Name: 로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 배우세요 식물 조직에서 GFP 유전자 발현을 로보틱스 시스템으로 100시간 동안 동적 이미징하는 방법을. 이 프로토콜은 고효율 정량 분석과 프로모터 검증에 활용됩니다.

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급여 및 연구 지원은 미국의 대두위원회에서 제공하고, 오하이오 주립 대학 / 오하이오 농업 연구 개발 센터 appropriated 주 및 연방 기금에 의해 하였다. 이 연구는 부분적으로 CMHG에 CONACYT 멕시코에서 친교에 의해 지원되었다. 상표 또는 독점적 제품의 언급은 OSU / OARDC에 의해 제품의 보증이나 보증을 구성하지 않고도에도 적합 다른 제품의 배제에 승인을 의미하지는 않습니다. 저널 기사 없음 HCS 09-17.

다음 방법론은 자동 이미지 수집 시스템을 사용하여 유전자 발현의 이미지 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다. 설명의 편의를위한, 전반적인 접근 방법은 네 단계로 나눠되었다 : 1) 종자 준비, 2) 유전자 도입을 입자 충격, 3) 로봇 이미지를 수집하고, 4) 이미지 분석을 사용합니다. 이 일반적인 방법론이 다른 어플 리케이션의 넓은 범위에 사용할 수 있지만, 프로토콜의 현재 세트 같은 작품에서 추적 유전자 발현에 대한 유용한 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자의 사용에 기반 시간이 지남에 따라 생활의 조직. I. 시드 준비 <ol><li> 리마콩 (. Phaseolus lunatus CV 헨더슨 - 부시) 씨를 구입, 또는 이상 성장 챔버의 재배 식물 (50 % 상대 습도, ​​8분의 16 H 조명 : 어두운, 23분의 25 ° C 주 / 야)에서 수확 수 있습니다. 수확 후 종자의 품질은 -20 ° C.에 저장 종자에 의해 유지 수 있습니다 </li><li> 씨를 germinating위한 마젠타 GA7 용기를 준비합니다. 폴드 필터 종이 또는 종이 타올 마젠타 상자의 하단에 들어갈 수 있습니다. 종이 타월을 축축하게하다, 그리고 unabsorbed 물을 부어 각 컨테이너에 ~ 25 ML 탈이온수를 추가합니다. 압력솥 20 분 종이가 들어있는 상자를 moistened. </li><li> 50 ML 일회용 원심 분리기 튜브를 사용하여, 60 RPM에서 자이 러 토리 쉐이크에 떨고있는 20 분 10 % 상용 표백 용액 (20-40 ML 20 씨앗)의 종자를 소독. 참고 : 이후의 모든 단계가 층류 후드에서 수행되어야합니다. </li><li> 각 린스 중 30 초에 대한 부드러운 교반과 멸균 탈이온수와 씨앗에게 4-7 번 씻어. </li><li> 각 멸균 마젠타 상자에있는 접힌 종이의 층 사이에 5-6 살균 씨앗을 놓으십시오. </li><li> 25 ° C, H 빛을 8분의 16 : 어두운 40 μEm -2 -1의 다음과 같은 조건에서 4 일간 씨를 품어. </li></ol> II. 입자 충돌을 사용하여 유전자 소개 <ol><li> 생활 조직에서 모니터링할 수 있습니다 리포터 유전자로 좋아하는 발현 벡터를 사용하여 유전자 구조를 빌드합니다. 우리는 모터와 모터 요소 분석을위한 높은 사본 번호 발현 벡터 유용한 설계했습니다. 이 벡터는 프로 모터 / 변형 조직에 발기인 요소 기능을 시각화하는 데 사용되는 GFP의 유전자를 포함하고 있습니다. </li><li> 1-2 주변 모종을 germinating에서 폭격, 엑사이스 리마 콩 cotyledons 전에 H와 종자 외피를 제거합니다. 충격에 적합 Cotyledons은 녹색 평면 및 추가 이미지 분석에 방해가 수있는 손상을 무료로 빛을 노란색해야합니다. </li><li> MS 소금 1, B5 비타민 2, 즉시 excised 후 3 % 자당 및 0.2 % Gelrite (산도 5.7)이있는 OMS 문화 매체에 플레이스 cotyledons. </li><li> DNA가 M10 텅스텐 입자 (실바니아, 토완다, PA, 미국)에 구축 침전물. 0.6 ML의 microfuge 관에서, 25 μl 텅스텐 입자 (입자가 바로 사용하기 전에, 멸균 물, 100 MG ML -1에 resuspended됩니다) 5 μl DNA (1 μg의 μl -1), 25 μl 2.5 M의 염화칼슘 (시그마를 추가 - 알드리치 고양이. C3881 - 500G) 10 μl 100 MM spermidine (시그마 고양이. S - 2626). 소용돌이 간략 모든 구성 요소를 철저를 혼합합니다. </li><li> 5 분 얼음의 DNA 준비를 품어. 그런 다음 제거 50 μl 뜨는을 삭제. </li><li> vortexing하여 DNA - 코팅 입자를 Resuspend 즉시 2 μl 나누어지는를 제거합니다. 이 vortexing 단계에게 나누어지는이 튜브에서 제거됩니다 때마다 반복합니다. 코팅 입자가 얼음에 보관하고 15 분 이내에 사용해야합니다. </li><li> 필터 화면의 중간에 주사기 필터의 상단에, 장소를 통해 2 μl 코팅 입자. 입자 총 챔버 내부의 필터 지주 단위로 코팅된 입자를 포함하는 필터 장치를 놓습니다. </li><li> 배플에 리마콩 떡잎 adaxial 측면을 놓고 입자 총 챔버에 배플을 놓습니다. 비커의 바닥에 녹아있는 화면으로 구성되어 있습니다 배플은, 폭격하는 동안 조직을 지원하는 플랫폼으로 사용됩니다. </li><li> 입자 건 (이 방법에서 우리 연구실에 설계된 간단하고 저렴한 입자 인플로 건 3, 돼지를 사용)를 사용하여 충격 조직은 다음과;) 후 챔버 대피하기 위해 진공 이어지는 밸브, B)을 엽니다 진공 입자 충돌 후, 진공 라인 밸브를 닫고 배기 밸브를 사용하여 진공을 해제 760mm (30) HG, 솔레노이드를 활성화하고 입자를 추진하기 위해 헬륨을 출시, C)에 도달합니다. 입자를 가속하는 데 사용되는 헬륨 압력은 50 PSI입니다. </li><li> 진공이 릴리스 후, 폭격을 cotyledons를 검색하고 OMS 문화 매체, 최대 떡잎, adaxial 측면을 반환합니다 챔버 문을 엽니다. 참고 : 부량와 표현 프로 파일링 들어, 우리가 일반적으로 모든 DNA 구조 세 cotyledons 최소 도배. 일반적으로 DNA는 긍정적인 관리,잘 공부 유전자 발현 프로필을 준 구축, 참조로 포함됩니다. </li></ol> III. 자동 이미지 콜렉션 <ol><li> 수은 램프를 켜고 따뜻하게하는 램프에 대해 30 분 기다립니다. </li><li> 그 자리 - RT CCD 카메라 (진단먼트 주식 회사, 스털링 헤이츠, MI, 미국)과 로봇 플랫폼의 움직임을 드라이브 로봇 플랫폼 모터 컨트롤러에 대한 전원을 켭니다. </li><li> MZFLIII 해부 현미경에 (Leica, Heerbrugg, 스위스), GFP 감지 (예 40분의 480 NM, 엠 510 LP.. GFP2 필터 설정)에 대한 필터 설정을 설정합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 분사하여 걸쭉하게 폴리 카보 네이트 페트리 접시의 뚜껑을 소독. 페트리 접시의 기본 이미지 모음 4 중 결로 방지 커버하는 데 사용되는 전문 뚜껑. </li><li> 자동 이미지 수집 시스템의 로봇 플랫폼 (Arrick 로봇, 허스트, TX, 미국)에 폭격 cotyledons가 들어있는 접시를 놓습니다. 로봇 플랫폼은 스테핑 모터 세트에 의해 구동과 8 배양 접시의 첨부 파일 테이블로 구성되어있다. 플랫폼은 폴리 카보 네이트, 폴리 프로필렌과 알루미늄 구성되어 있습니다. 접시는 측면 플라스틱 세트 나사를 강화하여 위치에 고정됩니다. </li><li> 로봇 플랫폼과 이미지 수집을 모두 제어하는​​ 사용자 지정 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다. 또한, 소프트웨어 하얀 빛을 컨트롤러 스위치를 엽니다. </li><li> "모터 모션 '탭에서'에 모터 '및'모터 홈"을 클릭하십시오. 소프트웨어가 홈 위치로 플랫폼을 orients 후, 우리는 모든 떡잎에 대한 위치를 입력 시작할 수 있습니다. </li><li> "모터 모션 '탭에서, 첫 번째 접시를 선택합니다. 플랫폼은 현미경의 목표 아래 페트리 접시의 중앙에 위치합니다. 이동 거리 버튼을 사용하여 정확하게 이미지 컬렉션의 첫 번째 떡잎 위치를. 에 하얀 빛을 컨트롤러, 대상 지역은 "라이브 모드"기능을 설정하여 컴퓨터 모니터를 통해 볼 수 있습니다. </li><li> 최초의 떡잎은 해부 현미경에 관한 매뉴얼 손잡이를 사용하여 초점과 배율 (1.6x 배율 선호)으로 설정합니다. 같은 접시에 남아있는 cotyledons에 대한 초점 조정은 로봇 플랫폼에서 각 접시 아래에있는 세 수평 나사를 사용하여 만들어집니다. </li><li> 관심 영역이 설정되면, "이 위치 추가"버튼을 클릭하십시오. 소프트웨어는 위치 일정 파일에이 지역의 좌표를 추가하고 플랫폼 판의 중심으로 돌아갑니다. </li><li> 위치를 설정하고 이동 거리 버튼과 수동 수평 나사를 사용하여 접시에 모든 나머지 cotyledons에 대해 중점을두고 있습니다. 모든 cotyledons의 모든 좌표가 입력되고 나면, 위치 일정 좌표를 저장합니다. </li><li> 이미지 모음 매개 변수를 입력합니다. 흰색 또는 파란색, "이미지 설정"탭에서, 라이트 원하는 유형을 선택합니다. GFP 감지 들어, 푸른 불빛을 사용해야합니다. 또한, 노출 설정을 입력합니다. 우리가 빨강, 파랑과 녹색 색상 독립적으로 노출 시간을 수정할 수 있지만, 우리는 일반적으로 우리가 직접 만들 수 있도록 GFP 사진 문서 (20, 14 각각 빨간색, 녹색 및 파랑 채널, 14 초)에 대해 동일한 설정을 사용 다른 DNA 구조 사이에 일관성을 비교. </li><li> 같은 "이미지 설정"탭에서 이미지가 저장됩니다 빈 폴더를 지정합니다. 이미지의 모든 시리즈는 cotyledons에 입력한 위치의 순서에 따라 순차적으로 번호가 독립 폴더에서이 마스터 폴더 내에 저장됩니다. </li><li> "캡처 시간 관리 '탭으로 이동하여 이미지를 수집 시간 간격 및 이미지 수집주기의 총 수를 설정합니다. 이미지는 일반적으로 잘 정의 유전자 발현 프로파일을 생성, 100 H에 대해 매 시간마다 수집하고 있습니다. </li><li> 클릭하여 이미지 획득을 시작 "실행 일정!" "위치 일정"탭에서에 위치한 버튼을 클릭합니다. </li><li> 100 H 이미지 컬렉션의 끝에 추가 이미지 분석을위한 대용량 하드 드라이브 또는 컴퓨터로 로봇을 제어하는​​ 컴퓨터에서 이미지를 전송합니다. 고해상도 이미지 (1600 X 1200 픽셀) ~ 5 MB 각을 측정 TIF 파일로 저장됩니다. </li></ol> IV. 이미지 분석 <ol><li> 어도비 ImageReady를 사용하여 각 폴더에서 100 순차 이미지를 조립. <ol><li> ImageReady를 열고 프레임으로 시리즈를 구성하는 모든 순차 이미지를 가져옵니다. </li><li> 800 × 600 픽셀 원본 이미지 크기를 조정할 수 있습니다. 수집된 이미지가 이미지 처리가 느리 수 대용량 파일을 생성 고해상도입니다. </li><li> 이미지 스크롤 대부분의 이미지에서 볼 수 자리 (들)을 찾습니다. </li><li> 선택된 지점 (들)에는 300 %까지 확대할 수 있습니다. 높은 배율을 사용하여 이미지 정렬보다 정확한 등록하실 수 있습니다. </li><li> 모든 이미지의 상단에 레이어를 삽입하고 있는지 모든 프레임에 표시됩니다하십시오. "페인트"도구를 사용하여 지점 (S) 위치를 표시합니다. </li><li> "이동"도구를 사용하여 모든 프레임을 정렬하고 참조로 레이어의 흔적을 복용 시작합니다. </li><li> 정렬이 완료되면, 참조로 사용되는 레이어를 삭제하고 단일 "PSD"파일로 이미지를 저장합니다. 또한, 가장 높은 해상도를 사용하여 단일 "MOV"파일로 모든 프레임을 내보낼 수 있습니다. 각 이미지 시리즈의 수동 정렬 ~ 10 분 정도 소요됩니다. </li></ol></li><li> ImageJ를 사용하여 유전자 발현의 부량을 수행합니다. <ol><li> 오픈 ImageJ 소프트웨어와 "MOV"파일을 열려면 ImageReady에서 이전에 저장한. </li><li> 선택 도구를 사용하여 400 X 300 픽셀 지역 작물 이미지를 선택합니다. 이 새로운 파일은 "AVI"파일로 저장해야합니다. </li><li> "이미지", "컬러"와 ImageJ에서 "RGB 분할"을 클릭하여 빨간색, 파란색 및 녹색 채널에 새로운 "AVI"파일에있는 순서대로 이미지를 분리합니다. </li><li> 녹색과 적색 채널의 모든 이미지에서 배경 형광을 빼기. 녹색 채널 이미지 시리즈를 사용하지 않는 표현 전지와 지역의 20 X 20 픽셀 영역을 선택하고 같은 지역을 두 채널에서 선택되도록, '투자 수익 (ROI) 관리자 "도구의 위치를​​ 기록합니다. 녹색 채널에 적극적인 20 X 20 픽셀 사각형으로 ImageJ의 작업 표시줄에있는 "플러그인"명령으로 이동 후 플러그인 - 도구 "각 슬라이스에 대한 투자 수익 (ROI) 측정 빼기"를 클릭하십시오. </li><li> ImageJ에서 "한계"GFP - 표현 픽셀을 정의하거나 세그먼트에 다음 "조정", "이미지"를 클릭합니다. 20-30 픽셀의 평균 스폿 크기를 얻기 위해 임계값 창에서 막대를 드래그하여 임계값 수준을 조정합니다. </li><li> 우리가 의미가 픽셀당 가치의 총 수를 GFP - 표현 픽셀을 회색 측정할 수 있도록 설계하는 플러그인을 사용하여 GFP 발현을 확인합니다. </li><li> 평균 출력을 복사는 Microsoft Office Excel로 ImageJ 및 붙여넣기에서 값을 그레이 스케일. 의미를 곱하여 각 채널 (빨간색과 초록색)의 GFP 발현을 계산하면 총 숫자로 픽셀당 가치를 그레이 스케일 GFP - 표현 각 채널에 대해 픽셀. 두 채널에 대한 표현 값의 합계는 GFP의 표현을 제공합니다. 값은 유전자 발현 프로파일을 설명하고 직접적인 비교를하는 데 사용할 수 있습니다. 시간 경과 애니메이션 또한 유전자 발현 프로파일의 독특하고 명확한 시각화를 제공하는 "MOV"또는 "AVI"파일을 사용하여 생성할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> V. 대표 결과 로봇 이미지 수집과 분석 절차 (그림 1) 여기에 짧은 기간의 유전자 발현에 대한 양적 데이터의 대량의 인수 허용했다. GFP 유전자를 사용하여 공장 모터 특성화 경우,이 방법은 일시적 표현 프로필을 만드는 방법 (그림 2)뿐만 아니라 transiently 및 안정 - 변형 식물 조직 5,6에서 자세한 - 방식의 GFP 발현의 추적 유용하지 않습니다. 수집된 연속 이미지를 생성 짧은 시간 - 저속 애니메이션 플랜트 조직에서 시간이 지남에 따라 유전자 발현에 대한 심층 분석을위한 유용한 도구입니다. 이 방법은 또한 직접적인 유전자 발현에 영향을 미칠 요인을 평가하기위한 훌륭한 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 바이러스 원산지 입을 다양한 진압의 존재 하에서 GFP 과도 표현이 성공적으로 우리의 자동 이미지 수집 및 분석 시스템 7,8을 사용하여 연구하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 이미지 분석 절차는 네 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. (A) 로봇 이미지 수집 시스템, 빨강, 파랑과 녹색 채널로 이미지 (B) 분리, 임계값 수준을 조정하여 표현하는 픽셀의 (C) 세분화, 및 (D)의 출력 결과를 얻기를 사용하여 이미지 시리즈의 취득 포함하는 가치와 GFP - 표현 초점 카운트를 그레이 스케일. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. GFP로 융합 식물 발기인에 의해 구동 다른 과도 표현 프로필을 보여주는 그래프. 데이터는 우리의 로봇 이미지 수집 시스템을 사용하여 수집하고 ImageReady와 ImageJ 소프트웨어로 분석했다.

<ol><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li>
<li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li>
<li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss+Org%22%5BJournal%5D)">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li>
<li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li>
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<li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li>
<li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li>
</ol>

로봇의 사용은 인간의 삶의 다양한 측면에서 큰 응용 프로그램을 가지고, 특히, 로봇이 효과적으로 지루하고 복잡한 활동을 자동화하고,보다 정확한 방법으로 작업을 수행하기 위해, 위험한 환경에서 활동을 수행하는 데 사용되었습니다. 분자 생물학, 그리고 특히 유전자 발현 분석에, 로봇은 유전자뿐 아니라 기능뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 조직의 성장과 발전을 추적할 수 있습니다. 많은 생물 학적 현상은 단일 시점의 관찰을 사용하여 수행하기 어려울 수있는, 동적으로 발생합니다. 표현 연구 GFP 유전자의 사용은 조직의 반응과 성장을 관찰에 대한 추가 혜택을 제공합니다. 우리의 실험 절차를 보려면, GFP는 우리 GFP 탐지가 아닌 파괴와 같이 시간이 지남에 따라 조직의 동일한 조각의 유전자 발현을 따르 수 있습니다. 또한, GFP 단백질의 우리의 버전 감지를 허용하도록 충분히 안정뿐만 아니라 우리가 상승과 유전자 표현의 가을을 모두 수행하므로 식물 조직의 축적을 최소화하기 위해 일부 매출을 보여줍니다. 우리는 이미 애플 리케이션의 광범위한 로봇 이미지 수집 및 분석 시스템을 활용했습니다. 우리는 현상의 역동적인 이해가 필요한 것입니다 많은 생물 학적 응용 프로그램에 대한 높은 가능성을 예견. 예를 들어, 식물 조직의 성장과 발전은 귀중한 통찰력 / 다음 프로세스에 대한 정보를주는 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 또한, GFP 같은 기자 유전자를 사용하여 단백질 수송의 역학은 시간 경과 애니메이션을 사용하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 이 보고서에서 설명하는 방법은 기술적으로 복잡하지만 개념적으로 간단합니다. 우리의 결과는 강력하고 새로운 어플 리케이션이 지속적으로 발견되고있다.

<table><tbody><tr><td>ImageJ</td><td>소프트웨어</td><td>미국 국립보건원</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

식물 조직의 유전자 발현은 일반적으로에 대한 식물의 조직에서 화합물의 파괴 추출하여 공부합니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 분석합니다. 방법은 여기에 녹색 형광 단백질 (활용 발표<em&gt; GFP</em시간이 지남에 따라 조직의 동일한 조각의 유전자 표현의 지속적인 모니터링&gt;) 유전자.<em&gt; GFP</em&gt; 유전자는 다른 발기인의 규제 통제하에 위치 및 입자 충돌을 통해 리마콩 cotyledonary 조직에 도입되었다. Cotyledons는 다음 디지털 카메라 및 문화 요리 보안 첨부 파일을 허용하도록 맞춤 설계된 2 차원 로봇 플랫폼과 형광 현미경의 해부 구성되어 로봇 이미지 수집 시스템에 배치했다. 이미지는 각 발기인에 대한 표현 프로파일을 생성하여 100 시간 동안 매 시간마다 cotyledonary 조직에서 수집되었다. 100 이미지의 각 수집 시리즈 처음으로 GFP가 - 표현 foci 것은 지속적으로 분석 선택한 필드 내에 유지 것을 확실히 ImageReady 사용하여 수동 이미지 정렬의 대상이되었다. 300 x 400 픽셀을 측정하는 일련의 특정 영역은 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 GFP의 강도 측정을 제공하기 위해 추가 분석을 위해 선택되었다. 배치 이미지는 빨강, 녹색 및 파랑 채널과 GFP - 표현 영역 것은 ImageJ의 문턱 기능을 사용하여 확인되었습니다. 나뉘어 있었다 배경 형광 공제한 후 (의 회색 값의 뺄셈을하지 않는 표현 각 픽셀에서 픽셀)을 각각 빨간색과 녹색 채널에서 GFP의 강도는 각 GFP - 표현 픽셀의 총 개수로 픽셀당 가치를 그레이 스케일 의미를 곱하여 계산 채널, 그리고 빨간색과 녹색 채널을 모두 그 가치를 추가할 수 있습니다. GFP 강도 값 표현 프로필을 항복 모든 100 시간 지점 수집되었다. GFP 발현 프로파일의 변화는 발기인 강도, 입을 억제의 존재, 또는 발기인의 자연과 같은 요인의 차이에서 발생. GFP 강도의 부량 이외에 이미지 시리즈는 ImageReady를 사용하여 시간 경과 애니메이션을 생성하는 데 사용되었습니다. 시간 경과 애니메이션은 세포의 명확한 대부분 속도가 느린 감소 다음에 GFP 표현의 비교적 빠른 증가를 표시하는 것으로 나타났습니다. 일부 세포는 때때로 빠른 세포 죽음에 연결되어있을 수 있습니다 형광의 갑작스런 손실을 표시합니다. 인접한 세포에 막과 세포 벽 전체 GFP의 명백한 교통도 관찰되었다. 시간 경과는 달리 GFP의 강도 프로필 또는 단일 시점 이미지 컬렉션을 사용하여 얻을 수없는 추가 정보를 제공하는 애니메이션.

우리는 소개, 추적 및 식물 세포에서 GFP의 표현의 정량 분석​​에 대한 방법을보고합니다. 이 방법은 시간이 지남에 샘플을 다수의 세미 연속 이미지 수집을위한 맞춤 설계된 로봇 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 이미지 시리즈의 분석 ImageJ와 ImageReady의 사용을 보여줍니다.

식물 조직 내의 유전자 발현은 일반적으로 인 비트로(in vitro) 분석을 위해 식물 조직에서 화합물을 파괴적으로 추출하여 연구합니다. 이러한 방법들은...

본 실험 절차에서는 로봇 공학을 이용하여 식물 조직 내 유전자 발현의 역동성을 시간에 따라 이미지화합니다. 먼저 리마콩 종자를 멸균한 후, 발아를 위해 조직 배양 용기 내의 젖은 종이 타월 사이에 배치합니다. 4일 후, 자엽을 제거하고 GFP가 융합된 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트로 Bombardment를 수행합니다. 페트리 접시에 배치된 자엽을 2차원 맞춤형 로봇 이미지 수집 시스템에 장착합니다. 로봇은 100시간 동안 매시간 각 조직 조각의 이미지를 캡처하도록 프로그래밍됩니다.이미지는 이미지 분석을 거쳐 시간 경과에 따른 GFP 발현 강도의 정량적 데이터를 제공합니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 원예 및 작물 과학과의 식물 형질전환 연구실 책임자인 John Finer입니다. 저는 오하이오 주립대학교 연구실의 박사 과정 학생인 Carlos Herandez Garcia입니다.오늘 Carlos는 녹색 형광 단백질을 이용하여 식물 조직의 유전자 발현을 분석하기 위해 우리가 개발한 프로토콜을 보여줄 것입니다. 우리는 실험실에서 개발한 이 절차를 통해 OD 활성도의 변형을 측정합니다. 이를 위해 우리는 리포터 유전자인 GFP 유전자 상위에 프로모터를 배치했습니다.리마콩 잎맥(Lima vein)에 프로모터 제어 요소를 도입하고, 맞춤 설계된 로봇 이미지 캡처 시스템을 통해 애플리케이션을 전송하는 방법을 보여드리겠습니다. 마지막으로 이미지 분석 프로토콜을 살펴보며 마무리하겠습니다. 그렇다면 절차를 시작해 보겠습니다. 먼저 표준 절차에 따라 리마콩 종자를 표면 멸균합니다.멸균된 종자를 젖은 종이 타월 층 사이에 넣어 magenta GA 7 용기에 담고 25 °C에서 4일 동안 배양합니다. 여기서는 프로모터 및 프로모터 요소 분석에 유용한 고복제수 발현 벡터를 사용합니다. 이 벡터는 GFP 유전자를 포함하고 있으며, 이는 입자 충격법(bombardment) 시행 약 1~2시간 전에 형질전환된 조직 내에서 프로모터 또는 프로모터 요소의 기능을 시각화하는 데 사용됩니다.종피에서 리마콩 CU leadin을 절제합니다. 입자 충격법(bombardment)에 적합한 CU leadin은 절제 직후 노란색에서 연녹색을 띠며 평평해야 하고, 향후 이미지 분석을 방해할 수 있는 손상이 없어야 합니다. MS 염류 B, 5가지 비타민, 3% sucrose 및 0.2% gel rate(pH 5.7)를 포함하는 OMS 배지가 담긴 페트리 접시에 12개의 cu leadin을 놓습니다. 다음으로, M 10 텅스텐 입자에 DNA construct를 침전시킵니다. 우선, 사용 직전에 입자를 멸균수에 재현탁하여 100 mg/mL 농도로 만듭니다.그 다음 0.6 mL 원심분리 튜브에 입자 25 µL, 1 µg/µL 농도의 DNA 5 µL, 2.5 M 염화칼슘 25 µL 및 100 mM 스퍼민 10 µL를 넣습니다. DNA 준비물을 얼음 위에서 5분 동안 배양한 후, 입자 위에 떠 있는 용액 50 µL를 제거하여 버립니다. 튜브 바닥에 남아 있는 DNA 코팅 입자를 볼텍싱하여 다시 현탁합니다.Vortexing 직후 2 µL의 Eloqua를 분취합니다. 이 vortexing 단계를 반복하십시오. Eloqua를 분취할 때마다 코팅된 입자는 얼음 위에 보관하고 15분 이내에 사용해야 합니다.DNA가 입자에 코팅되었으므로, 필터 스크린 중앙에 있는 시린지 필터 상단으로 2 µL의 입자를 넣습니다. 그런 다음 시린지 필터를 입자 유입건(particle inflow gun) 또는 PIG 챔버 내부의 필터 유지 장치에 배치합니다. 비커 바닥에 스크린이 융착된 배플 위에 리마콩 공동 리드(lima bean co leadin)를 축 방향이 위로 향하게 하여 놓습니다.입자 건 챔버 내에서 조사 동안 조직을 지지하는 플랫폼으로 사용되는 배플을 배치합니다. 조직을 조사하려면 먼저 진공으로 연결되는 밸브를 열어 챔버를 진공 상태로 만듭니다. 진공도가 760 millimeters of mercury에 도달하면, 솔레노이드를 활성화하고 헬륨을 방출하여 입자를 추진시킵니다.입자를 가속하는 데 사용되는 헬륨 압력은 50~60 PSI입니다. 입자 조사 후, 진공 라인 밸브를 닫고 배기 밸브를 사용하여 진공을 해제하십시오. 진공이 해제되면 챔버 도어를 열어 조사된 co leadin을 회수하고 co leadin을 dal side로 되돌려 놓으십시오.정량 및 발현 프로파일링을 위해 OMS 배양 배지로 옮깁니다. 모든 DNA 컨스트럭트에 대해 최소 3회 이상 폭격(bombard)합니다. 잘 연구된 유전자 발현 프로파일을 나타내는 양성 대조군도 함께 포함합니다.이제 공-리딩(co leadin)의 이미징 준비가 완료되었습니다. 수은 램프를 켜고 램프가 예열될 때까지 30분 동안 기다리십시오. SPOT R-T-C-C-D 카메라와 8개의 플레이트를 고정하며 맞춤 설계된 로보틱스 플랫폼의 이동을 제어하는 모터 컨트롤러의 전원을 켜십시오.MZ L 3 실체 현미경에서 GFP 검출을 위해 들뜸 파장 480 nanometers, 방출 파장 510 nanometers인 GFP two 필터 세트를 선택하여 설정하십시오. 그 다음, 70% ethanol을 분무하여 두꺼운 폴리카보네이트 페트리 접시 뚜껑을 멸균하십시오. 페트리 접시 바닥을 덮는 데 사용되는 이 특수 뚜껑은 이미지 수집 중 결로 현상을 방지합니다.bombarded cuan이 포함된 플레이트를 로보틱스 플랫폼에 배치하고 측면 고정 나사를 조여 위치를 고정합니다. 이제 로보틱스 플랫폼과 이미지 획득을 모두 제어하는 맞춤형 소프트웨어 애플리케이션을 엽니다. 또한 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 백색광 컨트롤러 스위치를 켜고, 플랫폼을 홈 위치로 정렬합니다.이 작업은 위치 진입 전에 수행됩니다. 모터 탭의 모든 coddle leadin에 대해 첫 번째 플레이트를 선택하십시오. 플랫폼이 페트리 접시의 중심을 현미경 대물렌즈 아래에 위치시킵니다.이동 거리 버튼을 사용하여 이미지 수집을 위한 첫 번째 CU LEADIN의 위치를 정밀하게 잡으십시오. 라이브 모드 기능을 사용하여 cuddle leaden을 적절한 관찰 영역으로 이동시킵니다. 첫 번째 cuddle leaden의 경우, 해부 현미경의 수동 노브를 사용하여 초점을 맞추고 배율을 1.6 x로 설정하십시오. 관심 영역이 설정되면 '이 위치 추가' 버튼을 클릭하십시오.소프트웨어는 이 영역의 좌표를 위치 스케줄 파일에 추가하며, 플랫폼은 플레이트 상의 나머지 모든 coen에 대해 설정된 플레이트 중심 위치로 돌아갑니다. 이동 거리 버튼을 사용하여, 로보틱 플랫폼의 각 플레이트 하단에 위치한 3개의 수동 레벨링 나사로 동일한 플레이트 내 나머지 coan의 초점을 조정하십시오. 모든 coan의 좌표 입력이 완료되면, 위치 스케줄 좌표를 저장하십시오.동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로, GFP의 경우 청색광인 광원의 종류와 노출 설정 등의 이미지 수집 파라미터를 입력하고 이미지를 저장할 위치를 지정하십시오. 캡처 시간 제어 탭으로 이동하여 이미지 획득 시간 간격과 총 이미지 수집 사이클 횟수를 설정하십시오. 이미지는 일반적으로 100시간 동안 매시간 수집됩니다.명확하게 정의된 유전자 발현 프로필을 생성합니다. 포지션 스케줄 탭을 열고 run schedule 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작하십시오. 100시간의 이미지 수집이 끝나면 이미지 수집 시스템을 외부 빛으로부터 차단하십시오.각각 약 5MB 크기의 고해상도 이미지들이 영상 분석을 위해 준비되었습니다. ImageReady를 사용하여 각 폴더에서 100장의 연속 이미지를 어셈블하십시오. 모든 연속 이미지를 프레임으로 가져오고, 이미지 처리 속도를 높이기 위해 크기를 800 x 600 픽셀로 조정하십시오.다음으로, 모든 프레임에서 보이며 이미지 참조의 선택된 GFP 스폿을 사용한 새로운 도입 레이어에 마크를 표시합니다. 각 이미지를 수동으로 정렬하고, 정렬이 완료되면 참조로 사용된 레이어를 삭제한 후 파일을 단일 PSD 파일로 저장합니다. 또한, 모든 프레임을 최고 해상도의 단일 MOV 파일로 내보냅니다.이제 GFP 정량을 시작할 준비가 되었습니다. Image J를 사용하여 MOV 파일을 열고 400 x 300 픽셀 영역으로 크롭하십시오. 그런 다음 RGB split 도구를 사용하여 순차적 이미지들을 적색, 청색, 녹색 채널로 분리하여 적색 및 녹색 채널을 추출하십시오.각 슬라이스용 배경 형광 제거(subtract measured ROI for each slice) 플러그인 도구를 사용하여 배경 형광을 제거하십시오. 임계값 수준을 조정하고, 픽셀당 평균 그레이 스케일 값과 GFP 발현 픽셀의 총 수를 측정하도록 설계된 플러그인을 사용하여 GFP 발현량을 계산하십시오. ImageJ의 출력값을 복사하십시오. 마지막으로 녹색 및 적색 채널의 출력값을 Microsoft Office에 붙여넣으십시오.이미지 정렬 결과의 개념을 파악하기 위해 데이터를 추가로 조작하는 과정에 Excel을 사용합니다. 이 첫 번째 애니메이션은 100시간의 실험 동안 로보틱스 플랫폼의 재배치 과정에서 발생하는 부정확성을 보여줍니다. 스폿(Spot)의 움직임은 수동 이미지 정렬 후 로보틱스 플랫폼이 각 시점에서 정확히 동일한 위치로 돌아가지 못해 발생하는 아티팩트이며, GFP 발현 세포를 쉽게 관찰할 수 있고 이 추적 시스템의 고유한 특징들을 쉽게 시각화할 수 있습니다.이 애니메이션이 반복됨에 따라 원으로 표시된 GFP 발현 세포들을 주목하십시오. 빨간색 원으로 표시된 세포는 포격 후 18~20시간 사이에 발현량이 매우 급격히 감소하는 반면, 흰색 원으로 표시된 세포는 GFP 발현의 시작이 지연됨을 보여줍니다. 애니메이션 외에도, 이 절차를 통해 리마콩 표적 조직 내 GFP 발현의 시간적 변화를 빠르게 정량화할 수 있습니다. 이러한 대표적인 결과는 CAMV 35 S 프로모터와 4가지 서로 다른 콩 프로모터를 사용하여 프로모터 강도를 비교 정량화한 것을 보여줍니다.지금까지 발아된 촉매(catalin)에 DNA를 도입하는 방법을 보여드렸습니다. 리마콩 종자를 로봇 위에 놓고 촉매를 배치한 후, 이미지 분석을 위한 영상을 수집하고 해당 영상을 분석합니다. 저희 연구실에서는 클론 식물 프로모터를 검증하기 위해 이 절차를 일상적으로 사용하고 있습니다.다양한 식물 프로모터를 도입하여 방대한 양의 데이터를 생성할 수 있습니다. 하지만 이 과정은 단계가 많고 복잡하여 오류가 발생할 가능성이 높습니다. 따라서 이 절차를 수행할 때는 신선한 강낭콩 종자로 시작하거나, 최소한 적절하게 보관된 고품질의 종자를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, Bombard 컷 리드를 빠르게 확보하여 로봇에 설치하고, 응결 문제를 최소화하기 위해 두꺼운 페트리 접시 뚜껑을 사용하는 것이 중요합니다.마지막으로, 저희가 사용하는 GFP는 하버드 대학교의 Gen HIN Lab에서 제작한 SGFP라는 다른 버전임을 참고하시기 바랍니다. 이 GFP는 안정성이 낮아 유전자 발현의 급격한 변화를 추적하는 데 더 적합할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.그럼, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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