제거하기 위해, 웰당 최종 세포 수가 5,000 cells가 되도록 세포를 10% sucrose에 2 × 10⁵ cells/mL 농도로 부유시킵니다.이제 세포를 pure Matrixx 내에 캡슐화할 준비가 되었습니다. pure matrix 내에 세포를 캡슐화하는 다음 단계들은 신속하게 수행되어야 합니다. 이전에 준비한 세포 현탁액 25 µL를 pure Matrixx 마스터 믹스 25 µL가 포함된 첫 번째 개별 튜브에 넣습니다. 공기 방울이 생기지 않도록 튜브 내에서 피펫팅을 약 5회 반복하여 빠르게 혼합합니다.그런 다음 50 µL의 세포 현탁액-pure Matrixx 혼합물을 96-well 세포 배양 플레이트의 해당 웰에 피펫팅합니다. 웰의 측면에 150 µL의 세포 배양 배지를 조심스럽게 피펫팅하여 BD pure matrix의 중합을 유도합니다. 나머지 웰에 대해서도 세포 캡슐화 단계를 반복합니다.이 단계들은 신속하게 수행되어야 하며, 다음 웰로 넘어가기 전에 하나의 웰에 대한 전체 캡슐화 과정을 완료해야 함을 기억하십시오. 8개 웰 모두에 플레이팅을 마친 후, 세포를 30분 동안 방치합니다. 30분 후 200 µL 피펫을 사용하여, 피펫 팁이 순수 매트릭스 층에 닿지 않도록 웰에 넣고 배지를 매우 조심스럽게 제거합니다. 하이드로겔의 pH를 평형 상태로 맞추기 위해 배지의 약 3분의 2를 제거해야 합니다.매트릭스가 손상될 수 있으므로 진공 흡입기를 사용하지 마십시오. 다음으로, pure Matrixx에 캡슐화된 세포가 포함된 웰의 가장자리에 신선한 세포 배양 배지 150 µL를 매우 조심스럽게 추가합니다. 앞서 보여준 것과 동일한 방식으로, 배지의 2/3를 제거하고 나머지 웰에 신선한 배지를 추가합니다.48시간마다 각 웰의 세포 배양액을 신선한 배양액으로 교체하십시오. 앞선 프로토콜에서 설명한 대로 Ocar five 세포를 캡슐화했습니다. 순수 매트릭스 내에서 캡슐화되어 배양된 OR five 세포의 1, 3, 5, 7일 차 대표 3D 렌더링 이미지가 제시되어 있습니다.지금까지 CAR5 난소암 세포주와 Pure Matrixx라는 합성 매트릭스를 이용하여 배양 내에서 캡슐화하는 방법을 살펴보았습니다. Pure Matrixx를 사용할 때, 이 프로토콜은 O Car 5 세포주에 최적화되었다는 점을 인지하는 것이 중요합니다. 각 연구자는 자신의 특정 세포주에 맞게 프로토콜을 최적화하고 미세 조정해야 합니다.배지를 교체할 때 매트릭스 층은 매우 취약하므로 이를 손상시키지 않는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오. 절대 흡입(aspirate)하지 말고 항상 피펫을 사용하십시오. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

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