Name: KLRG1 Tetramer의 생산을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 배우세요 KLRG1 테트라머 생산 프로토콜을 통해 면역학 연구에서 리간드-수용체 상호작용을 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 세균 배양과 IPTG 유도 단백질 발현을 포함합니다.

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우리는 refolding 조건을 최적화에 대한 도움 박사 Naidenko 감사합니다. 이 작품은 로랑 Brossay에 NIH 연구 부여 AI58181에 의해 지원되었다. 신디 반은 NIH NRSA F31 AI080230에 의해 지원됩니다. 스테파니 Terrizzi와 신디 반이 작품에 동등하게 기여하고 있습니다.

포함 기관의 준비 <ol><li> TB 4 X 500 ML flasks의 예방 각각 KLRG1 플라스미드 구조를 표현하는 박테리아의 야간 문화와 50 μg / carbenicillin과 chloramphenicol의 ML을 포함. OD 600 nm의에서 0.6 A를 도달하면, 37에서 0.4 M IPTG의 추가와 함께 유도하고 떨고 추가 4 시간 동안 문화를 품어 ° C. </li><li> resuspension 버퍼 산도에서 수확한 세포를 Resuspend = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 25 % (W / V) 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM DTT). 참고 : 알약이 단계에서 냉동 수 있습니다. </li><li> 폴리 프로필렌의 비커에 세균성 resuspensions의 더 이상 60 이상 ML을 풀. 필요는 TE 버퍼 산도 8.0 60 ML에 적응 절반 속도로 혼합물을 저어하는 경우. </li><li> 혼합물을 교반하려면 드롭 현명한 추가 라이 소 자임 (최종 = 1 MG / ML), MgCl2 (최종 = 5 ㎜), 2 MG DNAse 나는 50 % 글리세롤 75 MM NaCl, 트리톤 - X100 (최종 = 1 %), DTT를 (들어 최종 = 10 ㎜). </li><li> 1.5 분 얼음 솔루션을 Sonicate 4에서 10 분, 5,000 RPM에서 lysates을 원심 ° C. <ol class="lalpha"><li> 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 세척 버퍼 산도 15 ML 추가 = 8.0 (50 MM 트리스 - HCL, 0.5 % 트리톤 X - 100, 100 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM DTT). </li><li> 펠렛가 완전히 resuspended 때까지 얼음, 1.5 분 솔루션을 sonicate. </li><li> 4 10 분 5,000 RPM에서 샘플을 원심 ° C. </li><li> 세탁 5 회 반복합니다. </li></ol></li><li> TE 버퍼 4 ML에서 트리톤 X - 100, 원심 분리기 및 resuspend없이 세척 버퍼와 5B를 반복합니다. </li><li> 30-100 MG / ML의 농도에 젖은 무게 포함 기관의 슬러리 및 TE 버퍼에 저장을 가져가라. </li></ol> KLRG1의 Refolding <ol><li> 버퍼 산도를 refolding 1 L 만들기 = 8.0 (0.4 M 아르기닌 - HCL, 0.1 M 트리스 산도 8-8.3, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 MM PMSF, 3 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 테아제 억제제의 알약, 5 MM의 GSH와 0.5 MM의 GSSG)과 오한 4 ° C 감동하면서. </li><li> 접는 혼합물에 주입에 대한 포함 시체를 준비 : 이것은 단백질의 최종 농도가 2 3 μm의 될 수 있도록 0.25 0.5 μm의 농도로 각 5 10 주사를 만들기 위해 이상적입니다. <ol class="lalpha"><li> 10 MM β - 메르 캅 토 에탄올과 7 M GnHCl에 포함 기관 슬러리의 50 MG의 볼륨을 용융. </li><li> 유지 37 포함 기관 / GnHCl 혼합 ° 30 C - 40 분 및 와동 매 5 분 (슬러리가 완전히 녹아되면 취소가됩니다) 전체 융해를 보장합니다. </li><li> 4 microcentrifuge 30 분 최대 속도로 원심 분리기 ° C와 15 ML의 원심 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 작은 거무스름한 펠릿 중 하나를 전송하지 마십시오. </li></ol></li><li> 사출 버퍼 (3 M GnHCl, 10 MM의 NaAcetate, 산도 4.2,10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 볼륨을 조정하십시오. </li><li> 희석 포함 단체 1 ML 매 시간마다 주사. 주입하면, 높은 속도로 저어 각 드롭 사이 이초와 드롭하여 희석 포함 단체 드롭 1 ML를 추가합니다. 주입이 완료되면 낮은 속도로 저어. </li><li> 4 낮은 속도로 감동 밤새 계속 ° C. </li></ol> Refolding 반응 농도 <ol><li> Millipore의 프로토콜에 따라, Amicon를 사용하여 사전에 필터링 (0.22 μm의이 여과) refolding 반응의 제 1 L를 집중 셀 및 ~ 10 ML에 YM10 NMWL 10K의 ultrafiltration 막 (Millipore)를 만들어 냈다. </li><li> 사용 Centriplus YM - 10 10K MWCO (Millipore).을 ≤ 2 ML에 집중 </li></ol> KLRG1 tetramer의 정화 <ol><li> 4 AKTAFPLC를 설정 ° C GE 헬스케어 설명서에 따라. </li><li> Sephacryl S - 200 60분의 16 고해상도 20 MM의 HEPES에서 열 (GE 헬스케어) 150 MM NaCl을 사용하여 크기를 제외 크로마 토그래피에 의해 KLRG1의 모노머 양식을 정화. (그림 1 참조). </li><li> Centriplus를 사용하여 한 ML에 집중 YM - 10 10K MWCO (Millipore). </li><li> KLRG1 단량체를 biotinylate하는 욕망의 프로토콜에 따라 비라 효소를 사용합니다. </li><li> 무료 비오틴은 2와 같은 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 제거됩니다. </li><li> KLRG1 분자는 4 배 초과 어금니 PE 복합 streptavidin (BD Biosciences)와 KLRG1 단량체를 혼합하여 tetramerized 있습니다. </li></ol> 대표 결과 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"></a> 의 악타 FPLC 크기 배제 크로마 토그래피에서 그림 1. 대표 긍정적인 결과 KLRG1를 refolded. 그래프는 단량체의 분리 (83.52 ML), 이합체 (56.36 ML) 및 refolded KLRG1의 multimer (36.26 ML) 양식을 보여줍니다. 94.25 ML에있는 정상은 버퍼 교환을 나타냅니다.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

이 프로토콜에서는, 그것은 biotinylate, 정화하는 방법을 표시하고, tetramerize KLRG1입니다. KLRG1 tetramer는 유동세포계측법로 KLRG1 리간드 레이블을 사용할 수 있습니다. refolding 조건이 각각의 단백질에 대해 경험적으로 테스트해야되지만, 다른 C - 타입 lectins은 유사한 프로토콜을 사용 tetramerized 수 있습니다. 프로브, 고아 C - 타입 렉틴 수용체에 리간드로 tetramerized 단백질을 사용하면 잠재적으로 식별 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BirA 효소 및 버퍼</td><td>Biotinylation Kit</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Cell</td><td>장비</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>또는 동등 제품</td></tr><tr><td>YM10 NMWL 10K 초여과막</td><td>여과 소모품</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>15 ml YM10 농축기</td><td>여과 소모품</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 16/60 고해상도 컬럼</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidin PE</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>또는 동등 제품</td></tr></tbody></table>

klrg1 tetramer의 생산을위한 프로토콜

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

킬러 세포 렉틴 같은 수용체 G1 (KLRG1)은 C 타입 렉틴 같은 superfamily에 속하는 유형 II의 transmembrane의 당단백질 수용체 억제합니다. KLRG1는 단량체로서 이황화 결합 homodimer로 모두 존재합니다. 이 잘 보존되어 수용체가 가장 성숙하고 최근에 활성화된 NK 세포에서뿐만 아니라 효과기 / 메모리 T 세포의 일부에서 발견됩니다. KLRG1 tetramer뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여, E -, N - 및 R - cadherins은 KLRG1 리간드로 확인되었습니다. 이러한 칼슘 2 +에 의존 세포 - 세포 부착 분자는 세포 - 세포 상호 작용, transmembrane 도메인과 굴지의 cytoskeleton에 연결된 세포질 도메인에 대해 책임을 다섯 cadherin의 반복을 포함하는 세포외 도메인에 구성되어 있습니다. KLRG1 tetramer의 생성은 KLRG1 리간드의 식별에 필수되었습니다. KLRG1 tetramer 또한 면역 반응 및 조직 무결성을 규제의 역할 cadherin과 KLRG1 재생을 명료하게하다 수있는 유일한 도구입니다.

이 프로토콜은 KLRG1 리간드의 분석을위한 강력한 도구입니다 KLRG1 tetramer의 생산을 설명합니다.

KLRG1 Tetramer의 생산을위한 프로토콜

킬러 세포 렉틴 유사 수용체 G1(Killer cell lectin-like receptor G1, KLRG1)은 C형 렉틴 유사 슈퍼패밀리에 속하는 제2형 transmembrane 당단백질 억제 수용체입니다. ...

안녕하세요, 저는 브라운 대학교 분자 미생물학 및 면역학과의 Lauren Parce 교수님 연구실 소속 Stephanie Resi입니다. 오늘은 K LRG1 Tetramer를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 K LRG1의 일관된 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.시작하겠습니다. 먼저, 적절한 항생제가 포함된 500 mL TB 완충액이 담긴 플라스크 4개에 K LRG one 플라스미드 구조체를 발현하는 박테리아를 접종하고 37 °C에서 진탕 배양합니다. 600 nm에서 OD 값이 0.6에 도달하면 0.4 M IPTG를 첨가하여 T7 프로모터를 통해 발현을 유도하고, 37 °C에서 진탕 상태로 4시간 더 배양합니다. 4시간의 배양 후, 박테리아를 원심분리 튜브로 옮겨 4 °C, 3000 RPM에서 20분 동안 원심분리하여 침전시킵니다.필요한 경우, 펠렛을 영하 80°C에서 냉동 보관하여 추후에 사용할 수 있습니다. 수확한 세포를 30 mL의 재현탁 완충액에 재현탁합니다. 그다음, 박테리아 재현탁액을 폴리프로필렌 비커에 모아 최대 60 mL 부피가 되도록 합칩니다.필요한 경우, 추가 TE buffer pH 8을 사용하여 전체 부피를 60 milliliters로 맞추고, 핫플레이트 위에서 중간 속도로 혼합물을 교반합니다. pooled Resus 현탁액이 교반되는 동안 다음 용액들을 혼합물에 한 방울씩 떨어뜨립니다: Lysozyme, magnesium chloride, DNS 1, TRITTON X 100. 그리고 마지막으로 DTT를 추가합니다.초음파 컨버터가 장착된 피스처 디스멤버(fisure dismember)를 사용하여 30% 진폭으로 용액을 초원심분리 튜브로 옮깁니다. 얼음 위에서 용액을 1.5분 동안 초음파 처리하고, 용해물을 4°C에서 5,000 RPM으로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 따라내고 세척 버퍼 15 milliliters를 추가합니다. 펠릿이 완전히 재부유될 때까지 이전과 동일하게 초음파 처리를 반복하고 원심분리를 다시 수행하며, 세척, 초음파 처리 및 펠릿 형성 단계를 총 5회 반복합니다.마지막으로, Triton X 100이 포함되지 않은 세척 완충액을 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 한 번 더 원심 분리한 후 4 mL의 TE 완충액으로 재현탁합니다. 이것이 정제된 봉입체입니다.습중량으로 인클루전 바디(inclusion bodies)를 정량하십시오. 인클루전 바디 슬러리는 30~100 mg/mL 농도의 완충액 스톡 내에서 4 °C로 보관할 수 있습니다. 인클루전 바디가 준비되면 이제 리폴딩(refolding) 과정을 준비하십시오.1L의 신선한 Refolding buffer를 준비하고 4°C에서 낮은 속도로 교반하여 냉각시킴으로써 리폴딩 절차를 시작합니다. 다음으로, refolding buffer에 주입할 inclusion body 주입액 7회분을 준비합니다. 먼저, 7 M guanidine hydrochloride 및 10 mM β-mercaptoethanol이 포함된 최종 부피 1.4 mL의 마이크로 원심분리 튜브에 inclusion body 슬러리 스톡을 넣고, 37°C 항온수조에서 30~40분 동안 녹입니다.5분마다 볼텍싱을 수행합니다. 슬러리가 투명해지면 용해 과정이 완료된 것입니다.녹인 혼합물을 4°C의 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 30분 동안 원심분리하십시오. 그 다음, 작고 검은색을 띠는 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮기십시오.주입을 위해 주입 버퍼를 사용하여 부피를 7 mL로 맞춥니다. 먼저, 폴딩 혼합물의 교반 속도를 높음으로 올립니다. 그런 다음 희석된 봉입체 1 mL를 첨가합니다.각 방울 사이에 2초의 간격을 두고 한 방울씩 떨어뜨리십시오. 희석된 inclusion bodies 1 mL를 한 번에 추가하고, 각 주입 사이에 1시간의 간격을 둡니다. 교반 속도를 다시 낮음으로 설정하십시오.4 °C에서 저속으로 밤새 계속 교반합니다. 그러면 단백질을 농축 및 정제할 준비가 됩니다. 리폴딩된 KLRG1 사량체를 농축하기 위해 다음 단계를 시작합니다.먼저 22 µm 필터를 사용하여 반응액을 사전 여과합니다. 그다음 제조사 지침에 따라 Millipore Amicon stirred cell과 10 kDa 공칭 분자량 제한 초여과 막을 사용하여 반응액을 1 L에서 약 10 mL로 농축합니다. 이후 Millipore 10 kDa 분자량 컷오프 초여과 막을 사용하여 2 mL 이하가 될 때까지 추가로 농축합니다.제조사의 지침에 따라 크로마토그래피 시스템을 설정하십시오. 본 실험에서는 고분해능 컬럼을 사용하여 4 °C에서 GE healthcare ACTA fast protein liquid chromatography 시스템을 사용합니다. 20 mM HEPES 및 150 mM NaCl 완충액 내에서 크기 배제 크로마토그래피를 통해 K lrg의 단량체 형태를 정제하십시오.주입 부피는 컬럼의 전체 겔 부피의 2% 미만이어야 합니다. 다시 한번 제조사의 지침에 따라 Millipore 10 kilodalton 분자량 컷오프 초여과 막을 사용하여 KLG one monomer를 최종 부피 1 mL까지 추가로 농축합니다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 이전과 동일하게 정제함으로써 유리 비오틴을 제거하고 사량체를 얻습니다.KL LRG1 단량체를 4배 몰 과량의 FICO rine 결합 streptavidin 4량체와 혼합하면 이제 수용체 리간드 표지에 사용할 수 있습니다. 이 그래프는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 재접힘된 K lrg1 단백질을 분리한 양성 결과(왼쪽에서 오른쪽 방향)를 보여줍니다. 피크는 K LRG1의 다량체, 이량체 및 단량체 형태를 나타냅니다.가장 오른쪽에 있는 피크는 완충액 교환을 나타냅니다. 단백질마다 리폴딩 조건을 경험적으로 테스트해야 하지만, 다른 C형 렉틴 수용체들도 유사한 프로토콜을 사용하여 사량체로 만들 수 있을 것이며, 이를 통해 다른 리간드를 잠재적으로 식별할 수 있습니다. 방금 이 절차를 통해 KLRG 사량체를 생성하는 방법을 보여드렸습니다.유도 수준을 확인하고 리폴딩 조건을 엄격히 준수하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

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