곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae

이 영상에서는 초파리(Drosophila melanogaster)의 단일 촉각 신경(single syn) 기록 방법과 odorant를 준비하여 종이 스트립에 피펫팅한 후 파스퇴르 피펫에 삽입하는 과정을 보여줍니다. 후각 기관을 고정하기 위해 살아있는 곤충을 마운팅합니다. 곤충을 현미경 아래에 두고 참조 전극을 곤충의 눈에 삽입합니다.

그 다음 기록 전극을 후각 구(olfactory centum)에 삽입합니다. 피펫을 통해 후각 구로 냄새를 분사하고 신경 세포 활동을 기록합니다. 안녕하세요, 저는 Rockefeller University의 Vasal 연구실 소속 Leslie Vasal입니다. 그리고 저 또한 Vasal 연구실 소속인 Mariza Pellegrino입니다.

오늘은 초파리(Drosophila melanogaster)와 말라리아 모기(Anopheles gambiae)의 후각 감각 뉴런으로부터 신호를 기록하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 곤충의 후각 센서가 어떻게 작동하는지, 그리고 뉴런이 휘발성 화학 물질에 어떻게 반응하는지를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

먼저 기록에 사용할 전극을 날카롭게 다듬어 이 절차를 시작합니다. 드릴을 사용하여 20 liter 주사기의 끝부분에서 1 cm 떨어진 벽면에 지름 약 2 mm의 작은 구멍을 뚫습니다. 주사기에 여과된 0.5 molar 수산화칼륨을 채우고, 주사기 끝이 시야에 들어오도록 해부 현미경 아래 스탠드에 수평으로 고정합니다. 주사기 끝을 막지 않도록 주의하며 주사기의 구멍 속으로 전선을 밀어 넣고, 이를 전원 공급 장치의 양극에 연결합니다.

현미경의 우측에 전극 홀더 샤프트를 수동 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 그다음 악어 클립을 사용하여 전극 홀더 샤프트 하단에 전기 케이블을 연결합니다. 이 케이블을 전원 공급 장치의 음극에 연결하십시오.

5 cm 길이의 텅스텐 와이어를 전극 홀더에 삽입하고 조작기의 샤프트에 나사로 고정합니다. 전원 공급 장치를 6배로 설정합니다.

해부 현미경으로 관찰하면서, 전극의 90% 길이가 용액에 잠기도록 시린지 팁에 전극을 삽입합니다. 1분 후, 전극을 천천히 빼낸 다음 다시 삽입합니다. 이번에는 전극의 50%만 용액에 닿도록 합니다.

30초 후, 전극을 다시 꺼냅니다. 전극의 50%가 수산화칼륨과 접촉하도록 바늘을 삽입하는 과정을 10회 반복합니다. 전극의 끝이 날카로워지면 실험에 사용할 준비가 된 것입니다.

크로마토그래피 용지를 3 mm × 5 cm 크기의 스트립으로 잘라 후각 자극제 전달 시스템 준비를 시작합니다. 각 스트립에 원하는 후각 자극제 30 µL를 피펫으로 분주합니다. 그런 다음, 피펫 너머의 유리관 안에 스트립을 넣습니다. 약 3 cm 길이의 에어라인 튜브 조각을 피펫에 연결합니다.

그런 다음 커넥터를 사용하여 튜브를 밀봉하고 준비된 취기물을 따로 둡니다. 다음으로 면도날을 사용하여 10 milliliter 플라스틱 세롤로지컬 피펫의 상단에서 4 milliliter 표시 지점을 절단하고 뾰족한 끝부분은 버립니다. 그런 다음 소형 드릴을 사용하여 -1.5 milliliter 표시 지점과 -0.5 milliliter 표시 지점에 각각 하나씩, 총 두 개의 구멍을 뚫습니다.

다음으로, 200 µL 피펫 팁을 바브 커플러(barbed coupler)에 삽입하고, 커플러를 절단된 10 mL 피펫 끝부분에 밀어 넣습니다. 피펫을 자성 스탠드에 고정하고 현미경 근처에 배치합니다. 그런 다음 에어라인 튜브를 사용하여 세롤로지컬 피펫을 공기 펌프에 연결하고, 냄새 물질이 담긴 피펫들을 세롤로지컬 피펫 옆에 배치하여 사용할 준비를 합니다.

다음으로, 전극 홀더에 전극을 나사로 고정하고, 현미경 설정의 매니퓰레이터에 연결된 프로브를 고정합니다. 치과용 왁스 위에 커버 글라스를 30도 각도로 올리고, 치과용 왁스가 글라스의 윗부분을 덮지 않도록 합니다. 그런 다음, 치과용 왁스 조각을 현미경의 중앙 부분에 배치합니다.

이제 여기에 표시된 것처럼 슬라이드 위에 더 작은 왁스 조각을 하나 더 올립니다. 수직 풀러(vertical puller)로 뽑아낸 유리 모세관을 배치합니다. 120 cm 길이의 항공 튜브 한쪽 끝에 절단된 200 µL 피펫 팁을 삽입하여 비행 흡입기를 제작합니다.

튜브의 반대쪽 끝을 1.5 centimeter x 1.5 centimeter 크기의 메쉬로 덮고, 절단된 1 milliliter 피펫 팁으로 캡을 씌워 고정합니다. 이제 파리 흡입기를 사용하여 병에서 성체 파리를 채집합니다.

초파리 흡입기 끝부분을 200 µL 팁으로 막아 초파리를 가둡니다. 그런 다음 튜브 속으로 바람을 불어넣어 초파리를 200 µL 팁의 끝부분 쪽으로 밉니다. 면도날을 사용하여 초파리에서 몇 mm 떨어진 피펫 팁의 넓은 끝부분을 잘라냅니다.

해부 현미경 하에서 치과용 왁스를 빠르게 삽입하여 초파리를 고정합니다. 작은 피펫 팁을 사용하여 초파리가 다치지 않도록 주의하며 머리 부분 근처의 피펫 팁을 다듬습니다. 초파리 눈의 약 절반 정도가 팁 밖으로 나올 때까지 왁스를 밀어 넣습니다.

다리가 밖으로 나오면 기록에 방해가 될 수 있으므로 주의하십시오. 파리의 머리가 위를 향하도록 하여 왁스 조각 위에 고정합니다. 그런 다음, 여기 보이는 것처럼 슬라이드 글라스 위의 커버 글라스 옆에 왁스를 배치합니다.

왁스를 약간 밀어 안테나가 펴져서 유리에 닿게 합니다. 두 번째와 세 번째 안테나 마디 사이의 홈에 유리 모세관을 배치하여 안테나를 고정합니다. 초파리가 슬라이드 위에 배치되면, 이를 기록 및 후각 자극 설정이 완료된 현미경으로 옮겨 저배율로 관찰합니다.

안테나를 시야의 대략 중앙에 배치하십시오. 기준 전극을 조심스럽게 내려 눈에 인접하게 배치하십시오. 그런 다음 기록 전극을 내려 안테나에 인접하게 배치하십시오.

배율을 높이고 안테나가 시야 중앙에 오도록 위치를 조정하십시오. 냄새 전달 장치를 파리의 머리 가까이에 두고 안테나를 향하게 배치하십시오. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 다시 저배율로 전환하십시오.

기준 전극을 초파리의 눈에 삽입합니다. 기록 전극의 표면이 닿지 않도록 주의하며 안테나 위로 내립니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 다시 고배율로 전환합니다.

기록 전극을 syn의 어느 지점이든 길이를 따라 삽입하십시오. 전극이 적절하게 배치되면 sens 세포의 자발적 활동을 검출할 수 있습니다. 필요한 경우, 더 나은 신호 대 잡음비를 얻기 위해 전극을 더 깊게 밀어 넣거나 sens를 완전히 관통하도록 삽입할 수 있습니다. 취기물에 대한 반응을 기록하려면, 에어라인 튜브를 사용하여 pasture 피펫을 에어 펌프에 연결하고, 에어 펌프를 약 220 milliliters per minute의 유량으로 약 1초 동안 작동시켜 취기물(이 경우 methyl acetate)을 분사하십시오.

전기 흡입기를 사용하여 40~63마리의 5일 된 모기를 작은 플라스틱 케이지에 수집합니다. 모기를 마취시키기 위해 케이지를 얼음 위에 약 15분 동안 둡니다. 모기의 움직임이 멈추면, 4~6마리의 모기를 해부 현미경 스테이지로 옮깁니다.

암수 모두 가능합니다. 모기는 기록용으로 사용할 수 있습니다. 수컷의 경우입니다.

더듬이는 깃털 모양으로 보이며, 암컷의 경우에는 실 모양으로 보입니다. 미세 핀셋을 사용하여 모기의 날개와 다리를 제거해 움직이지 못하게 고정합니다. 날개를 제거한 후, 모기가 건조해지는 것을 방지하기 위해 가습된 플라스틱 컵에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 유리 슬라이드의 중앙과 측면에 1cm 길이의 양면테이프 두 조각을 서로 평행하게, 약 1cm 간격으로 배치합니다. 핀셋을 사용하여 모기 한 마리를 옆으로 눕혀 놓습니다.

중앙 테이프 위에 놓습니다. 한쪽 눈이 테이프에 달라붙게 됩니다. 상악 치수(maxillary pulps)의 위치를 조정하여 두 부분이 테이프 상에서 나란히 연장되도록 합니다.

상악 촉수(maxillary pulps)의 기부와 끝부분에 사람 머리카락과 같은 가는 실을 배치하여 고정합니다. 모기를 슬라이드 위에 배치한 후, 이를 기록 장치로 옮깁니다. 저배율 상태에서 상악 촉수가 시야의 대략 중앙에 오고 머리가 상단에 위치하도록 조절한 다음, 촉수 중 하나가 직각이 될 때까지 스테이지를 회전시킵니다.

기록 전극을 전극 높이에 맞게 조정하여 기준 전극이 모기의 눈 바로 위에 위치하도록 합니다. 기록 전극은 상악 촉수 근처에 둡니다. 냄새 전달 장치를 촉수에 최대한 가깝게 배치합니다.

기준 전극을 눈에 삽입합니다. 100배 대물렌즈로 전환하고 기록 전극을 안검 거상기(palp)의 핀에 삽입합니다. 전극이 중격(septum)에 진입하면 세포의 자발적 활성을 검출할 수 있습니다.

초파리 기록과 마찬가지로, 이 경우에는 냄새가 포함된 후방 피펫을 공기 펌프에 연결한 다음 공기 펌프를 작동시켜 후각 물질을 분사함으로써 후각 유도 반응을 기록합니다. 이제 초파리와 뱀의 후각 감각 뉴런에서 얻은 대표적인 기록들을 보여드리겠습니다. 자극의 종류와 기록 품질에 따라, 예를 들어 drosophila melanogaster의 거대 기저 환상 감각모 내의 단일 트레이스에서 2개에서 4개 사이의 서로 다른 수의 후각 뉴런을 구별할 수 있으며, 기록 중에 서로 다른 스파이크 진폭이 나타나야 합니다.

이 그림은 두 개의 drosophila AB two lum 세포에서 측정된 기록을 보여줍니다. A 세포의 기록은 파란색으로, B 세포의 기록은 녹색으로 표시되었으며, 파라핀 오일 도포 중에는 두 세포 모두 활성화되지 않았습니다. 왼쪽 그림에서 볼 수 있듯이, OPIS gambier의 상악 수염(maxillary pal)에 있는 methyl acetate에 대해 A 세포만이 반응합니다. grooved pegs와 soum에는 세 개의 세포가 포함되어 있으나, 그 중 두 개만이 쉽게 구별됩니다. 여기에서.

초록색으로 표시된 기록은 후각 물질 1인 OCT 3에 대한 B 세포의 반응을 나타냅니다. 지금까지 초파리(Drosophila melanogaster)와 말라리아 모기(Anopheles gambiae)의 후각 감각 뉴런으로부터 기록하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 안정적인 고정 표본 준비와 미세한 텅스텐 전극을 갖추는 것이 성공적인 기록 수행을 위해 중요하다는 점을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.