Name: 호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: 배우세요 호중구 세포 트랩 생성 및 시각화 방법을 인간 혈액에서 호중구를 분리하고 자극하여 NETs를 형성하는 과정입니다. 면역형광 및 주사전자현미경을 활용한 시각화 기법을 통해 병원체 방어 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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1. 인간의 혈액에서 PMN 격리 항응고제로 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또는 헤파린 (10 U / ML) 24 ML 인간의 혈액에 대해 사용합니다. <ol><li> 15 ML 팔콘 튜브 6 ML Histopaque 1119를 추가하고 위에 조심스럽게 레이어 5-7 ML 전체 혈액. </li><li> 제동없이 800 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. </li><li> 기음과 폐기 노란 맑은 상위 레이어를 신선한 팰컨 튜브에 granulocytes를 포함하는 낮은 붉은 단계를 전송합니다. </li><li> 300 x G. 10 분 PBS 및 원심 분리기와 팔콘 튜브를 작성하여 세포를 씻어 </li><li> 한편 2 ML 10X PBS 18 ML Percoll를 혼합하여 100 % Percoll 솔루션을 준비합니다. 1X PBS 85 %, 80 %, 75 %, 70 % 및 65 % Percoll 4 ML 솔루션을 준비와 함께. </li><li> 주문을 감소 서로의 위에 모든 비율이 겹겹이 ML하여 Percoll 기울기 2 팰컨 튜브를 준비합니다. </li><li> 원심 분리가 뜨는을 제거한 후, PBS 4 ML에 쥐똥과 resuspend sedimented 세포를 결합. </li><li> 그라디언트의 각 방향 resuspension의 신중 레이어 2 ML. </li><li> 제동없이 800 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 최고 레이어를 제거하고 65% 계층의 대부분 PBMCs와 85 % 계층까지 새로운 팔콘 튜브에 흰색 나머지 타령을 수집 후. </li><li> 300 x G. 10 분 PBS와 원심 분리기와 팔콘 튜브를 작성하여 세포를 씻어 </li><li> PBS의 2ml에 뜨는 및 resuspend sedimented 세포를 (보통&gt; 95 % PMN 아르)를 제거합니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. </li></ol> 2. 활성화 PMNs <ol><li> 각 우물에 살균 13mm 원형 유리 커버 슬립 (# 1.5)를 넣어 24 웰 세포 배양 판을 준비 </li><li> 씨앗이 500μl RPMI에서 X 10 5 세포를 잘 당 (2 % 인간 혈청 알부민을 포함)과 37 CO 2 배양기에서 1 시간을위한 품어 ° C. </li><li> 한편 RPMI에서 600 NM PMA 솔루션을 준비하고 100μl 잘 따라 세포에 추가할 수 있습니다. 37까지 CO 2 배양기에서 4 H 15 분부터 품어 ° C. </li><li> 4퍼센트 (최종 농도) PBS에 용해 paraformaldehyde에서 세포를 수정. </li></ol> PMA는 긍정적인 제어 역할을하고 지금까지 NET 형성을 유도하는 가장 강력한 대리인이다. 또한, 병원균과 다른 자극 또는 공동 재배는 NET 유도 사용할 수 있습니다. 시간 코스 진행되는 동안 추가 병렬 샘플 준비하는 경우 NET 형성의 각 상태는 확인하실 수 있습니다. Sytox 그린 (Invitrogen)과 같은 비 permeant DNA의 염료가 아닌 고정 셀을 추가하는 경우에만 세포 DNA가 감지됩니다. 새로운 그물 형성이 어떻게든 때마다 포인트, Sytox의 면전에서 장애인이기 때문에 한 병렬 샘플은 사용할 수 있습니다. 3. immunolabeling에 의해 NET 검출 그물도 고정 후 매우 연약하고, 아주 조심스럽게 조작으로 달리 대부분이 준비 중 길을 잃기 쉬우니있다. <ol><li> 신중하게 굽은 바늘로 가장자리에 그것을 리프팅하여 24 잘 문화 플레이트의 부착 세포와 유리 커버 전표를 제거하고 훌륭한 포셉로 점유. PBS의 드롭에 거꾸로 커버 슬립을 넣어. 이 테스트 튜브 스탠드를 덮고 Parafilm 시트에서 할 수 있습니다. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오. </li><li> 트리톤은 X - 100 RT 1 분 세포를 permeabilize하기 위해 0.5 %의 드롭 같은 방식으로 커버 전표를 품어. 1 분을위한 PBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> Parafilm와 젖은 휴지로 습기 챔버를 준비합니다. 덮개가 차단 버퍼 (5 % 당나귀 혈청)의 드롭 거꾸로 미끄러져 누워 37 30 분 품어 ° C. </li><li> 버퍼를 차단의 기본 항체, 예를 들어 MS 안티 히스톤 및 RB 안티 호중구 엘라스타제을 희석. </li><li> 기본 항체의 드롭에 버퍼를 차단에서 직접 습기 챔버에서 전표를 커버 37 1 H에 대한 품어 전송 ° C. </li><li> PBS로 5 분 3 번 씻으십시오. </li><li> 이차 항체, 예를 들어 DK 안티 MS Cy2와 버퍼를 차단에 DK 방지 RB Cy3를 희석. </li><li> 이차 항체의 드롭에 습기 챔버에 전표를 커버 37 1 H에 대한 품어 전송 ° C. </li><li> PBS로 5 분 3 번 씻으십시오. 얼룩 DNA는 UV 여기거나 멀리 붉은 여기에 대한 Draq5로 필요하고 디스트로 두 번 씻어 것입니다 Hoechst 33342 (1 μg / ML)와 중 5 분 들어, 형광 현미경 옵션에 따라 다릅니다. 물. </li><li> 유리 슬라이드에 Mowiol의 20μl 방울을 설정하고 거꾸로 전지 커버 전표를 탑재합니다. 세포는 커버 슬립 및 슬라이드 사이에 있어야합니다. Mowiol의 드롭 커버 슬립이 드롭 위치는 균일한 두께의 얇은 레이어를 형성합니다. 일반적으로 샘플을 눌러 필요가 없습니다. 가 아닌 침지 렌즈를 사용하려는 경우, 표본은 조사를 위해 준비가 된 것입니다.침지 렌즈와 현미경의 분석을 위해, Mowiol이 샘플의 가장자리 경화까지 약 1 시간에 대한 표본은 건조하게. </li></ol> 4. 전자 현미경을 검사에 대비하여 그물 (SEM) <ol><li> 2,5 %의 글루 타 알데히드 24 - 잘 판에있는 유리 커버 전표에서 세포를 수정 게시합니다. </li><li> 24 잘 문화 판의 세포를 포함하는 유리 커버 전표를 제거하고 물 한 방울에 거꾸로 내려놔. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오. </li><li> 30 분 0,5 % OsO4과 부화를 포함한 24 웰 세포 배양 플레이트에 다시 커버 전표를 전송합니다. </li><li> 24 잘 문화 판의 세포를 포함하는 유리 커버 전표를 제거하고 물 한 방울에 거꾸로 내려놔. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오. </li><li> 30 분 1퍼센트 타닌산과 부화를 포함한 24 웰 세포 배양 플레이트에 다시 커버 전표를 전송합니다. </li><li> 단계를 반복 4.2-4.4 </li><li> 다음과 같은 처방 (5 분 각각)를 통해 탈수 : <ul><li> 30 % 에탄올 </li><li> 50 % 에탄올 </li><li> 70 % 에탄올 </li><li> 80 % 에탄올 </li><li> 90 % 에탄올 </li><li> 100 % 에탄올 </li><li> 100 % 에탄올 </li><li> 100 % 에탄올 </li></ul></li><li> 임계점 건조기 건조 표본으로 전표를 커버 전송합니다. </li><li> 얇은 레이어 증발기를 사용하여 5nm 플라틴 / 탄소 층과 표본의 코트 표면 </li></ol> 5. 대표 결과 : 절연 방식은 일반적으로 95%보다 순도와 unstimulated 가능한 neutrophils를 산출. 자극 후 다른 시간 시점에서 고정되면, immunostaining 프로토콜 NETosis의 평평화 세포, 핵 lobules의 손실, 과립의 손실과 핵 (히스톤 IE)와 세분화된 (즉,의 증가 오버랩로 연결 핵 무결성 중 형태학의 변경 순서를 보여줍니다 호중구 엘라스타제) 염색법. 이 프로토콜은 neutrophils과 병원균의 특정 상호 작용을 분석하는 출발점이 될 수 있습니다. 이 상호 작용은 전자 현미경을 스캐닝을위한 준비 프로토콜을 사용하여보다 자세한 해부를하실 수 있습니다. NET 형광 NET 구성 요소 (청색 = DNA, 빨강 = 히스톤, 녹색 = 호중구 엘라스타제)의 스테인드 자극 neutrophils의 샘플. 이미지 NET 현지화, DNA와 histones의 핵 지방화 및 호중구 엘라스타제에 대한 세분화된 패턴 외에도 보여줍니다. SEM PMA의 자극 비 자극 및 PMA 자극 neutrophils을 보여주는 전자 현미경을 검사합니다. 자극 후, neutrophils 밖으로 평평하게하고 그물을 생산합니다. SEM 그물과 시겔라 그물에 갇힌 시겔라 세균의 높은 해상도의 SEM 이미지.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

제공된 프로토콜은 상당한 순도에 비 자극 neutrophils의 고립, NET 형성의 유도와 NETosis 중 형태학의 변화의 분석을하실 수 있습니다. 주의 표본을 처리하는 경우, 즉 느슨하게 연결된 그물의 대부분의 손실됩니다 거친 세척 조건을 피하기 위해, 다양한 자극 조건 형성 NET (기간, 자극)의 양은 비교할 수 있습니다. 호중구 / 병원체 상호 작용, 자극의 순서, 다른 면역 세포와 상호 작용 :이 존중에서 제공하는 프로토콜은보다 정교한 시나리오를 분석하는 방법을 확립하기위한 출발점이 될 수 있습니다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구의 granulocytes는 주변 혈액에 leukocytes의 가장 풍부한 그룹입니다. 전문 phagocytes, 그들은 아마 박테리아와 intracellularly 그들을 죽일 phagosome 그들의 항균 과립 퓨즈. 우리는 neutrophils는 미생물을 죽이는의 추가 방법을 발견 : 활성화시, 그들은 함께 세포 섬유를 형성 과립 단백질과 염색질을 공개 바인딩 병원균 것을. 이 소설의 구조, 또는 호중구 세포 트랩 (그물), 독성 요인을 저하 및 세균 1, 곰팡이 기생충 2 3 죽여. 네츠의 구조적 근간은 DNA이며, 그들은 DNases의 존재에 신속하게 저하됩니다. 따라서, DNases을 표현하는 박테리아는 4 더 악성입니다. TEM, SEM, immunofluorescence 및 라이브 셀 이미징 기술을 결합하여 상호 현미경을 사용하여, 우리는 자극에 따라, neutrophils의 핵은 그 모양을 잃게하고 EU와 heterochromatin이 균질 것을 알 수 있습니다. 나중에 핵 봉투 및 과립 점막은 NET 구성 요소의 혼합을 허용 분해. 마지막으로, 그물은 세포막 나누기로 발표하고 있습니다. 이 세포 죽음 프로그램 (NETosis)은 apoptosis와 괴사와는이며 NADPH 산화 효소 5 반응 산소 종의 생성에 따라 달라집니다. 호중구 세포 트랩은 급성 염증의 사이트에서 풍부한 있습니다. 네츠는 바인드 미생물 즉, 확산을 방지하고, 독성 요인을 저하하고 neutrophils도 자신의 수명이 넘어 자신의 항균 기능을 수행 수 있도록함으로써 병원체를 죽이는 항균 대리인의 높​​은 지방 농도를 보장 타고난 면역 반응의 한 형태로 나타납니다. 증거가 증가하고있다, 그러나, 그 그물은 또한 질병에 관련된 면역 syndromes에서 불임 6 다양합니다. 우리는 주변 사람의 혈액 7 호중구 Granulocytes을 분리하고 그물을 형성하도록 자극하는 방법을 설명합니다. 또한 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하는 프로토콜이 포함됩니다.

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 과립구는 말초 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 집단입니다. 전문 포식세포로서, 이들은 박테리아를 섭취하고 사멸시킵니다...

호중구 외세포 트랩(neutrophil extracellular traps) 또는 nets는 세포질 및 과립 단백질의 조합과 크로마틴을 방출하여 호중구가 외세포 섬유를 형성함으로써 병원균을 가두어 제거하는, 최근에 밝혀진 호중구 매개 병원균 제거 기전입니다. 본 영상에서는 조직병리학적 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 전혈에서 과립구(granulocytes)를 분리합니다. 이후 Percoll 구배를 사용하여 과립구 준비물로부터 호중구를 분리합니다.커버글라스에 원심분리하여 도말한 후 화학적 또는 생물학적 자극을 통해 NETs를 형성하도록 유도하며, 이후 NETs 시각화를 위해 면역 라벨링 또는 EM 처리를 진행합니다. 안녕하세요, Max Planck Institute for Infection Biology의 현미경 코어 시설의 Christian Gosman입니다. 오늘은 인간 혈액에서 호중구 과립구(neutrophil granulocytes)를 정제하고, 이를 자극하여 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps) 또는 NETs를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다.다음으로 면역형광법과 주사 전자 현미경을 통해 net을 시각화하겠습니다. 저희 실험실에서는 net 형성으로 이어지는 메커니즘을 연구하고 net의 항균 특성을 분석하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.라미나 플로우 후드 내에서 4~15 mL Falcon 튜브 4개에 각각 6 mL의 histo 1119를 준비하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 각 튜브의 histo 층 위에 5~7 mL의 전혈을 조심스럽게 층이 지도록 분주한 후, 약 800 ×g에서 20분 동안 원심분리하며, 원심분리가 완료되면 브레이크가 꺼져 있는지 확인하십시오. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 꺼내십시오.튜브에는 위에서 아래로 명확하게 구분된 네 개의 층이 형성됩니다. 이는 적혈구를 포함하는 진한 빨간색 층, 일부 적혈구가 포함된 호중구 과립구 층인 연한 빨간색 층, 백혈구와 혈청을 포함하는 백색-황색 층, 그리고 투명한 황색의 혈청 층입니다.다시 층류 후드(lamina flow hood) 내에서 작업하십시오. 진공 시스템에 연결된 흡입기(perpet)를 사용하여 상단의 노란색 층을 조심스럽게 흡입해 제거합니다. 그 다음 피펫을 사용하여 각 튜브에서 과립구(granulocytes)가 포함된 붉은색 층을 새로운 팰콘 튜브(falcon tube)로 옮깁니다.다음으로, 과립구(granulocytes)를 세척하기 위해 튜브에 PBS를 채웁니다. 그런 다음 세포가 회전하는 동안 약 300 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)을 형성합니다. Percoll 18 mL와 10배 PBS 2 mL를 혼합하여 100% percoll 용액을 준비합니다.그다음 100% coll 용액과 1배수 PBS를 사용하여 65, 70, 75, 80, 85% coll 용액을 각각 4mL씩 준비합니다. 이 용액들을 사용하여 각 튜브 두 개에 각 용액 2mL씩을 조심스럽게 층지게 쌓아 per core 구배를 준비합니다. 먼저 각 튜브에 85% 용액 2mL를 넣는 것부터 시작합니다.그다음 85% per coll 위에 80% per co 2mL를 조심스럽게 층분리하여 쌓습니다. 65% 용액이 가장 위에 올 때까지 각 용액을 내림차순으로 2mL씩 계속 층층이 쌓습니다. 후드 내에서 원심분리기로부터 침전된 백혈구를 제거합니다.상층액을 버리고 1 mL의 PBS에 세포를 재부유시킵니다. 그런 다음 재부유된 세포를 새 튜브에 합칩니다. 재부유된 과립구 2 mL를 각각의 Percoll 밀도 구배 층 위에 조심스럽게 층을 이루도록 분주합니다.그 다음 약 800 ×g에서 20분 동안 원심분리하며, 원심분리가 끝난 후 브레이크가 꺼져 있는지 확인하십시오. 세포 밀도가 가장 높은 지점으로 인해 층 사이의 경계면이 명확하게 보여야 합니다. 말초혈액 단핵구(p BMCs)가 포함되어 있는 상층부와 65% 층의 대부분을 제거하십시오.각 밀도 구배에서 65%70% 계면과 70%75% 및 80%85% 계면을 함께 수집하여 새로운 멸균 팔콘 튜브로 옮깁니다. 튜브에 PBS를 채워 세포를 세척하고, 약 300 ×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 침전된 다핵구 및 핵 백혈구 또는 PMN을 2 mL의 PBS에 재부유시킵니다.이 시점에서 준비된 세포의 95% 이상이 mns가 됩니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 15 mm 크기의 웰이 있는 배양 플레이트에 배치된 멸균 원형 커버슬립 위에 500 µL의 RPMI에 포함된 200,000개의 세포를 분주합니다. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 배양합니다.원하는 자극제가 포함된 RPMI 100 µL를 첨가합니다. 시간 경과 실험의 경우, 각 조건별 시간 지점에서 가장 긴 자극 시간부터 시작하여 자극제를 순차적으로 첨가하십시오. RPMI에 600 nM의 PMA를 첨가하여 양성 대조군을 반드시 준비하십시오.또한, 각 조건 또는 시간대별로 RPMI만을 첨가하여 음성 대조군을 준비합니다. 자극 과정 중 37°C의 CO2 인큐베이터에서 최대 4시간 동안 배양하며, 명시야 현미경을 사용하여 NETs의 형성을 모니터링할 수 있습니다. 자극 직후, 핵의 형태가 급격히 변화합니다. 핵은 소엽 구조를 잃고 둥글게 변한 뒤 확장됩니다. 지정된 시간대에 각 웰에 상온의 8% 파라포름알데히드 용액 600 µL를 첨가합니다.최종 농도를 4%로 맞춘 후, 면역 표지를 위해 2~4시간 동안 배양합니다. 직경 약 15 millimeter의 8구 3열 구멍이 있는 시험관 랙 위에 파라폼 시트를 배치합니다. 웰을 형성하기 위해, 웰에 PBS를 채웁니다.곡선 바늘을 사용하여 배양 플레이트의 파랄데히드(paraldehyde)에서 각 커버 슬립을 들어 올립니다. 그런 다음 핀셋을 이용해 커버 슬립을 잡고, 파라폼(paraform) 위에 떨어뜨린 PBS 방울 표면에 뒤집어서 덮습니다. 이 시점에서 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps)은 매우 취약하므로, 세포 손실을 방지하기 위해 조작 과정에서 각별한 주의가 필요합니다.5분 후, 커버슬립을 새로운 PBS 방울로 옮겨 세척 과정을 반복합니다. 총 3회 세척이 되도록 반복하십시오. 다음으로, 세포의 투과성을 높이기 위해 커버슬립을 상온의 0.5% Triton X 100 방울로 옮겨 1분 동안 유지합니다.그 후 PBS로 1분씩 3회 세척합니다. 동봉된 서면 프로토콜에 따라 염색을 진행하십시오. 각 배양 및 세척 단계는 커버 글라스를 파라폼(paraform) 위에 뒤집어 놓은 상태에서 수행합니다.세포 염색이 완료되면, 글라스 슬라이드 위에 MO 20 µL 한 방울을 떨어뜨리고 세포가 커버슬립과 슬라이드 사이에 위치하도록 커버슬립을 뒤집어 덮습니다. 1시간 후 MOY가 응고되면 세포를 현미경으로 분석할 수 있습니다. 침수 렌즈를 사용하는 경우, 화학 흄 후드 아래에서 주사 전자 현미경 관찰을 위해 세포를 준비하십시오.24웰 플레이트 내의 유리 커버슬립 위에 있는 세포를 2.5% glutaraldehyde가 포함된 PBS로 30분 동안 후고정합니다. 배양하는 동안, 약 15mm 직경의 8개 구멍이 3줄로 뚫려 있는 시험관 위에 파라폼 시트를 올려둡니다.웰을 형성합니다. 웰을 증류수로 채웁니다. 곡선 바늘을 사용하여 글루타르알데히드 용액에서 각 커버 슬립을 들어 올립니다.그 다음 핀셋을 사용하여 커버슬립을 잡고, Paraform 세척액 위의 증류수 한 방울로 옮깁니다. 커버슬립을 Paraform 상의 증류수 방울로 옮기는 과정을 총 3회 반복하며, 각 단계마다 5분씩 유지합니다. 커버슬립을 증류수에 용해된 0.5% osmium tetroxide가 들어 있는 세포 배양 플레이트의 웰로 다시 옮기고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트에서 커버슬립을 꺼내어 이전과 동일하게 증류수로 3회 세척합니다.그런 다음 각 웰에 1% tannic acid 0.5 milliliters를 넣은 24 웰 플레이트에 다시 넣고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 커버슬립을 5분씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 osmium tetroxide를 이용한 고정과 세척 과정을 반복합니다.다음으로, 시험관의 뚜껑을 덮습니다. 새로운 파라폼(paraform)을 준비하십시오. 30, 50, 70, 80, 90, 100% 에탄올 용액 순으로 각각 5분씩 일련의 배양 과정을 거쳐 세포를 탈수시킵니다.마지막으로, 100% ethanol에서 한 번 더 반복합니다. 에탄올이 채워진 표본 보트에 랙을 담급니다. 표본이 마르지 않도록 주의하며 커버슬립을 금속 랙에 빠르게 옮겨 넣습니다.그 후 시료 보트를 냉각된 임계점 건조기(CPD)로 옮깁니다. CPD 챔버를 액체 CO2로 채웁니다. 액체 수위를 유지하기 위해 유입 밸브를 완전히 열어두고, 챔버 바닥의 CO2 상 아래로 에탄올 상이 보이면 즉시 바닥의 배수 밸브를 엽니다.에탄올 대부분을 제거하기 위해 챔버를 약 30분 동안 세척합니다. 세척 후, 유입 밸브를 닫고 액체 수위를 보트 상단 바로 아래까지 낮춥니다.CPD의 재킷에 온수를 흘려보냅니다. 온도가 36~38°C에 도달하고 압력이 1,200 psi까지 상승하면 액체-기체 경계선이 사라지며 시료가 임계점 이상 상태가 됩니다. 임계점에 도달하면 5분에 걸쳐 천천히 가스를 배출합니다.결로 현상을 방지하기 위해 온도는 40 °C 정도로 유지해야 합니다. 이때 문을 열고 보트를 꺼내어 탈수 용매가 증발했는지 확인합니다.커버 슬립의 오른쪽 면이 알루미늄 시료 홀더의 접착면을 향하게 부착한 후 고해상도 코팅 시스템으로 옮깁니다. 코팅 실린더를 2 × 10⁻⁵ mbar까지 진공 상태로 만듭니다. 그다음 기기를 1.8 kV 및 70 mA로 설정하고, 플라틴 탄소 층의 두께가 5 nm에 도달할 때까지 수정 진동자 두께 측정기로 두께를 모니터링합니다.고해상도 코팅 시스템의 코팅 실린더를 벤팅합니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 코터에서 샘플을 제거합니다. SEM 챔버를 상압 상태로 되돌립니다.문을 엽니다. 그런 다음 시료를 시료 홀더에 넣고 챔버를 진공 상태로 만듭니다. SEM 분석을 위해서입니다.자극 후 서로 다른 시간 지점에서 고정하면, 면역형광 현미경을 통해 NETosis 과정 중의 형태학적 변화를 관찰할 수 있습니다. 이 그림에서 DNA는 파란색으로, 히스톤 DNA 복합체는 빨간색으로, 그리고 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase)로 표시됩니다.NETosis의 첫 번째 단계에서는 과립 마커가 녹색으로 나타나며, 응축된 핵의 핵 주변부에만 국한되어 관찰됩니다. 이후 염색질이 더욱 탈응축되면, 핵의 대부분이 탈응축된 그물망 형태로 염색됩니다. 염색 양상은 균질합니다.이 이미지 패널은 NETosis와 함께 발생하는 핵 및 과립 염색의 중첩을 상세히 보여줍니다. 이 주사 전자 현미경 사진은 자극을 받지 않은 호중구의 모습이며, Ella bacterium으로 자극한 후 호중구는 편평해지며 호중구 외세포 트랩(neutrophil extracellular traps)을 생성합니다. 여기서는 gel bacterium이 네트(nets)에 갇혀 있는 모습입니다.그물 형태의 구조에 존재하는 효소들에 의해 겔과 같은 박테리아가 고정되고 사멸됩니다. 지금까지 인간의 혈액에서 호중구 과립구를 분리하고, 이를 자극하여 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps)의 형성을 유도하는 방법을 살펴보았습니다. 이후 면역형광법이나 주사 전자 현미경을 통해 이를 추가로 분석할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 고정 후에도 NETs는 매우 취약하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. NETs의 손실을 최소화하기 위해, 웰 공동에서 자극된 호중구가 있는 커버슬립을 꺼내어 대부분의 절차를 버퍼 방울 표면 위에서 진행합니다. 그렇더라도 시편을 매우 부드럽고 천천히 이동시키는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

neutrophil-extracellular-traps-how-to-generate-and-visualize-them

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 호중구가 배출하는 세포 외 DNA 구성 요소인 호중구 세포 외 트랩(NET)의 형광 염색을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

호중구 세포외 트랩 또는 NET의 형광 현미경: 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 관찰하는 기술

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

배우세요 호중구 세포 트랩 생성 및 시각화 방법을 인간 혈액에서 호중구를 분리하고 자극하여 NETs를 형성하는 과정입니다. 면역형광 및 주사전자현미경을 활용한 시각화 기법을 통해 병원체 방어 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

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