조직학, 조직 형태 측정 및 분석을위한 Fluorochrome Undecalcified 본 준비

탈회 골 조직학은 뼈의 광화 성분과 세포 성분을 모두 보여주는 뼈의 미세구조를 나타내며, 골 turnover 또는 골 형성 및 흡수에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이는 다양한 임상 및 연구 응용 분야에서 매우 큰 중요성을 가집니다. 이를 통해 아름다운 이미지를 얻을 수 있으며 형광 평가 및 조직 광학 측정과 같은 기술을 적용할 수 있습니다.

석회화된 뼈 조직의 조직학적 분석을 수행하는 것은 기술적으로 까다로우며, 특히 표본의 크기가 클 때 더욱 그렇습니다. 본 영상에서는 뼈의 석회화 하부 단면을 얻는 과정에서 발생하는 기술적 어려움과 이를 극복하는 방법을 보여드립니다. 해당 단면들의 조직 형태 계측학적 평가는 다루지 않습니다.

이를 위해 다음의 중요한 출판물을 참조하시기 바랍니다. 본 영상에서는 조직 채취 후의 검체 준비 및 고정 처리, 연마 및 절단을 포함한 포매 및 절편 제작, 슬라이드 제작 및 염색 과정을 다룹니다. 검체.

이 경우, 양의 경추를 10% phosphate buffered formula 및 용액이 들어 있는 밀봉된 불투명 용기에 넣습니다. 형광 염료 분석을 수행하는 경우 빛 노출을 최소화해야 합니다. 형광 염료는 빛에 민감하므로, 검체를 실험실로 옮겨 크기에 맞게 다듬으며, 이는 고정 상태를 개선하고 블록에 적합하게 들어갈 수 있도록 합니다.

블록을 정확한 평면으로 제작하기 위해 이 시점에서 슬라이드 위 조직의 방향을 파악해야 합니다. 안전이 매우 중요하므로, 손이 칼날에 닿지 않도록 도구를 사용하여 작업해야 합니다. 이제 관심 영역이 크기에 맞게 트리밍되었습니다.

그 후, 조직 손실을 최소화하기 위해 더 작은 밴드 쏘(band saw)로 최종 트리밍을 수행합니다. 블록을 원하는 크기로 절단하면, 고정을 완료하기 위해 신선한 고정액이 들어 있는 밀폐된 불투명 용기에 넣습니다. 용기의 부피는 시편 크기의 약 10배가 되어야 합니다.

적절한 고정을 위해, 시료의 크기에 따라 1~2주 동안 정해진 처방의 용액에 보관한 후 70% Ethanol로 옮깁니다. 블록의 크기가 크고 뼈의 투과성이 낮아 용매의 확산 속도가 느리므로, 이후 공정은 천천히 진행합니다. 그다음 농도가 증가하는 순서의 에탄올을 사용하여 탈수 과정을 거친 후, 부탄올로 투명화 처리를 합니다. 시료는 빛을 차단한 상태에서 지속적으로 교반하며 보관합니다.

각 용액에서 약 일주일 동안 처리하는 것을 권장합니다. 따라서 전체 처리 과정은 약 4~6주가 소요됩니다. 이를 서두르면 절편의 최종 품질이 저하될 수 있으므로 주의해야 합니다.

석회화된 뼈를 위해 사용할 수 있는 다양한 포매 옵션이 있습니다. 수지 또는 메타크릴레이트의 선택은 테스트 목적에 따라 달라집니다. 예를 들어, 모든 수지에서 면역조직화학 염색이 가능한 것은 아닙니다.

에폭시 수지는 경화를 위해 UV 광선이 필요하며, 이는 형광 색소 분석을 방해할 수 있습니다. 세심한 선택을 하기 전 제조사 사양서를 참조할 것을 권장합니다. 당사는 광학 현미경 관찰 및 형광 색소 분석을 위해 절단 및 연마 단면을 우수하게 생성할 수 있고 비용 효율적인 TEVI 7, 100을 사용합니다.

포매 시 중요한 고려 사항은 뼈의 밀도와 포매제의 밀도가 밀접하게 일치해야 한다는 것입니다. 이는 나중에 블록을 절단할 때, 특히 마이크로톰 절편 제작 시 매우 중요하므로, 제조사의 지침에 따라 혼합물을 준비하고 강하게 흔들어 섞어줍니다. 프로토콜을 최적화하기 위해 몇 개의 테스트 샘플을 미리 포매해 보는 것이 좋습니다.

파라핀과 달리, 이 단계는 가역적이지 않습니다. 블록의 절단면이 아래로 향하게 하여 몰드에 넣습니다. 지지력과 강도를 높이기 위해 몰드는 블록보다 더 큰 것을 사용합니다.

메타크릴레이트(methacrylate)가 뼈 내부로 최대한 침투할 수 있도록 메타크릴레이트 침투는 천천히 진행해야 합니다. 마찬가지로, 빛에 노출되는 것을 최소화해야 합니다. 침투 용액을 사용한 지 일주일 후에 침투 용액을 교체하고 경화 용액을 추가합니다.

그 다음 배킹 플레이트를 제작합니다. 이를 위해 tevit 30 40을 사용합니다. 이어서 몰드를 벗겨내면 블록이 준비됩니다.

마모 절편 제작을 통해 20에서 50 µm 두께의 더 큰 절편을 얻을 수 있습니다. 절편이 두꺼울수록 형광이 더 밝게 나타나므로 형광 분석에 유용합니다. 마모 절편을 제작하려면 마이크로톰이 필요하며, 다이아몬드 칼날을 사용하는 것이 좋습니다. 본 실험에서는 0.6 mm 곡선 다이아몬드 칼날을 사용합니다.

윤활제 사용이 필수적입니다. 실리콘 기반 윤활제도 효과적이지만, 석유 기반 윤활제 사용을 권장합니다. 그런 다음 블록을 클램프에 고정합니다.

이를 매크로 텀(macro term)에 고정하고 블록을 칼날 쪽으로 전진시킵니다. 첫 번째 절편은 절단면을 노출시키고 절편의 방향을 잡는 용도이므로, 폐기해야 합니다.

연마는 시간이 오래 걸리는 과정이므로 서두르지 않아야 합니다. 절편을 연마할 때 충분한 윤활이 이루어지도록 해야 합니다. 그 후 절편을 슬라이드 위에 올립니다.

필요에 따라 세척 및 연마를 수행할 수 있습니다. 절편이 말리는 경향이 있으므로, 지퍼백의 일부를 그 위에 덮고 다른 슬라이드로 고정하여 평평하게 유지하는 것을 권장합니다.

그 후 60~80°C의 인큐베이터에 1시간 동안 넣어둡니다. 이렇게 하면 메타크릴레이트가 연해져 절편이 슬라이드에 평평하게 부착되는 데 도움이 됩니다. 여기서는 한 달 간격으로 주입한 세 가지 서로 다른 형광색소의 합성 형광 이미지를 볼 수 있습니다.

이를 통해 특정 시점의 석회화 부위를 식별할 수 있습니다. 이러한 표지자의 용량과 준비 방법은 본문에서 확인할 수 있습니다. 마이크로텀(micro term)을 사용하면 광학 현미경 관찰에 가장 적합한 박절편을 얻을 수 있습니다.

이는 기술적으로 까다로운 과정입니다. 이러한 단단한 블록을 절단할 때 제공되는 추가적인 강도를 위해 슬레지 마이크로톰(sledge microtone)을 사용할 것을 권장합니다. 텅스텐 카바이드 칼날을 포함하여 다양한 칼날을 사용할 수 있습니다.

하지만, 스테인리스 스틸 칼날은 필요에 따라 쉽고 빈번하게 다시 연마할 수 있으므로 이를 추천합니다. 칼날은 블록과 45도 각도를 이루도록 배치해야 합니다. 메타크릴레이트 밀도는 실험실 내 주변 습도를 포함한 여러 요인의 영향을 받기 쉽습니다.

따라서 블록은 건조한 표면에 보관해야 합니다. 필요한 경우 블록에 젖은 종이를 덮어 연화시킬 수 있으며, 양질의 절편을 얻기 위한 적절한 절단 조건을 맞추기까지 여러 번의 절단 과정이 필요할 수 있습니다. 다시 한번, 절편을 인큐베이터에 넣기 전에 절편을 평평하게 만들기 위해 샌드위치 백과 추가 슬라이드를 사용하여 고정합니다.

염색 과정은 일반적인 파라핀 매몰 조직학적 검사와 유사하지만, 왁싱 과정이 필요하지 않다는 점이 분명하게 다릅니다. 뼈 조직에 흔히 사용되는 염색법으로는 사프란 대조 염색을 병행한 VSA, 사프란, ol light green, 그리고 mass on golden as trione이 있습니다. 이에 대한 프로토콜은 본문에서 언급됩니다.

시약은 사용 전 선택 및 여과 과정을 거칩니다. Golden 염색법은 조직 광학 측정(histo optometry)에 자주 사용됩니다. 먼저 테스트 슬라이드에서 염색 조건을 최적화하는 것을 권장합니다.

각 단계 후에 현미경으로 슬라이드를 관찰하여 색상이 올바르게 나타나는지 확인하십시오. 이를 통해 각 성분 염색에 필요한 정확한 시간을 설정할 수 있습니다. 염색 표준이 최적화되면, 염색 편차가 열 기하학 구조에 영향을 주는 것을 방지하기 위해 실험의 모든 슬라이드를 랙에 넣고 동일한 프로토콜에 따라 동시에 염색합니다.

그 다음 표준적인 방법으로 슬라이드 커버 글라스를 덮습니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.