식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

식물 세포벽의 리그닌 함량과 구성을 결정하는 것은 다양한 추출을 거친 건조된 식물 재료에서 시작됩니다. 결과 물질은 세포벽으로만 구성된 다음 리그닌 함량을 결정하기 위해 분할됩니다. 벽 재료는 아세틸 브로마이드에 의해 가수분해되고 가용화된 모노 알은 리그닌 조성 측정을 위해 UV 분광법으로 정량화됩니다.

벽 재료는 세포 분해에 의해 가수분해됩니다. 그런 다음 가용화된 리그닌 성분은 휘발성 트리메틸 식염수 유도체로 유도되며, 이는 질량 분석법과 함께 가스 크로마토그래피를 사용하여 분리 및 정량화할 수 있습니다. 매트릭스 다당류 조성 및 셀룰로오스 함량의 측정은 식물 세포벽의 종합 조성 분석, 2부 탄수화물이라는 제목의 또 다른 비디오에서 시연됩니다.

안녕하세요, 저는 미시간 주립 대학의 오대호 바이오 에너지 연구 센터의 벽 분석 시설 책임자인 마커스 폴리입니다. 저는 분석 세포벽 시설의 관리자인 Cliff Foster입니다. 식물 바이오매스 샘플의 함량과 조성을 결정하는 방법에 대한 절차를 보여드리겠습니다.

식물은 태양의 빛 에너지를 바이오매스와 같은 화학 에너지로 변환합니다. 식물 바이오매스는 주로 모든 식물 세포를 둘러싸고 있는 다양한 폴리머의 복잡한 네트워크인 세포벽으로 구성됩니다. 여기에서 우리는 식물 세포벽 물질의 구성을 결정하여 매우 풍부한 재생 가능 자원인 리그닌 Cellose X를 바이오 연료로 전환할 수 있는 가능성을 평가합니다.

오늘 우리는 식물 세포벽의 포괄적 인 구성 분석, 2 부 탄수화물이라는 제목의 또 다른 비디오에서 폴리 페놀 리그닌에 초점을 맞출 것입니다. 다당류 분석에 중점을 둘 것입니다. 이 절차를 시작하려면 2 밀리리터 사레드 스크류 캡 튜브에 3 개의 5.5mm 스테인리스 스틸 볼을 추가하고 약 60-70 밀리그램의 공기 또는 동결 건조 식물 재료를 추가합니다.

이 재료는 연삭 및 분배 로봇인 아이월(eyewall)을 사용하여 미세한 분말로 분쇄할 수 있습니다. 아이월은 튜브를 가져 와서 30 초 동안 흔들며, 금속 볼로 인해 재료를 미세한 분말로 분쇄 한 다음 분쇄하지만 소형 식물 분말은 로봇이 아닌 대체 저 처리량 절차로 느슨해집니다. 2부에서 제시된 레트로 촉진은 1.5M의 70% 수성 에탄올을 지상 물질 소용돌이에 철저히 첨가하고 실온에서 원심분리합니다.

이 처리는 대부분의 단백질과 세포 소기관을 가용화하고 상층액을 흡인하며 부피에 일대일 부피를 추가합니다. 클로로포름 메탄올 용액을 알코올 불용성 펠릿으로 흔들어 펠릿과 원심 분리기를 다시 스핀합니다. 클로로포름 메탄올은 원심분리 후 지질과 같은 소수성 화합물을 추출하고 상층액을 흡인하며 펠릿과 500마이크로리터의 아세톤을 재현탁합니다.

샘플을 건조시키기 위해 건조될 때까지 섭씨 35도의 공기 흐름으로 용매를 증발시키고 건조된 샘플은 추가 처리까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 샘플에서 전분 제거를 시작하려면 펠릿을 현탁시키고 1.5mil의 0.1 몰 아세트산 나트륨 pH 5 튜브를 덮고 가열 블록에서 가열하여 전분을 젤라틴화합니다. 얼음에 현탁액을 냉각한 후에, 전분 겸비하는 효소 혼합 모자를 추가하고, 관을 덮고 와류는 철저하게 현탁액을 밤새 배양합니다.

섭씨 37도의 셰이커에서 회전 셰이커는 적절한 혼합을 보장합니다. 하룻밤 배양 후 섭씨 100도의 가열 블록에서 10분 동안 가열하여 소화를 종료합니다. 그런 다음 원심 분리기를 사용하여 가용화 된 전분을 함유 한 상등액을 버립니다.

앞에서 설명한 대로 볼텍싱, 원심분리 및 디캔팅을 통해 매번 1.5mil의 물을 사용하여 나머지 펠릿을 세 번 세척합니다. 마지막으로, 펠릿을 500 마이크로 리터의 아세톤에 재현탁시키고 건조 될 때까지 섭씨 35 도의 공기 흐름으로 용매를 증발시킵니다. 셀룰로오스가 없는 분리된 세포벽 또는 다리를 포함하는 건조된 샘플은 추가 분석을 위해 준비되었으며 실온에서 보관할 수 있습니다.

준비된 세포벽 물질 1-1.5mg의 무게를 측정하는 것으로 시작합니다. 재료는 손으로 또는 2부에서 설명한 것처럼 안벽을 사용하여 자동화된 방식으로 무게를 잴 수 있습니다. 튜브 벽을 250마이크로리터의 아세톤으로 헹구어 튜브 바닥의 세포벽 물질을 수집하고 공기 흐름 아래에서 아세톤을 매우 부드럽게 증발시킵니다.

아세톤이 증발 한 후 두 벽을 따라 빙초산의 아세틸 브로마이드 100 마이크로 리터를 부드럽게 첨가하십시오. 튀는 것을 방지하기 위해 미묘한 브로마이드는 리그닌 폴리머를 아세틸화 모노로 분해합니다. 그런 다음 부피 플라스크의 뚜껑을 닫고 섭씨 50도에서 2시간 동안 가열합니다.

15 분마다 4 번의 문자 메시지로 한 시간을 더 가열하고 마지막으로 얼음에서 식히십시오 : 플라스크를 냉각 한 후 실온에서 2 몰 수산화 나트륨 400 마이크로 리터와 새로 준비된 0.5 몰 하이드록실 라민 하이드로 클로라이드 와류 70 마이크로 리터, 부피 플라스크를 추가합니다. 다음으로, 부피 플라스크를 빙초산 캡으로 2밀리리터 표시까지 정확하게 채워 용액을 중화하고 여러 번 반전시켜 가수분해 및 용해된 모노 랄을 포함하는 용액 200마이크로리터를 UV 특이적 96웰 플레이트에 혼합하고 280나노미터의 웰 플레이트 리더에서 플레이트를 판독합니다. 플레이트를 최소 세 번 읽고 미립자로 인해 흡광도 값이 약간 변할 수 있으므로 흡광도의 평균을 구하십시오.

서면 프로토콜에 제시된 공식에 따라 적절한 식물 계수를 사용하여 미묘한 브롬화물 용해성 리그닌 또는 BSL의 백분율을 결정합니다. 리그닌은 식물 물질에서 리그닌의 조성을 결정하기 때문에 주로 P 하이드록시 페놀, gua ACell 및 스프링롤 단위의 세 가지 하위 단위로 구성된 폴리페놀 네트워크입니다. 세포 분해를 위해 약 2mg의 세포벽 물질을 나사로 덮인 유리관으로 옮기는 것으로 시작합니다.

다음으로, 다이옥산에 2.5% 붕소 트리플루오라이드 에틸 ate와 10% 에탄 티올 용액을 준비할 준비를 합니다. 다이옥산은 매우 위험하므로 후드에서 샘플이나 장비를 꺼내지 마십시오. 매우 조심스럽게 작업하고 질소 가스로 채워진 풍선을 사용하여 다이옥산 병의 손실된 부피를 질소로 대체하는 것을 잊지 마십시오.

샘플당 175마이크로리터, 다이옥산 20마이크로리터, ETSH, 5마이크로리터, BF 3를 혼합하여 용액을 준비합니다. 혼합 후 각 샘플에 200마이크로리터의 용액을 추가합니다. 바이알 헤드스페이스를 질소 가스와 캡으로 퍼지합니다.

즉시 샘플을 섭씨 100도에서 4시간 동안 가열하고 매시간 부드럽게 혼합합니다. 테오 에이스 용해 반응은 5 분 동안 얼음 위에서 이루어집니다. 그런 다음 150 마이크로 리터의 0.4 몰 중탄산 나트륨을 첨가하여 중화하고 와류를 일으킵니다.

리그닌 분해 산물을 청소하려면 1mil의 물과 0.5mils의 아세테이트 와류를 추가하고 상을 분리하십시오. 에틸 아세테이트 층은 맨 위에 있고 물은 맨 아래에 있습니다. 리그닌 성분이 포함된 상단 Ethel acetate 층 150마이크로리터를 2mil 튜브로 옮기고 물이 전달되지 않도록 합니다.

상단 Ethel acetate 층에서 이동 한 후 공기와 함께 농축기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 200마이크로리터의 아세톤을 넣고 증발시킵니다. 아세톤으로 처리를 두 번 반복하여 과도한 수분을 제거합니다.

다음으로 리그닌 성분을 휘발성 트리메틸 Cy Lane 유도체로 유도합니다. 각 튜브에 에틸 아세테이트 500마이크로리터, 퓨린 20마이크로리터, NO 비스 트리메틸 실 아세트아미드 100마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 25도에서 2시간 동안 배양합니다.

2시간이 끝나면 100마이크로리터의 반응을 GC MS 바이알로 옮기고 100마이크로리터의 아세톤을 추가합니다. 4중 질량 분석기 또는 화염 이온화 검출기가 장착된 GC로 샘플을 분석합니다. 실행에 대한 칼럼 및 세부 사항은 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오.

다음은 포플러 나무를 식물 재료로 사용한 리그닌 분석의 대표적인 결과입니다. 이 분석에 따르면 포플러 재료의 22%는 폴리페놀 리그닌으로 구성됩니다. 리그닌 성분의 조성은 GCMS에 의해 분석되었습니다.

피크는 테트라 코안(tetra coane) 내부 표준물질을 사용한 상대적 머무름 시간 또는 sg 및 h 단량체에 대해 각각 2, 99MZ, 2, 69MZ 및 2, 39MZ의 특성 질량 스펙트럼 아이콘으로 식별됩니다. 리그닌 성분의 조성은 총 피크 면적을 100%로 설정하여 정량화합니다.조성 분석은 이 특정 샘플이 주로 문자열 또는 S 단위를 포함하고 있음을 보여줍니다. 그러나 Goya, aol 또는 G 단위도 풍부합니다.

분명히, 양과 모노 리알 단위 구성은 식물 조직과 종에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 방금 다당류 분석을 위해 식물 재료의 리그닌 함량과 조성을 결정하는 방법을 보여 드렸습니다. 2부로 넘어갑니다.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.