Name: 에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 마우스 경구 기관 삽입법을 통해 기도 과민성과 염증 세포를 반복 측정하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 호흡 생리학 연구에 필수적입니다.

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우리는 fiberoptic orotracheal 삽관법을 수행할 수있는 제안 박사 W. Mintzer 감사합니다. 국립 보건원에서 보조금 U19AI070973, R01AI057696, K02HL75243 및 R01HL082487 지원.

알레르기 항원의 도전 : <ol><li> C57BL / 6 마​​우스, 연령 4~8주은 깊은 전신 마취를 달성하는 10 분 동안 산소 증기 혼합물의 3.2 % isoflurane과 정화의 플렉시 글라스 밀폐 챔버에 anesthetized 있습니다. </li><li> 비강 알레르기 항원의 어려움 (45μL OVA (22.5 μg)과 PBS의 7μL A. Oryzae (7 μg)가) 7 연패 응용 프로그램의 총, 목요일과 일요일, 매주 화요일, 관리하고 있습니다. </li></ol> 마취 : <ol start="3"><li> 이전 각 알레르기 항원의 도전, 그리고 7 도전에 따라, 마우스는 전에 빛을 제외 소켓에 배치하기 위해, 48 MG / kg etomidate (2 MG / ML)의 intraperitoneal 주사를 관리하고 있습니다. </li><li> 관찰할 신경 반응의 부족이 뒷다리 발톱 (5-10 분)을 압력의 신청에 따라 감지 때까지 제목이 소켓에 남아 있습니다. </li></ol> 삽관법 : <ol start="5"><li> ~ 37 ° C 바디 코어 온도, 저체온증을 방지하기 위해 절차를 통해 주제에 집중해야의 유지를 보장하기 위해 거리를 유지 복사열 램프. 직장 온도계 상관없이 사용되는 열원의 euthermia을 확인하는 초기에는 최소한 사용해야합니다. 임계 단계 실험 동물받은 모든 유체 기기는 멸균되어야, 절차가 엄격한 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 마취 동안 장시간 저체온증은 동물의 탈선 데이터 및 / 또는 사망으로 이어질 것입니다. 모든 침입 절차 능력은 살아있는 동물에서 작업을하기 전에 시체 같은 동물을 사용하여 개발해야합니다. 안과 윤활유는 전신 마취하에 동물의 각막 찰과상을 방지하기 위해 사용해야합니다. </li><li> Anesthetized 마우스를 소켓에서 제거하고 plethysmograph 테이블에 가로 누운 위치 (복부 측면까지)에 배치되며, 45 ° 각도로 조정. </li><li> 테이블을 encircling 고무 밴드가 너무 장소로 피사체를 확보 incisors의 맨 윗줄 뒤에 삽입됩니다. 오른손에 핀셋으로, 손잡이는, 확장, 그리고 왼손에 억압자 금속과 장소에 그것을 확보하기 전에 입안에서 혀를 리프트, 따라서 삽관법에 대한 unimpeded기도를 수 있도록합니다. </li><li> 광원에 연결된 0.8 mm 직경의 fiberoptic 스레드는, angiocatheter을 통해 삽입 팁 넘어 10mm를 연장됩니다. 억압자가 왼손으로 steadied이기 때문에 보컬 화음이 시각까지, fiberoptic 스레드의 조명 끝을 오른손으로 구강 및 인두 거치게됩니다. 스레드가 다음 이동 성대 통하여 기관에 직접 시각화에 따라 전달, 코드가 maximally 열 때 발생하는 시간이 초과되었습니다. </li><li> 카테 테르 팁이 기관의 중간 부분 내에 자리잡고 때까지 angiocatheter은 다음 기관에 fiberoptic 스레드를 통해 전달됩니다. 17-22g 마우스의 경우, 이것은 커넥터와 피사체의 아래턱의 두개골 극단 사이에 보이는 남아있는 10mm의 카테 테르 세그먼트에 해당합니다. 카테터를 전달하는 실제 금액은 해당 크기와 유전 배경로부터 2-3 catheterized 생쥐의기도의 직접 검사에 의해 결정되어야합니다. </li><li> 바로 엄지와 커넥터의 다음과 같은 폐색을 해지할 일반 심호흡 (흉부와 복부의 리듬 여행)을 관찰하여 fiberoptic 스레드가 제거되고 성공 삽관법이 확인됩니다. 숨이 응답에 관계없이 엄지 손가락 폐색, 불규칙 호흡, 또는 어려움 호흡의 다른 흔적 malpositioning 주로 식도 삽관법를 나타내는 angiocatheter 나타내는 있습니다. 빠르게 식도 삽관법을 반대로 임계 단계 실패 치명 수 있습니다. 식도 삽관법이 의심되면, 카테터가 신속하게 제거되어야하며 동물이 정상적인 호흡 패턴을 재개되면 다시 삽입. Etomidate 가능한 모든 쥐 anesthetics의로 선택의 마취,이 에이전트는 최소한 심장 독성 (저혈압, 부정맥, 심장 마비) 전달. </li><li> 낮은 plethysmograph 테이블 작업 벤치와 공기 환풍기 포트를 직면하기 전까지 주제 180 ° 회전과 평행까지. 환풍기에 연결하기 전에 측면에 동물을 켭니다. </li><li> 빵빵한 연결을 확보하고 호흡기 (150 호흡 / 분, 9 ML / G 갯벌 볼륨, 100 % 산소로 작동) 활성화 후 thoracoabdominal 여행은 환풍기와 속도로 볼 때, 성공 삽관법가 추가로 확인됩니다. </li></ol> 정맥 라인 : <ol start="13"><li> 베벨의 각도로 얼굴을 너무 10mm는 27ga 주사 바늘은 무료로 녹고있어, 그리고 살균 포셉 및 hemostat를 사용하여 미드에서 바늘을 90 ° 굴곡의 방법으로 자사의 주사기 - 커넥터에서 제거됩니다. 비 - beveled 끝을 IV 주입 포트에 이어지는 PE10 튜브에 연결되어 있습니다. </li><li> 잠재적으로 방지하기 위해치명적인 공기 embolization, 튜브와 바늘은 37로 정화 아르 ° C, 1 ML의 주사기를 통해 NaCl 0.9 %. 사출 포트는 15ml 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 구멍을 뚫고 끝까지 해냈고 27ga 바늘로 이루어져 있습니다. 뚜껑 그러므로 공기가 주사 바늘에 개입하고 정맥 주입된다는 가능성을 감소, 바늘의 끝 부분이 지속적으로 변할 것을 호수 등으로 가득합니다. </li><li> 가열 램프 아래에 남아있는 마우스로, 주사 바늘로 꼬리 병렬의 꼬리 극단에서와 측면 정맥을 통해 정렬됩니다. 정맥의 길이를 따라 cranially 감독과 구부 subcutaneously 강요하면서 바늘이 피부 밑에 약간 실행됩니다. 성공 IV 배치는 주사기의 플런저를 약간 당기와 IV의 튜브에 혈액 역류를 관찰하여 확인됩니다. 또한 꼬리 정맥에 50-100 μl 호수의 주입시 IV 라인을 통해 흐름을가 unimpeded해야합니다. 가끔 꼬리 정맥은 안정 cannulated 수 없습니다. 이러한 경우에, 마우스는 다른 측면과 IV 일반적으로 어려움없이 접근할 다른 꼬리로 180도 회전 수 있습니다. </li><li> 설치에서 가열 램프를 제거 후, ​​주제는 이후 4 클램프의 응용 프로그램과 빵빵한으로 보안, plethysmograph에 포함되어 있습니다. 가열 램프가 남아 허용 임계 단계는 plethysmograph 챔버에서 공기를 가열하고 잠재적으로 유지되어야 IV의 바늘과 솔루션의 R RS의 불임증의 후속 측정을 변경합니다. 바늘의 살균은 immersing과 rinsing 사전 IV 삽입하기 위해 멸균 생리 식염수와 플러싱 다음 70 % 에탄올로 플러싱에 의해 수행됩니다. 또한, 꼬리는 70 %의 에탄올 혹은 IV 삽입하기 전에 이소 프로필 알코올로 세척해야합니다. </li></ol> 기도 저항 측정 : <ol start="17"><li> 피크 저항이 지수의 지속적인 quantitation에 의해 결정됩니다 DPt / V (어디 DPt는 tracheal 압력의 변화이며, V는 공기 흐름)을 동등 폐 볼륨의 포인트 (70 % 조수 볼륨)에서. DPt은 tracheal angiocatheter에 연결된 압력 변환기를 사용하여 결정됩니다. V를 확인하려면 plethysmograph 압력 변화는 공부 physiologic 범위 이상의 볼륨의 변화에​​ 조정됩니다. 로 preamp 모듈에 의해 계산된 시간이 지남에 따라 plethysmograph 볼륨의 차이는 안정적인 기준을 맺은 후 V.입니다 R RS (삼분 이상 &lt;5 % 편차), 증가 다섯 연속 복용 (부피 = 2 G / μl 체중) 아세틸콜린 염화 (0.058, 0.18, 0.59, 1.58 및 5.8 MG / 체중 kg, 산도 7.4에서 0.9 %의 식염수에 얼음 전에 각각의 주입을 손으로 따뜻하게에서 유지)의 농도는 IV를 통해 일초 이상 주사 (약 12cm H 2 O X ML -1 X 초, 즉, 약 4cm의 일반적인 기준 이상의기도 저항에 200 % 증가 기준 저항의 tripling까지 기본으로 R RS의 반환에 따라 실시 이후의 각 복용량과 함께 H 2 O X ML -1 X 초)이 이루어진다. 기본 값 (PC 200 칭했다)에서 R RS에 200 % 증가의 원인이 체중의 MG / G,에 이크의 도발적인 농도는 이크 - R RS 선량 - 반응 곡선의 수학적 보간으로 계산됩니다. </li><li> 일단 PC 200 값, 릴리스 체결에 도달하고 plethysmograph을 해체되었습니다. 이크 5 증가 복용의 최대 주어집니다. 위에서 언급 한대로 이크 농도 범위는 대부분의 순진 마우스 종자에 대한 PC 200 값을 달성에 적합합니다. 약 4cm H 2 O X ML -1 X 초의 기준이 30 초 동안 저항 모니터에 설립 임계 단계는 정상적인 생리의 60 μL은 IV가 마취의 적절한 비행기가 달성되었는지 확인하기 위해 주입 수 있습니다. 완료 마취와 저항에 큰 변화가 없을 것입니다, 손발이나 꼬리의 저항이나 운동의 증가는 신체적 고통의 기호를 나타내는 추가 마취의 필요성을 나타냅니다. </li><li> 꼬리 정맥에서 IV를 제거하고 다음 장소에서 tracheal 정맥을 유지하여 특허기도를 유지, 인공 호흡 상태에서 동물을 분리합니다. 수시 동물 즉시 자발적인 호흡을 다시 시작하지. 이러한 경우에, 호흡은 부드럽게 마사지하여 근육을 격려 수 있습니다. 임계 단계 자연 호흡은 복구 챔버로 전송하기 전에 설정해야하고, 그렇지 않으면 죽음은 발생합니다. </li><li> 자발 호흡 재개되면, 생쥐는 37 100 % O 2 및 유지 관리와 정화 실내로 장소에서 tracheal 캐뉼러로 전송됩니다 ° C 가열 램프를 사용합니다. 15-20 분 이내에 쥐가 강력하게 호흡하고 tracheal 카테터를 제거하고 동물의 수있는 시점에서, 그들의 사지를 이동하기 시작afely 그들의 일반적인 버팀대로 전학 왔어. 임계 단계는기도는 쉽게 아세틸콜린 유발 하이퍼 타액의 분비로 인해 무의식적인 마우스의 방해와기도 physiologic 측정 다음 anesthetized 마우스에 질식 관련 사망의 주요 이유입니다. 이런 이유로 들어, tracheal 정맥 그들은 arousable하고 하이퍼 salivaton가 정지 때까지 제거하지 않아야 때까지, 심지어 bronchoalveolar 세척을 진행하지 마우스에 위치에 있어야합니다. </li></ol> Bronchoalveolar 세척 : <ol start="21"><li> 마우스가 충분히 자신의 개그 반사를 (복구 챔버에 배치 후 ~ 20 분) 복구할 때 bronchoalveolar 세척 유체의 수집은 안전합니다. 구역질 반사가 부드럽게 angiocatheter가 안쪽과 바깥쪽으로 슬라이딩에 의해 평가되며 분명 기침이나 고민은 구역질 반사가 반환했음을 나타냅니다. 허용 임계 단계도 복구 시간을 연장하는 것은 크게 개인 생쥐에서 BAL 반환의 효율성을 감소 것이며 따라서 구역질 반사가 제안하는 20 분 휴식 기간에 따라 몇 분 간격을 모니터해야합니다. 쥐가 부분 각성에 의한 세척 절차를 참을 수 없다면, 3.2 % isoflurane 증기 마취를 사용할 수 있습니다. </li><li> ~ 30 ° 폐의 왼쪽 엽으로 이동의 연속 벤드와 금속 삽관법 가이드 와이어 (0.5mm OD)는, angiocatheter에 삽입됩니다. 가이드 와이어와 angiocatheter은 카테 테르가 (허브 제외) 단 1mm에 의해 앞니 초과 등 즉, 폐의 왼쪽 엽에 함께 고급 있습니다. 동물 죽음의 가능성을 높이는 동시에 왼쪽 폐를 분리에 중요한 단계 실패 크게, 이윤율을 줄일 수 있습니다. 케어는 가이드 와이어의 끝은 angiocatheter의 열린 끝을 통과하지 않도록하기 위해 이동해야합니다. 튀어나온 금속 팁과 angiocathether을 발전하면 tracheal 열상 및 tracheal 파열로 인한 죽음을 초래할 수 있습니다. </li><li> 장소에 angiocatheter을 유지, guidewire를 제거하고 PBS 300 μL입니다 (산도 7.4, 멸균) 1 ML의 주사기를 통해 왼쪽 폐에 플러시됩니다. 즉시 부정적인 압력을 만들 수있는 주사기의 플런저를 그리는 동안 angiocatheter가 강렬한 폐를 마사지하는 동안 제거 (3 S) 천천히, 이후. 100-200 μL의 BAL 반환이 예상된다. </li><li> 바로 37 ° C, 100 % O 2 챔버 계속 흉부을 마사지하면서시오. lavaged 마우스를 반환 자신의 왼쪽에 플레이스 마우스 완전히 (~ 20 분)까지 회복. 동물은 그들의 새장에 다시 배치됩니다. </li></ol> 타이밍 : 마우스에 따르면, 전체 절차는 수행 1 시간보다 더 오래 걸릴해서는 안 : 3-4, 50-10 분 단계, 단계 5-21, 10 분, 스텝 22, 20-30 분, 23-24 단계,... 10 분. 증가 실력과 프로토콜에 엄청난 과목으로, 최고 3 마우스 / 시간을 처리할 수 있습니다. 대표 결과 : 로 PC 200의 가치 측정에 의해 결정 생쥐의기도 기능 항 진성은, 시토킨 IL - 135-7의 T 세포와 분비의 폐에 활성화 및 채용의 결과입니다. 따라서기도 기능 항 진성은 알레르기 항원과기도 도전의 피할 수없는 결과 아니라, 오히려 손상 T 세포 면역 구획 반복 알레르기 항원 노출의 설정에 개발하기 위해 T 세포 응답에 필요한 시간에 따라 달라집니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 2A,기도 기능 항 진성은 크게 여섯 번째 도전 후 넘어올 크게 증가 5 알레르기 항원의 도전 이후 개발 기본 가치에 비해 낮은 PC 200 값으로 정의. 완전히 이해되지 않은 이유기도 반응은 첫 번째 알레르기 항원의 도전 (그림 2A) 이후 (PC 200 값이 증가) 감소. 비슷한 경향은 같은 생쥐 (그림 2B)에 대한 이크 선량 반응 곡선을 비교하여 확실하고 있습니다. 그러나, 전체기도 기능 항 진성이 갑자기 다섯 번째 알레르기 항원의 도전 이후 개발되는 여기 분명이며, 그러한 것을 마우스는 30 배 이상이 될 네 번째, 6 과제 사이 이크 더 민감. 함께, 이러한 연구 결과는 AHR의 가장 신뢰할 수있는 측정 6 알레르기 항원의 어려움 (12 일) 이후에 얻은 것을 나타냅니다; 이전 timepoints의 측정은 대단히 변수 데이터를 얻을 가능성이있다. 반복 차량 intranasally (호수)와 도전을 마우스기도 기능 항 진성을 개발하지 않으며, 주어진 이크의 복용에서 R RS 측정 크게 (그림 3 표시되지 데이터) 기본 값에서 다양하지 않습니다. 이전 강력한 AHR의 출현으로, 알레르기 항원에 의해 유도기도의 지배적인 세포 유형은 호중구 (그림 4)되었습니다. AHR에 대한 추세와 마찬가지로 그러나, eosinophilia 점차 반복 알레르기 항원의 도전과 eosinophil가 BAL 유체 AF의 숫자 지배적인 세포 유형되었습니다 강화neutrophis 번호에 표시된 감소 (그림 4)와 일치 터 여섯 번째 도전. Macrophages 처음 처음 몇 알레르기 항원 과제 번호가 증가하고 이후 풍부하게 오르 내렸는지를 보여준다. 림프구 풍부 크게 관계없이 알레르기 항원의 도전의 수를 변경하고, 역설 모델들의 기본 중요성을 감안할 때, 일반적으로 BAL 유체에서 가장 많은 세포 수 없습니다 않았다. 알레르기 항원의 도전이나 BAL 샘플링도 수신을 마우스에서기도 저항 측정 실험 17 일 동안 다양하지 않았다. 기도 생리 측정이나 알레르기 항원의 도전의 부재에서 반복 BAL 유체 샘플링도 수행하고, 오일 (데이터가 표시되지 않음) 이상 유지되지 않은기도에만 향상된 호중구 및 대식 세포 모집을 보여주했다. 이러한 연구 결과는 알레르기 항원 도전 생쥐에서 관찰 유수 neutrophilia가 크게 절차 아니라 항원의 결과임을 보여줍니다. 컨트롤에, PBS는 - 도전 쥐를,기도 저항 측정은 시간이 지남에 따라 상당히 다를하지 않았다. 향상된 대식 세포 및 호중구 아니지만 BAL 유체에 eosinophil, 채용도서만 반복 BAL 유체 샘플링 (그림 4 B, D)를받는 생쥐에서 관찰 이러한 변화와 유사한 이러한 마우스에 보였다. 함께, 이러한 데이터는 알레르기 (호산)기도 염증과 AHR 모두의 유도로,기도의 다른 조작을 알레르기 항원의 중요성을 강조하고,하지 않습니다. 비슷한 결과는 우리가 여기에 사용한 proteinase 유사 비강 알레르기를 사용하여 기대하실 수 있습니다. 그러나 많은 조사는 알레르기가 폐 질환을 유발하는 ovalbumin을 사용합니다. ovalbumin과 intradermal 또는 intraperitoneal 마중물 (1~2주)의 적절한 기간이기도 기능 항 진성 포함한 알루미늄 소금, 강력한 천식 표현형에 시켰던 후 녹는 ovalbumin과 함께 하나의 비강 도전 후 24 시간 이내 기대하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 쥐 plethysmograph의 사진 표현,기도 생리학 측정 녹음 즉시 사전. <img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 에어웨이 저항 측정. A) 통계 목적, antilog PC 200 값은보고됩니다. 추가로 다음과 같은 도전에 첫 도전 이후 감소 후 antilog의 PC 200의 큰 증가합니다. B) 호흡기 시스템 저항 (RRS)는 : 여섯째 그리고 일곱 번째 도전 후 이크 - RRS 선량 - 반응 곡선의기구를합니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 대표 실시간 호흡기 저항 (R RS) 이크의 연속 IV 투입을 수신 마우스를 도전 순진한 (A) 및 배의 알레르기 항원 (B)에서 tracings. 선량 값은 MG / kg 단위로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 7 연속 비강 도전 대우 마우스의 왼쪽 폐에서 파생 bronchoalveolar 세척 샘플에서 차동 면역 세포 계산됩니다. 알레르기 항원 (A) 또는 PBS (B)로 치료 생쥐의 면역 세포의 비율 (%) 풍부한. 알레르기 항원 (C) 또는 PBS (D)로 치료 생쥐에서 면역 세포의 총 수입니다. SEM - 값 + / 의미로 표현.

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천식의 연구 및 기타 다양한기도 폐쇄 질환은 생명 의학 연구의 활성화 및 확장 필드를 구성합니다. 천식 관련 실험 연구의 중요한 요소는 다양한 조건 하에서기도 크기의 변화를 측정하는 능력이다. 도발적인 도전, 천식과 관련된 폐 질환의 정식 기능과기도 칭했다기도 hyperresponsiveness의 속성에 대한 응답으로 과도한기도 축소는, 호흡과 죽음 등 다른 증상의 곤란에 이르는 임상 상당한 공격의 주요 구성 요소입니다. 본 연구에서는 소설 방법은기도 hyperresponsiveness을 측정하기 위해 개발된 동시에 마우스의기도에 염증 세포를 모집 샘플했다. 우리는기도 hyperresponsiveness 즉시 첫 번째, 혹은 15 일 동안 주어진 과제 7 연패 알레르기 항원의 처음 몇 이후로 유도 아니라는 것을 보여줍니다. 오히려기도 hyperresponsiveness 겨우 6 과제 (12 일) 후 (위장 알레르기 항원 도전 동물에 비해) 매우 중요한지고, 진보적인 알레르기...

에어웨이 생리 측정 소프트웨어 (Rescomp)은 사용자 준비 (; 415-519-4371 밀레니엄 프리미어 그룹)되었습니다. 데이터는 펜티엄 III CPU (인텔, 주식 산타 클라라, CA)와 디지털 신호 변환기 17 핀 아날로그 (내쇼날 인 스트 루먼트, # PC - LPM16)가 장착된 Windows XP를 실행하는 PC 워크 스테이션을 사용하여 분석했다. Buxco 주식 윌밍턴, 노스캐롤라이나에서, 작은 동물기도 생리학 워크 스테이션은 사용자 정의 상용 압력 트랜스 듀서 (부분 # TRD5700 및 TRD4510), preamp 모듈 (부품 # MAX2270), 섀시 (부품 # MAX1320을 사용하여 (밀레니엄 프리미어 그룹) 조립했습니다 ) 및 맞춤 작은 동물 plethysmograph. 광원에 연결된 0.5mm 외경 광섬유 스레드 (콜 파머 조명기, 41722 시리즈) 환풍기 (하버드 마우스 장치 환풍기, # 687) 10mm, 27ga 바늘 (BD Biosciences, 고양이. 안돼. 309602) 가열 램프 1 ML 주사기 (BD Biosciences, 고양이. 안돼. 305109) 4 클램프 (포니 3200 스프링 클램프) 삽관법 가이드 0.5 mm 외부 와이어 Hemacytometer Superfrost / 플러스 현미경 슬라이드 (피셔 고양이. 아니. 12-550-15) 쉔던 필터 카드 (써모 고양이. 아니. 5,991,022) 차동 세포 슬라이드 얼룩 (피셔 고양이. 아니. 122911) 라이트 현미경 (Leica) Cytospin 3 (쉔던) 20가, 1.25 인치 ProtectIV 정맥 카테터 (스미스 의료) 0.5 mm 폴리머 광학 섬유 (에드먼드 광학 # NT02 - 532).

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

기도 기능 항 진성 (AHR) 측정과 bronchoalveolar 세척 (BAL) 유체 샘플링 실험 천식 모델에 필수적인,하지만 같은 동물에서 같은 측정을 얻기 위해 반복 절차는 일반적으로 가능하지 않습니다. 여기, 우리는 생쥐에서 AHR 및 bronchoalveolar 세척 유체 샘플 반복 측정을 얻기위한 프로토콜을 보여줍니다. 생쥐는 치료 효능이 알레르기 항원이나 사기와 십사일 동안 intranasally 일곱 번 도전했다. 초기 도전하기 전에, 각 비강 도전 다음과 같은 24 시간 이내에 같은 동물 구두 intubated와 기계 환기, anesthetized했다. 가짜와 알레르기 항원 - 도전 동물 사이의 아세틸콜린 (이크) 염화의 정맥 복용량을 늘려 유도 호흡기 시스템 저항 (RRS)의 선량 반응 곡선을 비교하여 평가 AHR은, 결정됩니다. 기도 세포의 차동 열거를 수행 될 수 있도록 그 후 같은 삽관법를 통해, 왼쪽 폐을 lavaged되었습니다. 이러한 연구는 AHR 및 BAL 유체 컬렉션의 반복 측정이 같은 동물에서 가능한 것을 공개하고 최대한의기도 hyperresponsiveness과기도 eosinophilia는 알레르기 항원의 도전을 시작의 70~10일 이내에 달성됩니다. 이 소설의 기술은 크게 세로 실험에 필요한 생쥐의 수를 줄이고 다양한 설치류 종, 질병 모델과기도 생리학 장비에 적용됩니다.

쥐 호흡 생리학과기도 염증 세포의 샘플링의 반복 측정이 바람직하지만, 일반적으로 가능하지 않습니다. 여기 구두기도 염증 세포의기도 기능 항 진성과 샘플링의 반복 측정을 허용 쥐를 intubating에 대한 반복 방법을 설명합니다.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

기도 과민성(Airway hyperreactivity, AHR) 측정과 기관지-폐포 세척(bronchoalveolar lavage, BAL)액 샘플링은 실험적 천식 모델에서 필수적이지만, 반복적인...

본 절차를 시작하기 전에, 복강 내로 투여한 토마테(tomate)로 마우스를 마취합니다. 그 다음 동물들을 테이블 위에 놓은 후, 20게이지 카테터를 입을 통해 기관 내로 삽입합니다. 기관 삽관된 마우스를 기계식 인공호흡기에 연결하고, 꼬리 정맥에 정맥 라인을 설치합니다.그 후 마우스를 두 개의 압력 변환기가 연결된 설치류용 SIGGRAPH 내에 넣습니다. 전자 장치를 통해 아세틸콜린 유발 시험 동안 호흡기계 저항을 지속적으로 측정할 수 있습니다. 인공호흡기와 정맥 라인을 분리한 후, 기관 카테터를 왼쪽 폐로 삽입하여 식염수를 주입하고 다시 카테터를 통해 회수함으로써 폐 세척을 수행합니다.안녕하세요, 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine) 내과 전문의 시몬 파(Simone Phar)입니다. 오늘은 기도 역학 및 기관지 폐포 세척액을 반복적으로 수집할 수 있도록 하는 마우스의 구강 삽관 방법을 보여드리겠습니다. 저희는 천식의 실험 모델인 실험적 알레르기성 질환을 연구하기 위해 이 절차를 사용하며, 이 방법은 다른 응용 분야에도 적용될 수 있습니다.이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 마우스에 ketamine 48 mg/kg을 복강 내 주사하여 깊게 마취합니다. 그런 다음, 마우스가 안정을 유지할 수 있도록 부드러운 조명 타입의 박스에 넣습니다.천으로 덮인 깨끗한 마우스 케이지를 이 용도로 사용할 수 있습니다. 5~10분 후 발가락 압착 검사를 통해 동물이 완전히 마취되었음을 확인한 다음, 45도 각도로 조절된 작은 테이블 위에 복측이 위로 향하도록 눕힙니다. 피험자를 고정하기 위해, 테이블 뒤쪽 상악 치아열 뒤로 고무줄 ENC를 둘러 끼웁니다.오른손으로 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 가열 램프를 사용하십시오. 핀셋을 사용하여 혀를 잡고 입 밖으로 당겨 들어 올립니다. 그런 다음 왼손에 쥔 금속 설압자를 부드럽게 삽입하십시오.이렇게 하면 기도가 확보되어 기관 삽관을 위한 성대 시각화가 가능해집니다. 다음으로, 광원에 연결된 직경 0.8 mm의 광섬유 스레드를 혈관 카테터를 통해 삽입하고 팁 너머로 10 mm까지 확장합니다. 왼손으로 설압자를 누르는 동안, 오른손으로 광섬유 스레드의 조명 끝부분을 구강과 인두를 통해 성대가 보일 때까지 안내하여 삽입합니다.그 다음, 직접 시각화하며 성대가 최대한 열리는 타이밍에 맞춰 광섬유 실을 움직이는 성대를 통과시켜 기관 내로 삽입합니다. 이제 안지오 카테터를 광섬유 실을 따라 기관 내로 삽입하여 카테터 팁이 기관의 중간 부분에 위치하도록 합니다. 17~22g 무게의 마우스의 경우, 이는 카테터의 10mm 세그먼트가 입 바깥에 남아 있는 상태에 해당합니다.성공적인 기관 삽관을 확인하기 위해 광섬유 스레드를 제거하십시오. 커넥터를 엄지손가락으로 폐쇄했을 때 즉시 중단되는 규칙적인 심호흡을 관찰하십시오. 플레티스모그래프 테이블을 작업대와 평행이 될 때까지 낮춘 다음, 피험자를 공기 환기 포트를 향하도록 180도 회전시키십시오.인공호흡기에 연결하기 전 동물을 옆으로 눕힙니다. 기밀 연결을 확보한 후 인공호흡기를 가동합니다. 이후 복부의 움직임이 인공호흡기의 리듬과 일치하는 것을 확인하여 삽관이 성공적으로 이루어졌음을 최종적으로 확인합니다.정맥 라인용 바늘을 준비하려면, 10 millimeter 27 gauge 바늘을 시린지 커넥터에서 분리한 후, 베벨(bevel)이 굴곡진 안쪽을 향하도록 중간 지점에서 90도로 구부립니다. 베벨이 없는 쪽 끝을 IV 주입구로 이어지는 PE 10 튜브에 연결합니다. 이는 치명적일 수 있는 공기 색전증을 방지하기 위함입니다.1 mL 주사기를 사용하여 37 °C 0.9% 염화나트륨으로 튜브와 바늘 내부의 공기를 제거합니다. 주입구는 15 mL 원심분리 튜브 캡에 뚫린 구멍을 통해 삽입된 27게이지 바늘로 구성됩니다. 캡은 바늘 끝이 항상 잠겨 있도록 식염수로 채워져 있으며, 이를 통해 바늘 내에 공기가 유입되어 정맥으로 주입될 가능성을 줄입니다.바늘을 꼬리 끝부분에 맞춥니다. 외측 정맥과 평행하게 그 위에 위치시킵니다. 바늘을 안내하면서 피부 바로 아래로 약간 밀어 넣습니다.정맥의 길이를 따라 두측으로 이동하며 피하 조직을 통해 굴곡부까지 밀어 넣습니다. IV 배치가 성공적으로 이루어졌는지 확인하려면 시린지 플런저를 약간 당깁니다. 이때 IV 튜브로 혈액이 역류하는 것을 확인할 수 있어야 합니다.또한, 꼬리 정맥에 50 to 100 µL의 식염수를 주입했을 때 IV 라인을 통해 흐름이 원활해야 합니다. 설정에서 가열 램프를 제거한 후, 피험체를 plasmo graph에 넣고 4개의 클램프를 사용하여 밀폐시킵니다. 가열 램프를 제거하는 것은 plasmo graph 챔버 내부의 공기가 가열되어 이후의 호흡기 저항(respiratory system resistance) 또는 RRS 측정값에 영향을 주는 것을 방지하기 위해 중요합니다. 호흡기 저항 또는 RRS는 몫의 연속적인 정량화를 통해 결정됩니다.동일한 폐 용적 지점에서 공기 흐름에 따른 기도 압력의 변화 또는 delta P over V를 측정합니다. Delta P는 기관 안지오 카테터 V에 연결된 압력 변환기를 사용하여 결정합니다. 시간에 따른 혈장 이식 용적의 미분값은 프리앰프 모듈에 의해 계산됩니다. 안정적인 기선(baseline)을 설정한 후, RRS는 iv를 통해 1초 동안 농도가 점차 증가하는 다섯 차례의 아세틸콜린 클로라이드(acetylcholine chloride) 또는 a CH 용량을 연속적으로 주입합니다.기도 저항이 200% 증가할 때까지 RRS가 기저치로 돌아올 때마다 후속 용량을 투여합니다. 꼬리 정맥에서 IV 카테터를 제거하고 마우스를 인공호흡기에서 분리합니다. 기관 캐뉼라를 그대로 두어 기도를 개방 상태로 유지하면서, 마우스가 자가 호흡을 재개했는지 확인합니다.그렇지 않은 경우, 흉부를 부드럽게 마사지하여 호흡을 촉진할 수 있습니다. 마우스가 자발 호흡을 재개하면, 기관 캐뉼라를 삽입한 상태로 100% oxygen으로 퍼지되고 가열 램프로 37 degrees Celsius가 유지되는 챔버로 이동시킵니다. 아세틸콜린으로 인한 과다 타액 분비로 인한 질식사를 방지하기 위해 동물이 깰 때까지 기관 캐뉼라를 계속 삽입해 두어야 합니다.기관지폐포 세척 또는 BAL 액은 마우스의 구역 반사가 충분히 회복되었을 때만 수집할 수 있으며, 이는 회복 챔버로 옮긴 후 약 20분 후에 나타납니다. 구역 반사를 평가하려면 혈관 카테터를 조심스럽게 안팎으로 밀어 넣으십시오. 뚜렷한 기침이나 몸부림은 구역 반사가 돌아왔음을 나타내며, 이때 BAL 액을 수집합니다. 폐의 좌엽을 향해 약 30도로 계속 굽어 있는 금속 삽관 가이드 와이어를 혈관 카테터에 삽입합니다.G 와이어와 혈관 조영 카테터를 함께 폐의 좌엽으로 전진시켜, 카테터 허브 제외 부분이 앞니 너머로 1 mm만 더 나가도록 합니다. G 와이어의 팁이 혈관 조영 카테터의 개방된 끝단을 통과하지 않도록 주의하십시오. 혈관 조영 카테터를 제자리에 유지하면서 기관의 열상이나 파열을 방지하기 위해, 1 mL 주사기를 사용하여 좌폐에 300 µL의 멸균 PBS pH 7.4를 즉시 주입한 후 주사기 플런저를 다시 당겨 흡입하십시오.음압을 형성하기 위해 폐를 강하게 마사지하면서 안지오 카테터(angio catheter)를 천천히 제거합니다. 100에서 200 µL의 BAL 회수량이 예상됩니다. 세척을 마친 마우스를 즉시 37 °C, 100% 산소 챔버로 옮깁니다.동물이 약 20분 후 완전히 회복될 때까지 왼쪽으로 눕혀 둔 다음 케이지로 다시 옮깁니다. 여기에서는 기도 저항 측정의 대표적인 결과를 제시하며, 기도 과민반응은 4회차 투여 시 5번의 알레르겐 자극 후 모든 아세틸콜린 용량에서 대조군 값보다 유의하게 높은 RRS 값으로 정의하였습니다. 그러나 6회차 자극 후에는 반응성의 추가적인 증가 없이 훨씬 더 큰 기도 과민반응이 관찰되었습니다.일곱 번째 챌린지에서, RRS 값이 기저치보다 3배 증가한 시점에 CH 투여를 중단했는데, 이는 투여량을 더 늘릴 경우 치명적인 기관지 경련이 발생할 수 있기 때문입니다. 차량(vehicle)을 비강 내로 반복 투여한 마우스는 기도 과민반응이 발생하지 않았으며, CH를 모든 용량으로 투여한 경우에도 RRS 측정값이 기저치와 유의미한 차이를 보이지 않았습니다. 이는 강한 AHR이 나타나기 전 연속적으로 CH를 IV 투여한 나이브 마우스와 6회 알레르겐 챌린지를 받은 마우스의 대표적인 실시간 RRS 트레이싱 결과에서 확인할 수 있습니다. 알레르겐에 의해 유도된 기도의 주요 세포 유형은 AHR의 경향과 유사하게 호중구였습니다. 그러나 알레르겐 챌린지가 반복됨에 따라 호산구 증가증이 점차 강화되었으며, 호산구가 BAL 액 내에서 수적으로 우세한 세포 유형이 되었습니다. 이는 호중구 수가 급격히 감소한 여섯 번째 챌린지 이후에 나타났습니다.PBS를 처리한 대조군 마우스에서 기도 저항 측정값 또한 시간 경과에 따라 유의미한 변화를 보이지 않았습니다. 또한, 반복적인 BAL 액 샘플링만을 수행한 마우스에서 관찰된 변화와 유사하게, 이들 마우스의 BAL 액에서도 호산구가 아닌 대식세포와 중성구의 모집이 증가한 것이 확인되었습니다.지금까지 마우스의 구강 내 가역적 삽관 방법과 기도 생리학 데이터 및 기관지폐포 세척액을 수집하기 위한 정맥관 접근법을 살펴보았습니다. 살아있는 동물에게 이 기술들을 적용하기 전에, 사체(cadaver)를 이용하여 각 기술을 개별적으로 연습하고 숙달하는 것이 필수적입니다.엄격하고 세심한 취급이 필수적이며, 항상 엄격한 무균 조작법을 준수해야 합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

알레르기 천식의 실험 마우스 모델은 질병 pathogenesis를 공부하고 새로운 치료제 개발에 새로운 가능성을 제공합니다. 이러한 모델은 잘 알레르기 면역 반응,기도 염증과 폐의 pathophysiology을 규제하는 측정 요소에 적합합니다.

알레르기 항원 유도 천식의 Murine 모델

우리는 낮은 압력 흡입을 이용하여 광섬유 기관지 내시경과 기관지 폐포 세척액에 대한 연구 방법을 설명합니다. 기법은 폐 기관지 표면에서 면역 세포를 수확하기 위해 사용된다. 국소 마취제와 가벼운 수면 마취 (미다 졸람)이 사용된다. 주제는 프로 시저 잘 경험 최소한의 부작용을 견딜.

연구를위한 기관지 폐포 세척액 (BAL), 적절한 샘플 수익률을 얻기

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 기관지폐포 세척액에서 다양한 면역 세포를 식별하고 계수하는 방법을 보여줍니다. 초기에는 생존 염료를 사용하여 단일 면역 세포를 식별한 다음 표면 마커 단백질을 차등 염색하여 각 세포 유형을 정확하게 계수할 수 있습니다.

유세포 분석에 의한 Bronchoalveolar Lavage Fluid에서 면역 세포의 식별 및 계수

SCIREQ Inc의 몬트리올, 품질 관리, 현재의 프로토콜은 호흡 역학의 측정​​뿐만 아니라 강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 흡입 메타 콜린에 대한기도 응답의 평가 (flexiVent을 실행하는 데 필요한 절차에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다 , 캐나다).

강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 호흡기 시스템 역학의 평가

본 논문은 폐 기능 측정 또는 쥐가 복구 나중에 시간에 공부를 할 수 있습니다 폐 기지에 대한 쥐를 intubating의 striaghforward하고 효율적인 방법을 설명합니다. 절차는 직접 기관을 비춰 저렴한 fiberoptic 광원을 포함한다.

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

X선 영상 기술을 사용하여 신생아 마우스 폐의 폐포액 제거 또는 폐부종의 속도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

신생아 마우스 폐에서 폐 유체 볼륨의 실시간 X 선 영상

이 논문의 목적은 크게 폐암 또는 다른 병리와 설정 및 마우스 폐의 분석에 도움이 될 간단한 방법을 설명하는 것입니다. 우리는 간단하고 확실하게 폐 instillations, 정착, 폐 용적 측정을 수행하는데 3 프로토콜을 제시한다.

마우스 폐 암 연구에 유용한 점안 및 고정 방법

폐의 건강 상태는 폐의 세기관지에있는 면역 세포의 유형과 수에 의해 반영됩니다. 우리는 비 흡착성 세포와 쥐의 하부 호흡기에서 용해되는 요소를 분리하고 연구 할 수있는 기관지 폐포 세척 기술에 대해 설명합니다.

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

이 문서의 목적은 실험실 마우스의 정교한 삽관 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 비침습적이며, 따라서 호흡기 기능의 연속 모니터링 및 / 또는 폐로의 치료 의 주입을 필요로하는 연구에 이상적입니다.

마우스에서 반복된 Orotracheal 삽관

여기에서는 비침습적 및 실시간 전신 혈량측정(WBP) 시스템을 사용한 기침 측정과 생쥐의 조직 샘플을 채취하는 규범적 절차를 설명하고 기도 염증을 평가하는 몇 가지 방법을 소개합니다.

마우스에서 기침 및 기도 염증을 감지하는 방법

학습하세요 마우스 경구 기관 삽입법을 통해 기도 과민성과 염증 세포를 반복 측정하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 호흡 생리학 연구에 필수적입니다.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

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