Name: 세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포를 형광 공초점 현미경으로 실시간 영상화하는 방법입니다. 이 기법은 세포 운동성과 액틴 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 MCH 올림푸스 FV1000 공촛점에 NS042228이 UW 동물학과 (PI 빌 베먼트)에 NIH 공유 장비 부여 S10RR023717로 인수되었다 NIH R01에 의해 지원되었다. 에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이는이 종이에 똑같이 기여.

1. 분사 슬라이드 및 이미지 슬라이드 어셈블리 사출 슬라이드 : <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 Sylgard의 실리콘 엘라스토머를 준비합니다. </li><li> 본드 3 개의 표준 유리 현미경을 Sylgard를 사용 긴 가장자리에 나란히 배열되어 다른 두 슬라이드의 교차로 위에 슬라이드를 스태킹하여 함께 슬라이드. 상단 슬라이드 직각 모서리 또는 상단과 하단 슬라이드 사이의 "벽"을 만듭니다. </li><li> Sylgard가 하룻밤 책정할 수 있습니다. 이 슬라이드는 재사용됩니다. </li></ol> 이미징 슬라이드 : <ol><li> 챔버는 현미경 스테이지에있는 슬라이드 홀더에 맞는 그래서 우리는 표준 유리 현미경 슬라이드 (75mm X 25mm X 1mm)의 같은 크기로 절단 스테인리스 사각형을 사용합니다. 1.5 cm의 구멍이 사각형의 중앙에자를 수 있습니다. </li><li> Sylgard와 금속 사각형에 부착 22mm 2 coverslip. 철저하게 coverslip을 봉인하기 위해 충분히 Sylgard 사용합니다. 거꾸로 현미경에 이미지, 배아이 coverslip에 장착되며 바닥에서 몇 군데. </li><li> Sylgard가 하룻밤 책정할 수 있습니다. 이 슬라이드는 재사용과 사용 사이에 70 % 에탄올로 세척하고 있습니다. </li></ol> 2. DNA 구조의 준비 조직에 특정한 방식으로 transgene을 표현하기 위해, 관심있는 유전자는 세포 특정 발기인 뒤에 복제됩니다. 우리는 zebrafish neurogenin1 유전자 (- 3.1ngn1)의 CIS - 규제 요소를 2 또는 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 표현을 드라이브에 sox10 유전자 (- 4.9sox10) 3, 각각을 사용합니다. 셀 및 멤브레인 역학을 시각화하기 위해, 우리는 세포질을 명시적 또는 멤브레인 -화된 fluorophores. 이미지 F - 굴지 배포하기 위해, 우리는 mCherry (UtrCH - mCherry)에 융합 utrophin의 calponin의 상동 도메인을 인코딩 DNA를 표현한다. UtrCH - mCherry 바이오 센서 프로브는 굴지 역학 1 방해하지 않고 F - 굴지의 시각화 수 있습니다. 우리는 재조합 기반 복제 전략 4 zebrafish Tol2kit 5 제공된 벡터 Invitrogen 게이트웨이를 사용하여 이러한 DNA 구조를 생성합니다. <ol><li> zebrafish Tol2kit 5 Multisite - 게이트웨이 기술 및 벡터를 사용하여 발현 벡터 (들)을 생성합니다. Plasmids는 pT2KXIGDin에서 Tol2 백본을 포함합니다. </li><li> QIAfilter 플라스미드 미디 준비 키트 (QIAGEN 주)와 멸균 물 속에 elute와 플라스미드 DNA를 정화. DNA는 주사에 대한 선형 필요하지 않습니다. </li></ol> 3. DNA 구조의 사출 <ol><li> 물에 0.2 % 페놀 레드 (사출 중 시각화를위한)에 10-50 μg / ML DNA의 최종 농도로 DNA를 희석. </li><li> 바늘을 입력하고 보정 : 약 1 μl DNA 솔루션으로 뽑아 모세 바늘을 뒤로 - 기입하여 사출 장치의 바늘 홀더 (우리가 Picospritzer를 사용)에 그것을 삽입합니다. 좋은 포셉 사용 팁 오프닝은 직경 약 10mm입니다 같은 바늘에서 팁을 휴식. 안구 마이크로 미터와 광유의 비말의 직경을 측정합니다. 약 1 NL 볼륨의 비말을 얻으려면 압력 기간 설정을 조정합니다. </li><li> E3 배아 매체 (5mM NaCl, KCl 0.17mM, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, 산도 7.0) 1 - 세포 단계의 배아를 수집합니다. </li><li> 사출 슬라이드와 슬라이드 상단과 하단 사이에 형성 직각 모서리에 위치 배아를 약 30-60 배아를 전송합니다. 배아가 표면 장력에 의해 슬라이드 개최되도록 E3의 대부분을 제거합니다. </li><li> 세포는 사출 슬라이드의 벽에되도록 배아를 회전 구부러진 해부 핀을 사용합니다. </li><li> 난황 통해 배아의 단일 세포로, 배아 chorion를 통해 바늘을 안내 micromanipulator을 사용합니다. 셀에 0.5-1 NL의 DNA 솔루션을 주사. </li><li> 28.5에서 E3와 부화에 페트리 접시에 배아를 전송 ° C. 필요한 경우, 개발은 낮은 온도에서 배아를 잠복기가 느려질 수 있습니다. </li></ol> 4. 이미징 장착 배아 <ol><li> 배아는 이미징 (우리의 목적을 위해 약 14~17시간 사후 수정)에 원하는 연령에 도달하기 전에 한 시간 정도 미세 집게로 태아의 chorions를 제거합니다. </li><li> 형광을 갖춘 해부 현미경을 사용하여 표시된 전지와 배아를 선택합니다. 우리는 때문에 긴 작동 거리와 높은 배율 자사의 조합 니콘 AZ100 범위에서 4X 목표 (40X 배율)를 사용합니다. </li><li> 약 50 μl E3가 0.2 % Tricaine 마취를 (10X 농도)이있는있는 microfuge 튜브로 배아를 놓습니다. </li><li> 0.02 %의 최종 농도 Tricaine을 diluting 10 MM의 HEPES (42 ° C에서 보관)와 E3 500 μl 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스를 추가합니다. </li><li> 즉시에 아가로 오스 드롭의 배아를 전송넓은 구멍 유리 피펫을 사용하여 이미지 슬라이드의 coverslip. </li><li> 아가로 오스는 견고하기 전에 표시된 전지 영역 하단 coverslip (신경 능선 세포와 척수 감각 뉴런에 다운 dorsolateral에 대한 지느러미 아래)에 대해 아래로 향하게하므로, 배아를 위치. </li><li> 이미징 챔버 조립 : 금속 이미지 슬라이드 실리콘 진공 그리스와 접사와 플라스틱 링 (2cm 외경, 높이 3mm)의 문장 한쪽 있습니다. 그리스와 반지의 반대편 코트. </li><li> E3 10 MM HEPES 및 0.02 % Tricaine을 포함하는으로 챔버를 입력합니다. 반지의 상단 표면에 기름칠 22mm 2 coverslip을 affixing하여 챔버 상단을 밀봉합니다. </li></ol> 5. IX81 현미경 올림푸스 FV1000 공촛점에서 세포 행동의 4D 영상 이미지 수집의 세부 사항은 현미경 시스템의 세부 사항에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 올림푸스 FV1000 공촛점 현미경을위한 시간 저속 수집 프로세스를 설명합니다. 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 시스템을 6 시간 저속 취득 이전 조브 프로토콜을 참조하십시오. <ol><li> 현미경 단계에있는 슬라이드 홀더에 이미징 챔버를 삽입하여 전송되는 빛을 아래 10X 20X 또는 목표를 사용하여 배 (胚)에 중점을두고 있습니다. </li><li> 60X 목표 (1.2 이상의 NA)로 전환하고 epifluorescence으로 표시 세포에 중점을두고 있습니다. 우리도 기름 침지 (UPLSAPO 60xO NA 1.35) 또는 물 침수 세례 (UPLSAPO 60xW NA 1.20) 렌즈를 사용합니다. </li><li> FV 소프트웨어 (버전 1.7c)에서 레이저 스캐닝을 시작하기 위해 XY 반복을 클릭합니다. </li><li> 조직의 손상을 방지하고 photobleaching 줄이기 위해 최소 (25 % 이하)에서 레이저 파워를 유지하면서 신호를 최적화하기 위해 수집 설정 및 이미지 수집 제어 (레이저 출력, 스캔 속도, HV, 이득 및 오프셋 레벨) 조정합니다. </li><li> Z - 시리즈를 얻기위한 단계의 크기와 함께, Z - 스택의 상단과 하단 한계를 설정합니다. 깊이 아이콘 XY 스위프 아이콘이 XY 및 Z 강조를 가지고 있으므로 종사 있는지 확인하십시오. XYZ 스위프 아이콘을 클릭하여 인수를 시작합니다. </li><li> 시간 경과 시리즈를 취득하려면 TimeScan 인수 설정 윈도우에서 제목 아래 시간 지점의 시간 간격과 번호를 설정합니다. XY 스위프 아이콘이 XY (Z)와 T 강조를 가지고 있도록 이미지 수집 제어 창에서 시간 아이콘을 클릭하십시오. XY (Z) T 스위프 아이콘을 클릭하여 인수를 시작합니다. </li><li> 또는 TimeController는 시간 경과를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 대용량 데이터 집합을 생성할 때 메모리 할당을 초과하지 않으므로이 프로그램은 유용합니다. 장치에서 TimeController 창을 엽니다. 새로운 이미징 작업을 만듭니다. 이미지 매개 변수 창이 열립니다. 수집 설정을 업데이 트 FV 상태 버튼을 클릭합니다. 확인 확실히 저장하고 종료 표제 아래 선택되어 삭제합니다. 출력 파일 이름을 설정하고 설정을 저장하고 창을 닫습니다. 시간이 지점의 원하는 시간 간격과 전화 번호를 설정하는 루프 기능을 사용하십시오. 준비 클릭하고 수집을 시작하려면 시작합니다. 일시 정지 및 Z - 시프트 기능을하는 동안 이미지를 집중할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 그림과 영화는 막 타겟 fluorophores 또는 굴지의 바이오 센서 프로브와 함께 표시 감각 뉴런과 신경 크레스트 세포의 예제를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 TG (ngn1 : GFP - caax)의 공촛점 이미지 (Z - 계획안). : mCherry - caax의 DNA 25 PG ngn1을 주입 유전자 변형 배아. mCherry - CAAX 라벨 라벨이 모든 Rohon - 비어드 감각 뉴런과 배경에 한 신경 세포 빨간색 (A) 그린 (B). 녹색과 빨간색 두 채널의 C) 합병 이미지. 스케일 바 = 50 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 공촛점 Z - 계획안 ~ 20 PG ngn1 주사 태아의 뉴런의 :.. mCherry - UtrCH의 DNA 16.5 HPF의 배아에서) Rohon - 비어드 감각 신경 세포. F - 굴지의 신호는 성장 콘 (화살촉)와 새로 형성된 axons 따라 라고나할까요에서 강해. B) 20 HPF의 배아에서 신경 세포가 브랜츠드 주변 축삭 (화살촉)와 좀 더 성숙 해 중앙에서 약한 신호의 성장 원뿔의 강력한 F - 굴지의 신호를 보여주는 axons (화살표). 스케일 바 = 50 μm의.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
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</ol>

주입된 DNA의 최적 농도는 구조 경험적으로 결정되어야하는 모터의 크기와 강도에 따라 달라집니다. 너무 작은 transgene 표현을 주입 배아의 아주 극소수의 결과되지만 너무 DNA의 사출은 광범위한 세포 죽음으로 건강하지 못한 배아 발생할 수 있습니다. DNA 표현 수준은 세포에서 세포로 다릅니다 형광단 신호의 강도와 연결합니다. epifluorescence 아래의 배아를 정렬하지만, 표현의 매우 높은 수준들을 제외할 수 있습니다. 매우 밝은 표시 라벨이 세포는 일반적으로 또한 비정상적 세포 형태, 태그 분자의 mislocalization 및 세포 사망과 같은 독성의 명백한 증거를 보여줍니다. 일반적인 DNA 주입이 영상에 적합합니다 배아의 50~10%을 산출. 높은 수준의 표현 때 F - 굴지의 바이오 센서는 주로 부정적인 방식으로 기능을 수 있습니다. 모터 구동 표현은 문제가있다면, 바이오 센서는 mRNA를 주사하여 ubiquitously 표현하실 수 있습니다. mRN...

<table><tbody><tr><td>트리케인 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter 플라스미드 Midi 키트</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 운동성 및 zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 cytoskeleton의 라이브 영상

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

zebrafish는 생체내 개발 중에 이미징 세포 행동에 대한 이상적인 모델입니다. Zebrafish의 배아는 외부 수정된 개발의 모든 단계에 따라서 쉽게 액세스할 수 있습니다. 또한, 그들의 광학 선명도는 그대로 배아의 자연 환경에서 세포와 분자 역학의 고해상도 이미징 수 있습니다. 우리는 신경 능선 세포의 연결을 마이 그 레이션 및 axons의 파생물 및지도하는 동안 세포 행동을 분석하는 라이브 이미징 방법을 사용하고 있습니다. 라이브 영상은 세포 운동성 프로세스를 조절 메커니즘을 이해하는 데 특히 유용합니다. 등 밀어내는 활동 및 분자 역학과 같은 세포 운동성 대한 자세한 내용을 시각화하기 위해서는 각각의 세포를 레이블에 유리합니다. zebrafish에서 플라스미드 DNA의 주입은 일시적 모자이크 표현 패턴을 산출 및 기타 셀 라벨 방법을 통해 독특한 혜택을 제공합니다. 예를 들어, 유전자 변형 라인은 종종 전체 세포 인구를 분류하고 있으므로 하나의 세포에서 미세 라고나할까요 (또는 분자 분포의 변화)의 시각화을 정확히 파악하기 어렵습니다. 또한, 한 세포 단계에서 DNA의 주입은 적게 침략 이후 단계에서 염료를 주사보다 더 정확합니다. 여기는 개별 개발 뉴런 또는 신경 크레스트 세포 및 이미징 생체내 그들의 행동을 라벨에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 모자이크 transgene 발현 결과 1 - 세포 단계의 배아로 플라스미드 DNA를 주입. 벡터는 세포 특정 발기인을 포함 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 일부에 대한 관심의 유전자의 드라이브 표현. 우리는 막 대상 GFP 또는 셀에 1을 생활에서 F - 굴지의 시각화을 허용하는 바이오 센서 프로브와 함께 레이블 세포의 예제를 제공합니다. 에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이이 작품에 동등하게 공헌했습니다.

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

제브라피시는 생체 내(in vivo) 발생 과정 중 세포 행동을 이미징하기 위한 이상적인 모델입니다. 제브라피시 배아는 외부 수정이 이루어지므로 쉽게...

생체 내 개별 세포의 행동을 이미징하기 위해, 플로라 4(flora four) 또는 바이오센서의 발현을 유도하는 세포 특이적 프로모터를 포함하는 플라스미드 DNA를 제브라피쉬 배아에 주입합니다. utrophin의 F-actin 결합 도메인 기반 바이오센서를 사용하여 F-actin 분포의 동적인 변화를 생체 내에서 시각화합니다. 새로 수정된 배아들을 주입 슬라이드를 따라 정렬하고, 상단 및 하단 슬라이드 사이에 형성된 모서리에 위치시킵니다.형광 단백질 또는 바이오센서를 인코딩하는 DNA를 세포 내로 주입합니다. 다음 날, 배아를 agarose에 고정합니다.이미징 슬라이드 위에서 배아의 표지 세포가 아래로 향하도록 배치하고, 커버 슬립으로 챔버를 밀봉합니다. 안녕하세요, 저는 위스콘신 대학교 매디슨의 동물학 및 해부학 학과와 Mary Hallin 연구실의 Erica Anderson입니다. 저는 같은 Hallin 연구실의 Nam Tauri입니다.저는 Hallin Lab의 Matt Clay입니다. 오늘 저희는 제브라피시 배아 내에서 개별적으로 라벨링된 세포를 실시간으로 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 축삭 성장 및 신경능세포 이동 과정 중의 세포 운동성과 액틴 역학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. 먼저 주입 슬라이드를 조립하기 위해, 제조사의 지침에 따라 cyl guard silicone elastomer를 준비하십시오. elastomer base 10부와 경화제 1부를 혼합합니다.실린더 가드(cyl guard)를 사용하여 표준 유리 현미경 슬라이드 3개를 함께 접착하십시오. 두 개의 슬라이드를 긴 가장자리가 서로 맞닿게 나란히 배치하십시오. 세 번째 슬라이드에 ARD를 도포한 후, 이를 나머지 두 슬라이드 위에 배치하십시오.슬라이드 사이로 과하게 흘러나오지 않도록 적당량의 cigar를 사용하여 슬라이드를 밀봉하십시오. 과하게 도포된 부분은 다음 날 면도날로 제거할 수 있습니다. 이미징 슬라이드용 SIL 가드가 하룻밤 동안 굳도록 둡니다.표준 유리 현미경 슬라이드와 동일한 크기로 절단되고 중앙에 1.5 cm 구멍이 뚫린 스테인리스 스틸 직사각형 판을 사용합니다. 22 mm² 크기의 커버슬립을 syl guard를 사용하여 스틸 직사각형 판에 부착합니다. 주입용 슬라이드와 이미징용 슬라이드는 모두 재사용 가능하며, 배아를 주입하기 전 70% ethanol로 세척한 후 물로 헹구어 사용할 수 있습니다.DNA를 최종 농도 10에서 50 µg/mL로 희석하십시오. 0.2% 페놀 레드(phenyl red) 수용액에 DNA를 넣습니다. 페놀 레드는 주입 중에 시각적 확인을 가능하게 합니다.다음으로, 니들을 채우고 교정합니다. 모세관 니들에 약 수 µL의 DNA 용액을 역충전합니다. 니들이 완전히 채워질 때까지 기다린 후, 정밀 핀셋을 사용하여 주입 장치의 니들 홀더에 삽입합니다.바늘 끝의 개구부 직경이 약 10 µm가 되도록 바늘 끝을 부러뜨립니다. 접안 마이크로미터를 사용하여 미네랄 오일 내 액적의 직경을 측정합니다. 주입 부피를 계산하기 위해 피코 스프리처(pico spritzer)의 지속 시간 설정을 조절합니다.따라서 액적의 직경은 0.12 µm이며 부피는 약 1 nL입니다. 지속 시간은 일반적으로 10에서 30 ms입니다. E3 배지에서 1세포기 배아를 수집하여 약 30에서 60개의 배아를 주입 슬라이드로 옮깁니다.배아를 상단 슬라이드의 가장자리를 따라 배치하고, 굽은 해부 핀을 사용하여 배아가 표면 장력으로 슬라이드에 고정될 수 있도록 E3 배지의 대부분을 제거합니다. 세포가 주입용 슬라이드의 벽면에 닿도록 배아를 회전시킵니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 배아의 난막과 난황을 통과시켜 배아의 단일 세포 내로 안내합니다.0.5에서 1 nL의 DNA 용액을 세포에 주입합니다. 주입된 배아를 E3 배지가 담긴 페트리 접시에 옮기고 28.5 °C 인큐베이터에 넣습니다. 필요한 경우, 주입 다음 날 배아를 더 낮은 온도에서 배양하여 발달 속도를 늦출 수 있습니다.배아가 이미징을 위한 원하는 연령에 도달하기 약 1시간 전에 이미징 준비를 수행합니다. 미세 핀셋을 사용하여 배아에서 CORs를 제거합니다. 일반적으로 수정 후 약 14에서 17시간 된 배아부터 이미징을 시작합니다.다음으로, 형광 장치가 장착된 해부 현미경을 사용하여 라벨링된 세포가 있는 배아를 선택합니다. 긴 작동 거리와 고배율이 결합된 특성 때문에 Nikon a Z 100 현미경에 Forex 대물렌즈를 사용합니다. 약 50 µL의 V three가 담긴 마이크로 퓨지 튜브에 배아를 넣습니다. 와이드 보어 유리 피펫을 사용하여 trica 스톡과 녹인 1% low melting point agros를 첨가하여 trica의 최종 농도가 0.02%가 되도록 합니다.agar 방울에 담긴 배아를 agar가 굳기 전에 즉시 이미징 슬라이드의 커버 슬립으로 옮깁니다. 이때 표지된 세포가 있는 부위가 바닥 커버 슬립을 향하도록 배아의 위치를 잡습니다. 다음으로 이미징 챔버를 조립합니다. 플라스틱 링의 한쪽 면에 실리콘 진공 그리스를 도포한 후, 이를 금속 이미징 장치에 부착합니다.링의 반대편에 그리스를 얇게 바릅니다. 10 millimolar HEPES와 0.02% Triton X-100이 포함된 E3 용액으로 챔버를 채웁니다. 22 mm² 크기의 커버슬립을 링 상단의 그리스가 도포된 표면에 고정하여 챔버 상단을 밀봉합니다. 이제 배아는 다음 섹션에서 설명할 4D 이미징을 위한 준비가 완료되었습니다.이미지 획득에 관한 세부 사항은 사용 중인 현미경 시스템의 사양에 따라 달라집니다. 여기서는 Olympus FB 1000 공초점 현미경을 이용한 타임랩스 획득 과정을 설명합니다. Zeiss LSM five 10 공초점 시스템을 이용한 타임랩스 획득 방법은 이전 JO 프로토콜을 참조하십시오.이미징 챔버를 현미경 스테이지의 슬라이드 홀더에 놓고 10 x 또는 20 x 대물렌즈를 사용하여 배아에 초점을 맞춥니다. 투과광 상태에서 수치구경(numerical aperture)이 1.2 이상인 60 x 대물렌즈로 전환하고, FV 소프트웨어의 에피 형광(epi fluorescence) 기능을 사용하여 라벨링된 세포에 초점을 맞춥니다. xy repeat를 클릭하여 레이저 스캐닝을 시작합니다.Z 시리즈를 획득하기 위해 이미지 획득 설정 및 이미지 획득 제어 항목을 조정하여 최적화하십시오. Z축의 상한 및 하한 범위와 스텝 크기를 설정하십시오. 이미지 획득 제어 창에서 depth 아이콘을 활성화하고 XY, Z suite 아이콘을 클릭하여 타임랩스 시리즈 획득을 시작하십시오.타임 스캔(time scan) 항목에서 시간 간격과 시간 지점 수를 설정하십시오. 획득 설정 창의 헤더에서, 이미지 획득 제어 창의 시간 아이콘을 클릭하고 XYZT 수트 아이콘을 클릭하여 획득을 시작하십시오. 여기에서는 라벨링된 개별 세포의 대표적인 동영상과 이미지를 제시합니다.개별 뉴런을 라벨링하면, 다른 라벨링된 세포들에 의해 축삭이 가려지지 않으므로 축삭과 성장 원추(growth cone) 위의 OD 돌기가 명확하게 보입니다. 이 영상은 막 표적 태그 RFP로 라벨링된 감각 뉴런을 보여줍니다. 이 뉴런은 시야 밖으로 뻗어 나가는 서로 반대 방향의 두 축삭을 확장합니다.세 번째 축삭이 세포체에서 직각으로 뻗어 나와 분지를 형성합니다. 마찬가지로, 개별 신경능세포를 표지하면 세포 이동과 관련된 미세한 세포 돌기를 이미지화할 수 있습니다. 여기서는 두 개의 신경능세포가 막 표적 GFP로 표지되어 있습니다.이들은 전방 방향으로 이동하는 동안 광범위한 돌출 활동을 보입니다. 집단 내 인접한 세포 간의 상호작용을 시각화하기 위해서는 형질전환 라인 내의 개별 세포를 표지하는 것이 유용할 때가 많습니다. 이 이미지는 모든 감각 신경세포에서 GFP가 안정적으로 발현되는 배아에 RFP 태그를 인코딩하는 DNA를 주입하여, 녹색 신경세포 배경 속에서 하나의 신경세포를 붉은색으로 표지한 모습입니다.액틴 바이오센서 프로브는 세포체와 비교했을 때 성장 원추와 새로 형성된 축삭을 따라 나타나는 동적 돌출부에서 더 강한 신호 효과를 보입니다. 이후 단계에서는 성장 원추의 신호는 강하게 유지되는 반면, 성숙한 축삭의 신호는 현저히 약해집니다. 지금까지 제브라피쉬 배아에서 개별적으로 표지된 뉴런과 신경능선 세포의 라이브 이미징을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 독성이나 세포 사멸을 유발할 만큼 DNA가 높게 발현되지 않은 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

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생물학

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개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

출처: Williams, A. L., et al. 실시간 발달을 시각화하기 위한 다광자 타임랩스 이미징: 제브라피시 배아에서 이동하는 신경 능선 세포의 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 제브라피시 배아의 신경능선 세포의 이동을 고해상도로 실시간으로 시각화하기 위한 다광자 타임 랩스 이미징 프로토콜을 보여줍니다.

다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

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여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

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우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

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여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

배우세요 제브라피시 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포를 형광 공초점 현미경으로 실시간 영상화하는 방법입니다. 이 기법은 세포 운동성과 액틴 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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