로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

이 절차에서는 로봇 공학을 사용하여 시간이 지남에 따라 식물 조직의 유전자 발현 역학을 이미지화하고, 먼저 리마 콩 씨앗을 살균하고 발아를 위해 조직 배양 용기의 축축한 종이 타월 사이에 놓습니다. 4일 후, Coan을 제거하고 Petri 접시에 넣은 GFP Coan에 융합된 프로모터를 포함하는 DNA 구조체로 폭격을 가하여 2차원 맞춤형 로봇 이미지 수집 시스템에 장착합니다. 이 로봇은 100시간 동안 매시간 각 조직 조각의 이미지를 캡처하도록 프로그래밍되어 있습니다.

이미지는 이미지 분석, 시간 경과에 따른 GFP 발현 강도에 대한 정량적 데이터를 받습니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립 대학의 원예 및 작물 과학과의 식물 변형 연구소 소장인 John Finer입니다. 저는 오하이오 주립 대학의 마지막 실험실에서 박사 과정을 밟고 있는 Carlos Herandez Garcia입니다.

오늘 Carlos는 녹색 형광 단백질을 사용하여 유전자 발현 및 식물 조직을 분석하기 위해 개발한 프로토콜을 보여드리겠습니다. 우리는 OD 활성의 변형을 측정하기 위해 실험실에서 개발한 이 절차를 사용합니다. 이것을 하기 위하여는, 우리의 기자 유전자인 GFP 유전자의 상류에 우리의 첫번째 왕관은 발기합니다.

리마 광맥 촉매(Lima vein Cataly)에 프로모터 제어를 도입하고 맞춤형 설계 로봇 이미지 캡처 시스템에 앱을 보내는 방법을 보여드리겠습니다. 이미지 분석을 위한 프로토콜에 대해 살펴보는 것으로 마무리하겠습니다. 그래서 가자,이 절차를 시작하려면 표준 절차를 사용하여 표면 살균 된 리마 콩 씨앗.

살균 된 씨앗을 축축한 종이 타월과 종이 타월 층 사이의 자홍색 GA 7 개 용기에 넣고 섭씨 25 도에서 4 일 동안 배양합니다. 여기서는 promoter 및 promoter element 분석에 유용한 high copy number expression vector를 사용합니다. 이 벡터에는 GFP 유전자가 포함되어 있으며, 이 유전자는 포격 약 1-2시간 전에 형질전환된 조직에서 promoter 또는 promoter element 기능을 시각화하는 데 사용됩니다.

종자 코트에서 리마 콩 CU 리드인을 소비합니다. 포격에 적합한 CU leadin은 황색에서 연한 녹색이어야 하며, pH 5.7에서 MS 염 B 5가지 비타민, 3% 자당 및 0.2% 젤 비율을 포함하는 OMS 배양 배지가 있는 Petri 접시에 12cu leadin을 절제 직후 추가 이미지 분석을 방해할 수 있는 손상이 없어야 합니다. 다음으로, DNA 구조체를 M 10 텅스텐 입자에 침전시킵니다.먼저, 사용 직전에 입자를 밀리리터 당 100 밀리그램의 농도로 멸균 수에 재현탁시킵니다.

그런 다음 0.6 밀리리터 퍼지 튜브에 25 마이크로 리터의 입자, 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램의 DNA 5 마이크로 리터, 2.5 몰 염화칼슘 25 마이크로 리터 및 10 밀리 몰 정자 10 마이크로 리터를 추가합니다. DNA 제제를 얼음에서 5분 동안 배양한 다음 입자 위에 있는 용액 50마이크로리터를 제거하고 버립니다. 와류에 의해 튜브 바닥에 남아 있는 DNA 코팅 입자를 다시 현탁시킵니다.

그리고 와류 직후 2 마이크로 리터 Eloqua를 제거하십시오. 이 와류 단계를 반복합니다. Eloqua를 제거할 때마다 코팅된 입자를 얼음 위에 보관하고 15분 이내에 사용해야 합니다.

이제 DNA가 입자에 코팅되었으므로, 필터 스크린 중앙에 있는 주사기 필터 상단을 통해 2마이크로리터의 입자를 배치합니다. 그런 다음 주사기 필터를 입자 유입 건 또는 PIG 챔버 내부의 필터 고정 장치에 놓습니다. 리마 콩 공동 리드를 비이커 바닥까지 녹은 스크린으로 구성된 배플의 축 방향이 위로 향하게 놓습니다.

입자 총 챔버에 폭격 중 조직을 지지하는 플랫폼으로 사용되는 배플을 배치합니다. 조직에 충격을 가하려면 먼저 진공으로 이어지는 밸브를 열어 챔버를 비우십시오. 진공이 수은 760mm에 도달하면 솔레노이드를 활성화하고 헬륨을 방출하여 입자를 추진합니다.

입자를 가속하는 데 사용되는 헬륨 압력은 50-60 PSI입니다. 입자 충격 후 진공 라인 밸브를 닫고 배기 밸브를 사용하여 진공을 해제하십시오. 진공이 해제되면 챔버 도어를 열어 포격된 co leadin을 회수하고 co leadin을 dal 쪽으로 되돌립니다.

정량화 및 발현 프로파일링을 위한 최대 OMS 배양 배지. 모든 DNA 구성에 대해 최소 3개의 co leadin을 폭격합니다. 잘 연구된 유전자 발현 프로파일을 제공하는 양성 대조군도 포함됩니다.

이제 공동 leadin이 이미징 준비가 되었습니다. 수은 램프를 켜고 램프가 예열될 때까지 30분 동안 기다립니다. SPOT R-T-C-C-D 카메라와 모터 컨트롤러의 전원을 켜서 8개의 플레이트를 수용하는 맞춤형 로봇 플랫폼의 움직임을 구동합니다.

MZ L 3 해부 현미경에서 480나노미터 여기 및 510나노미터 방출에서 GFP 2 필터 세트를 선택하여 GFP 검출을 위한 필터 세트를 설정합니다. 다음으로, 두꺼워진 폴리카보네이트 페트리 접시 뚜껑을 70% 에탄올을 분사하여 살균합니다. 페트리 접시 바닥을 덮는 데 사용되는 특수 뚜껑은 이미지 수집 중 결로 현상을 방지합니다.

Bombarded cuan이 포함된 플레이트를 로봇 플랫폼에 놓고 측면 고정 나사를 조여 제자리에 고정합니다. 이제 로보틱스 플랫폼과 이미지 획득을 모두 제어하는 맞춤형 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다. 또한 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 백색광 컨트롤러 스위치를 열고 플랫폼을 홈 위치로 향하게 합니다.

이것은 포지션에 들어가기 전에 수행됩니다. 모터 탭의 모든 코들 리드인에 대해 첫 번째 플레이트를 선택합니다. 이 플랫폼은 페트리 접시의 중심을 현미경의 대물렌즈 아래에 배치합니다.

이동 거리 버튼을 사용하여 이미지 수집을 위한 첫 번째 CU LEADIN을 정확하게 배치합니다. 라이브 모드 기능을 사용하여 포옹 리드를 적절한 view잉 영역 첫 번째 포옹 리드의 경우 해부 현미경의 수동 손잡이를 사용하여 초점을 설정하고 배율을 1.6 x로 설정합니다. 관심 영역이 설정되면 이 위치 추가 버튼을 클릭합니다.

소프트웨어는 이 영역의 좌표를 위치 스케줄 파일에 추가하고 플랫폼은 플레이트의 나머지 모든 코엔에 대한 플레이트 세트 위치의 중심으로 돌아갑니다. 이동 거리 버튼을 사용하여 로봇 플랫폼의 각 플레이트 아래에 있는 세 개의 수동 레벨링 나사를 사용하여 동일한 플레이트의 나머지 coan에 대한 초점을 조정합니다. 모든 석탄의 모든 좌표를 입력한 후 위치 일정 좌표를 저장합니다.

GFP 및 노출 설정에 대해 파란색인 빛의 유형과 같은 이미지 수집 매개변수를 입력하고 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 이미지를 저장할 위치를 지정합니다. 캡처 시간 제어 탭으로 이동하여 이미지 획득 시간 간격과 이미지 컬렉션의 총 주기 수를 설정합니다. 이미지는 일반적으로 100시간 동안 매시간 수집됩니다.

잘 정의된 유전자 발현 프로파일을 생성합니다. Position Schedule(위치 일정) 탭을 열고 Run schedule(실행 일정) 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 100시간 이미지 수집이 끝나면 이미지 수집 시스템을 외부 조명으로부터 격리합니다.

각각 약 5MB의 고해상도 이미지는 이미지 분석에 사용할 준비가 되어 있습니다. 이미지 준비를 사용하여 각 폴더에서 100개의 순차적 이미지를 조합합니다. 모든 순차적 이미지를 프레임으로 가져오고 800 x 600 픽셀로 크기를 조정하여 이미지 처리 속도를 높입니다.

다음으로, 모든 프레임에서 볼 수 있고 이미지 참조에서 선택한 GFP 스폿을 사용하는 새로 도입된 레이어에 마크를 사용합니다. 정렬이 완료되면 각 이미지를 수동으로 정렬하고 참조로 사용된 레이어를 삭제하고 파일을 단일 PSD 파일로 저장합니다. 또한 모든 프레임을 가장 높은 해상도를 사용하는 단일 MOV 파일로 내보냅니다.

이제 파일이 GFP 정량화를 시작할 준비가 되었습니다. 이미지 J를 사용하여 MOV 파일을 열고 400 x 300 픽셀 영역을 자릅니다. 그런 다음 빨간색 및 녹색 채널에 대한 RGB 분할 도구를 사용하여 순차적 이미지를 빨간색, 파란색 및 녹색 채널로 분리합니다.

각 slice plugin 툴에 대해 측정된 ROI를 빼서 배경 형광을 뺍니다. 임계값 수준을 조정하고 픽셀당 평균 그레이 스케일 값과 GFP 발현 픽셀의 총 수를 측정하도록 설계된 플러그인을 사용하여 GFP 표현식을 계산합니다. 이미지 J의 출력 값을 복사합니다.마지막으로 녹색 및 빨간색 채널의 출력 값을 Microsoft Office에 붙여넣습니다.

이미지 정렬 결과에 대한 아이디어를 제공하기 위해 추가 데이터 조작을 위한 Excel입니다. 이 첫 번째 애니메이션은 100시간 실험 중 로봇 플랫폼 재배치의 부정확성을 보여줍니다. 스폿 이동은 수동 이미지 정렬 후 각 시점에서 정확히 동일한 위치로 돌아갈 수 있는 로봇 플랫폼의 무능력으로 인해 발생하는 아티팩트이며, GFP 발현 세포를 쉽게 관찰할 수 있으며 이 추적 시스템의 고유한 기능을 쉽게 시각화할 수 있습니다.

이 애니메이션이 반복되는 것처럼, 원형으로 표시된 세포를 발현하는 GFP는 빨간색으로 원으로 표시된 세포는 포격 후 18-20 시간에 발현의 매우 급격한 감소를 보여주는 반면 흰색으로 원으로 표시된 세포는 GFP 발현의 지연된 시작을 보여줍니다. 애니메이션 외에도 이 절차를 통해 리마 콩 표적 조직에서 시간 경과에 따른 GFP 발현을 빠르게 정량화할 수 있습니다. 이러한 대표적인 결과는 CAMV 35 S promoter와 4개의 서로 다른 대두 promoter를 사용하여 promoter intensity를 비교한 정량화를 보여줍니다.

우리는 방금 발아의 카탈린에 DNA를 도입하는 방법을 보여 드렸습니다. 리마 정맥 씨앗은 로봇에 카탈린을 배치하고 이미지 분석을 위한 이미지를 수집하고 해당 이미지를 분석합니다. 우리는 클론 식물 프로모터를 검증하기 위해 실험실에서 이 절차를 일상적으로 사용합니다.

다른 식물 프로모터의 도입으로 많은 양의 데이터를 생성할 수 있습니다. 그러나이 절차는 신선한 라인 콩 종자로 시작하거나 적어도 적절하게 저장된 고품질 종자를 사용하는 것이 중요할 때 잘못 될 수있는 많은 단계로 복잡합니다. 또한 Bombard 절단 뚜껑을 가져와 로봇에 신속하게 설치하고 두꺼운 애완 동물 접시 뚜껑을 사용하여 결로 문제를 최소화하는 것도 중요합니다.

마지막으로, 우리가 사용하는 GFP는 하버드 대학의 프론트 Gen HIN Lab인 SGFP라는 또 다른 버전입니다. 이 GFP는 매우 안정적이지 않으며 유전자 발현의 급격한 변화를 추적하는 데 더 좋을 수 있습니다. 그리고 그것은 우리를 지켜봐 준 itra 우리입니다.

그리고 당신의 실험에 행운을 빕니다.