Name: 식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 학습하세요 식물 세포벽 리그닌 함량 및 조성 분석 방법을 통해 바이오매스 활용 가능성을 평가하는 기술을. 아세틸 브로마이드 가수분해와 UV 분광법, GC-MS를 활용한 정량 분석 프로토콜입니다.

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우리는 최고의 기술 서비스와 존 랄프 귀중한 조언, 토론 및 포플러 나무 샘플에 대해 위스콘신 대학의 매튜 로버트 웨더에게 감사하고 있습니다. 이 작품은 과학의 오피스 에너지의 미국학과 (DOE) 대호 Bioenergy 연구 센터 (과학 DE - FC02 - 07ER64494의 DOE BER 사무소)와 화학 과학 Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학 사무소에 의해 재정 지원되었다 에너지 미국학과 (보너스 번호. DE - FG02 - 91ER20021).

1. 세포 벽 절연 <ol><li> iWall를 사용하여 2 ML Sarstedt 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인레스 스틸 공과 함께 약 60 70mg 공기 또는 동결 건조 식물 소재를 갈아, 분쇄 및 분배 로봇 (30 S). 볼 - 밀 (retschmill)를 사용하여 대안이 아닌 로봇 낮은 처리량 절차는 2 부 2 제공됩니다. </li><li> 적절 지상 소재, 그리고 철저하게 소용돌이 70 % 에탄올 수용액의 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 펠렛 10 분 알코올 불용성 잔류물을 위해 10,000 RPM에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다. </li><li> 잔류물에 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1.5 ML를 추가하고 펠렛을 resuspend하기 위해 철저하게 튜브를 흔들. </li><li> 10,000 10 분에 대한 RPM 및 표면에 뜨는를 대기음 또는 가만히 따르다에서 원심 분리기. </li><li> 아세톤 500 μl에 Resuspend 펠릿. </li><li> 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li><li> 샘플에서 전분의 제거를 시작하려면 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼 산도 5.0 1.5 ML의 펠렛을 resuspend. </li><li> 20 분 대한 Sarstedt 튜브와 열을 모자. 80 ° C 가열 블록에. </li><li> 얼음에 정지를 쿨. </li><li> 펠렛 다음 에이전트를 추가합니다 : 0.01 % 나트륨 azide (NaN3) 35 μl, 35 μl 아밀라아제 (50 μg / ML H 2 O, 바실러스 종, 시그마), 17 μl pullulanase (바실러스 acidopullulyticus에서 17.8 단위, 시그마) . 튜브와 철저하게 소용돌이를 캡. </li><li> 정지 37 박 이상 incubated입니다 ° 통에 C. 튜브를 Orienting 수평 보좌관은 혼합 향상. </li><li> 100 열 정지 ° C 소화를 종료하기 위해 가열 블록에서 10 분. </li><li> 원심 분리기 (10,000 RPM, 10 분)와 뜨는 포함 solubilized 전분을 삭제. </li><li> , 1.5 ML 물을 추가 vortexing, centrifuging 및 세척 물을 decanting하여 나머지 펠렛을 세 번 씻으십시오. </li><li> 아세톤 500 μl에 Resuspend 펠릿. </li><li> 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 그것은 더 건조 주걱으로 튜브에 재료를 헤어지게하는 것도 필요할 수 있습니다. 마른 재료는 절연 세포 벽 (lignocellulosics)를 제공합니다. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li></ol> 2. 리그닌 함량 이 방법은 후쿠시마와 하트 3보고 방식을 기반으로합니다. <ol><li> 1 무게 - 준비 세포 벽 재료의 1.5 MG (1 참조) 빈에 대한 빈 튜브를 떠나는 두 ML의 판매량 플라스크에 있습니다. </li><li> 튜브의 바닥에있는 세포 벽 자료를 수집하는 아세톤 250 μl와 튜브 벽을 씻어하고, 공기에서 아세톤은 매우 부드러운 증발. </li><li> 부드럽게 물 튀기지을 방지하기 위해 튜브 벽을 따라 신선한 만든 아세틸 브로마이드 솔루션 100 μl (25 % 빙초산에 V / V 아세틸 브로마이드)를 추가합니다. </li><li> 50 캡 판매량의 술병과 열 ° 2 시간을위한 C </li><li> 매 15 분 vortexing과 추가 시간 동안 가열. </li><li> 상온에 얼음 쿨. </li><li> 2M 수산화 나트륨과 신선한 0.5 M 히드록 실 아민 염산염의 70 μl 400 μl를 추가합니다. 와동 용적의 flasks. </li><li> 빙초산, 모자와 정확히 2.0 ML 표시 용적 플라스크를 입력하고 혼합을 여러 번 반전. </li><li> 피펫 200 UV 특정 96 잘 판에 솔루션의 μl와 280nm에서 엘리사 Reader에서 읽어보세요. </li><li> (; 풀밭 = 17.75; 포플러 = 18.21 Arabidopsis = 15.69) 적절한 계수를 사용하는 아세틸 브로마이드 가용성 리그닌 (% ABSL)의 비율을 결정하는 다음 수식과 : % ABSL CALC : <img src="/files/ftp_upload/1745/1745eq.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> UG / MG 세포 벽 단위에서 10 %의 결과와 함께 ABSL의 증식 그것은 적어도 3 판은 입자가 흡광도 값에서 약간의 변화를 일으킬 수 있기 때문에 흡광도 (ABS)을 평균 읽습 할 수 있도록 도와줍니다. 참고 : 0.539 cm가 pathlength를 나타내고 있지만, 플레이트에 따라이 결정해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 3. 리그닌 성분 이 방법은 로빈슨과 맨스필드 5 발표된 최근 메서드에서 채택됩니다. <ol><li> thioacidolysis위한 나사 덮인 유리관에 세포 벽 재료의 약 2 MG (1을 참조하십시오.) 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 2.5 % 붕소 trifluoride 디에틸 etherate (BF 3) 10 % 에탄티올 (EtSH) 솔루션을 준비합니다. 당신은 질소와 dioxane 병에 잃어버린 볼륨을 치환하기 위해 질소 가스로 가득 풍선을 사용해야합니다. Dioxane 매우 위험한이며, 후드 밖으로 샘플이나 장비를하지 않습니다. 20 μl EtSH,, 5 μl BF 3 175 μl dioxane : 볼륨 샘플 당 솔루션의 준비했습니다. </li><li> EtSH, BF 3, 각 샘플에 dioxane 솔루션을 200 μl를 추가합니다. </li><li> 바로 질소 가스와 모자와 퍼지 유리 상부. </li><li> 100 히트 ° 부드러운 혼합 매 시간과 4 시간 동안은 C. </li><li> 5 분 얼음에 냉각하여 최종 반응. </li><li> 0.4M 나트륨 중탄산염 150 μl, 소용돌이 추가 </li><li> 청소 물 1 ML과 에틸 아세테이트, 소용돌이 0.5 ML를 추가하고 (아래에서 위로, 물, 에틸 아세테이트에) 단계 분리하게하십시오. </li><li> 2 ML Sarstedt 튜브에 에틸 아세테이트 층 150 μl을 전송합니다. 물이 전송이되지 있는지 확인하십시오. </li><li> 공기와 농축기로 용매를 증발. </li><li> (두 번 총 반복 초과하는 물을 제거) 200 μl 아세톤을 추가하고 증발. </li><li> TMS의 derivati​​zation에 대한 에틸 아세테이트 500 μl, 피리딘 20 μl, 그리고 N 100 μl, O - BIS (trimethylsilyl) 각 튜브에 acetamide를 추가합니다. </li><li> 25 2 시간 동안 품어 ° C. </li><li> GC / MS 유리병에 반응 100 μl를 전송하고 아세톤 100 μl를 추가합니다. </li><li> quadrupole 대량 분광계 또는 불꽃 이온화 검출기가 장착된 GC로 샘플을 분석할 수 있습니다. 애질런트 HP - 5MS 컬럼은 (X 0.25 mm X 0.25 μm의 필름 두께 30mm)으로 설치됩니다. 다음 온도 기울기는 30 분 용매 지연과 1.1 ML / 분 유량과 함께 사용됩니다 : 130에서 초기 개최 · 3 분 C, 3 ° 250 C / 분 램프 ° C 1 분 만요, 수 130 ° C.의 초기 온도 평형 </li><li> 봉우리는 tetracosane 내부 표준 (옵션)를 사용하여 상대 유지 시간 또는 299의 특성 질량 스펙트럼 이온에 의해 식별 M / Z, 269m / Z, 그리고 239m / S, G에 대한 Z와 H 단량체, 각각 (그림을 참조하십시오. 2). 리그닌 구성 요소의 구성은 100 %로 총 피크 영역을 설정하여 계량입니다 </li></ol> 4. 대표 결과 벽 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 경우에는 포플러 줄기 (나무)은 프로토콜 섹션에서 설명한 여러 가지 절차에 의해 분석되었다. thioacidolysis 및 TMS - derivati​​zation 후 리그닌 - 구성 요소의 분리 예제 크로마토 그램이 표시됩니다. 분명의 상대적 풍부한 syringyl - (S), guaiacyl - (G) 및 P - hydroxyphenol - (H) 단위가 결정하실 수 있습니다. 아세틸 브로마이드 가용성 리그닌의 내용은 자체 설명이고, 하나는 벽 건조 무게의 20-50% 사이의 가치를 기대할 수 있습니다. 하나는 아세틸 브로마이드는 벽에 리그닌 현재의 모든 solubilize하고, solubilization의 정도는 물질에 따라 달라질 수 있습니다하지 않습니다한다. 그러나,이 방법은 비교적 수행하는 간단하고 신속하고 리그노셀룰로오스성 물질의 리그닌 내용의 훌륭한 근사치를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 :. 리그노셀룰로오스성 분석의 개요 세포 벽 (lignocellulosics)는 원유 건조 식물으로부터 격리됩니다. 벽 재료는 다음 aliquots에 가중치 및 다양한 assays에 대한 세분화됩니다. 월 자료는 아세틸 브로마이드와 UV - 분광하여 계량 solubilized 리그닌과 함께 처리됩니다. 리그닌 성분의 결정에 대한, 벽면 소재는 thioacidolysis를 받게됩니다. solubilized phenolics는 TMS의 derivati​​zation를 받아야하고 분리 및 GC - MS 분석에 의해 계량하실 수 있습니다. 매트릭스 다당류 성분과 결정 셀룰로스 컨텐츠 프로토콜 2 부 2 설명되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 :. 포플러 (포풀러스 tremoloides)에서 포플러 나무 종합 리그노셀룰로오스성 분석 우드 칩은 설명 프로토콜을 받게되었습니다. Ligin 조성, H P - 히드록시 페닐, G guaiacyl, S syringyl 단위.

<ol><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+II%3A+Carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
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<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endo-transglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
</ol>

설명 방법은 리그닌 함량과 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 구성의 급속한 양적 평가를 가능하게합니다. iWall 로봇을 사용하여 약 350 샘플은 지상과 하루에 적절하게 사용하실 수 있습니다. 인당 다양한 분석 방법의 처리량이 다릅니다. 사용 프로토콜은 여기에 설명된 30 샘플은 리그닌 함량에 대한 처리하고, 하루 리그닌 성분 15 수 있습니다. 데이터 최적의 공급 원료 작물의 양적 특성으로 인해, 다양한이나 genotypes는 생물 연료 생산을위한 그들의 적합성의 관점에서 평가하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>하이드록실아민 염산염 (Hydroxylamine Hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255580</td><td></td></tr><tr><td>아세틸 브로마이드 (Acetyl Bromide)</td><td>Aldrich</td><td>135968</td><td></td></tr><tr><td>에탄티올 (Ethanethiol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3708</td><td></td></tr><tr><td>삼불화붕소 디에틸 에테레이트 (Borontrifluoride diethyl etherate)</td><td>Fluka</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>N,O-비스(트리메틸실릴) 아세트이미드 (N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide)</td><td>Fluka</td><td>15241</td><td></td></tr><tr><td>다이옥산 (Dioxane)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296309</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6890 GC/5975B MSD</td><td>(리그닌 조성)</td></tr><tr><td>5.5mm 스테인리스강 볼</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 열 분산기</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록 (Heating block)</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>시료 농축기 (Sample concentrator)</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 i : 리그닌

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

재생, 탄소 중립, 그리고 산업과 사회에 대한 지속적인 원료의 필요성은 21 세기의 가장 눌러 문제 중 하나가되고있다. 이것은 교통 액체 연료의 생산을위한 산업 원료 등 공장 제품의 사용에 흥미를 rekindled있다<sup&gt; 1</sup이러한 biocomposite 자료 등&gt; 및 기타 제품<sup&gt; 7</sup&gt;. 식물 바이오 매스는 지구상에서 가장 큰 미개척 보유 중 하나 남아있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 그것은 주로 에너지 셀룰로오스를 포함한 다양한 고분자 다양한 hemicelluloses (매트릭스 다당류와 리그닌의 폴리페놀 구성되어 있으며, 세포 벽 구성됩니다<sup&gt; 6</sup&gt; 때문에 때로는 lignocellulosics를 칭했다. 그러나, 식물의 세포 벽을 벽에 세포 전체 식물 인장 강도를 제공과 같은 병원체를 구하고, 물이 식물을 통해 이송 수 있도록, 저하에 완강히 저항하는 것으로 진화했습니다;까지 나무의 경우에는 위의 더 100m에 지상 수준. 벽의 다양한 기능으로 인해 엄청난 구조적 다양성은 단일 플랜트 내의 다른 식물 종의 및 세포 유형의 벽 안에있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 따라서 농작물 종, 작물 다양성, 또는 식물의 조직이 biorefinery 사용되는 무엇에 따라, 화학 / 효소 프로세스와 액체 바이오 연료에 대한 다양한 설탕의 후속 발효에 의해 depolymerization에 대한 처리 단계 조정하고 최적화해야합니다. 이 사실 뒷받침 식물 바이오 매스 feedstocks의 철저한 특성화를위한 필요합니다. 여기 lignocellulosics의 구성의 결정을 가능하게 높은 처리량 분석 매체 의무가있는 포괄적인 분석 방법을 설명합니다. 첫번째 부분에서 우리는 폴리페놀 리그닌 (그림 1)의 분석에 중점을두고 있습니다. 방법은 destarched 세포 벽 재료 준비와 함께 시작합니다. 그 결과 lignocellulosics은 다음 acetylbromide의 solubilization하여 리그닌 함량을 결정하는 갈​​라 아르<sup&gt; 3</sup그 syringyl, guaiacyl 및 P - 히드록시 페닐 단위의 관점에서&gt;와 리그닌 성분<sup&gt; 5</sup&gt;. 셀룰로스 내용 및 매트릭스 다당류 성분을 포함 리그노셀룰로오스성 바이오 매스의 탄수화물을 분석하는 프로토콜은 부 II에서 설명합니다<sup&gt; 2</sup&gt;.

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

산업과 사회를 위한 재생 가능하고 탄소 중립적이며 지속 가능한 원료에 대한 필요성은 21세기의 가장 시급한 과제 중 하나가 되었습니다...

식물 세포벽의 리그닌 함량 및 조성을 결정하는 과정은 건조된 식물 재료에서 시작하며, 이를 다양한 추출 공정에 회부합니다. 결과물은 세포벽으로만 구성되며, 이후 리그닌 함량을 결정하기 위해 분할됩니다. 세포벽 재료는 아세틸 브로마이드(acetyl bromide)를 이용한 가수분해 과정을 거치며, 가용화된 모노머들은 리그닌 조성을 결정하기 위해 UV 분광법으로 정량 분석합니다.세포벽 물질은 세포 용해(cytolysis)에 의해 가수분해됩니다. 가용화된 리그닌 성분은 이후 휘발성 트리메틸 실릴 유도체로 유도체화되며, 이는 질량 분석법과 결합된 가스 크로마토그래피를 사용하여 분리 및 정량할 수 있습니다. 매트릭스 다당류 조성 및 셀룰로오스 함량의 측정 방법은 "식물 세포벽의 종합적 조성 분석, 제2부 탄수화물"이라는 제목의 다른 영상에서 설명합니다.안녕하세요, 저는 미시간 주립대학교 Great Lakes Bioenergy Research Center 내 Wall Analytical 시설의 책임자인 Marcus Pauley입니다. 저는 분석 세포벽 시설의 매니저인 Cliff Foster입니다. 식물 바이오매스 시료의 함량과 조성을 결정하는 절차를 보여드리겠습니다.식물은 태양의 빛 에너지를 바이오매스와 같은 화학 에너지로 전환합니다. 식물 바이오매스는 주로 모든 식물 세포를 둘러싸고 있는 다양한 폴리머의 복합 네트워크인 세포벽으로 구성됩니다. 본 연구에서는 풍부한 재생 가능 자원인 리그닌 Cellose X를 바이오 연료로 전환할 수 있는 가능성을 평가하기 위해 식물 세포벽 물질의 조성을 결정합니다.오늘은 "식물 세포벽의 종합적 성분 분석, 제2부 탄수화물"이라는 제목의 또 다른 영상에서 폴리페놀 리그닌에 집중해 보겠습니다. 여기서는 다당류 분석을 중심으로 다루겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 2 mL 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인리스 스틸 볼 3개와 약 60~70 mg의 공기 건조 또는 동결 건조된 식물 시료를 넣으십시오.분쇄 및 분주 로봇인 eyewall을 사용하여 시료를 미세 분말로 분쇄할 수 있습니다. eyewall이 튜브를 잡고 30초 동안 흔들면, 내부에 포함된 금속 구슬에 의해 시료가 미세 분말로 분쇄됩니다. 그 다음, 분쇄되었으나 뭉쳐 있는 식물 분말을 로봇을 사용하지 않는 대안적인 저처리량 절차로 풀어줍니다. 역추출을 용이하게 하는 방법은 두 번째 부분에서 설명하며, 분쇄된 시료에 1.5 M 70% 수성 에탄올을 첨가하고 충분히 볼텍싱한 후 상온에서 원심분리합니다.이 처리는 대부분의 단백질과 세포 소기관을 가용화합니다. 상층액을 흡입하고 1:1 부피 비율의 클로로포름-메탄올 용액을 알코올 불용성 펠렛에 추가합니다. 펠렛이 다시 부유될 때까지 충분히 흔든 후 원심분리합니다. 클로로포름-메탄올은 지질과 같은 소수성 화합물을 추출합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하고 500 µL의 아세톤으로 펠렛을 재현탁합니다.샘플을 건조하려면 35 °C의 공기 흐름으로 용매를 증발시켜 건조하며, 건조된 샘플은 추가 공정 전까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 샘플 잔해에서 전분을 제거하기 시작하려면, 펠릿과 1.5 mL의 0.1 M 아세트산나트륨(pH 5)을 현탁시킨 후 튜브 캡을 닫고 가열 블록에서 가열하여 전분을 호화시킵니다. 현탁액을 얼음 위에서 냉각시킨 후 전분 분해 효소 믹스를 추가하고, 튜브 캡을 닫은 뒤 충분히 볼텍싱합니다. 현탁액을 하룻밤 동안 배양합니다.37 °C의 쉐이커에서 회전 쉐이커를 사용하여 적절히 혼합합니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 가열 블록에서 100 °C로 10분 동안 가열하여 소화를 중단시킵니다. 그 다음 원심 분리하여 가용성 전분이 포함된 상층액을 제거합니다.이전에 시연한 바와 같이 볼텍싱, 원심분리 및 데칸테이션 과정을 통해 남은 펠렛을 매회 1.5 mL의 물로 세 번 세척합니다. 마지막으로, 펠렛을 500 µL의 아세톤에 재현탁하고 35 °C의 공기 흐름을 이용하여 용매가 마를 때까지 증발시킵니다. 분리된 세포벽 또는 다리(leg), 비셀룰로오스 성분을 포함하는 건조된 시료는 추가 분석 준비가 완료되었으며 상온에서 보관할 수 있습니다.먼저 준비된 세포벽 물질 1~1.5 mg을 정량합니다. 물질은 수동으로 정량하거나 파트 2에서 시연한 것처럼 아이월(eye wall)을 사용하여 자동 방식으로 정량할 수 있습니다. 튜브 벽을 250 µL의 아세톤으로 헹궈 세포벽 물질을 튜브 바닥에 모은 다음, 공기 흐름 하에서 아세톤을 매우 부드럽게 증발시킵니다.아세톤이 증발한 후, 신선하게 제조한 25% volume to volume glacial acetic acid 내 acetyl bromide 100 µL를 두 벽면을 따라 천천히 가합니다. 튀는 것을 방지하기 위해 bromide를 조심스럽게 가하여 리그닌 폴리머를 아세틸화된 단당류로 분해합니다. 그런 다음 부피 플라스크의 캡을 닫고 50 °C에서 2시간 동안 가열합니다.15분마다 4번씩 흔들어주며 1시간 더 가열하고, 마지막으로 얼음 위에서 냉각합니다. 플라스크를 실온으로 냉각한 후, 2 M 수산화나트륨 400 µL와 새로 제조한 0.5 M 하이드록실아민 염산염 70 µL를 추가하고 부피 플라스크를 볼텍싱합니다. 그다음, 빙초산을 사용하여 부피 플라스크의 2 mL 표시선까지 정확히 채워 용액을 중화시킨 후, 캡을 닫고 여러 번 뒤집어 섞습니다. 가수분해 및 가용화된 모노리스가 포함된 용액 200 µL를 피펫으로 취해 UV 전용 96-웰 플레이트에 넣고, 웰 플레이트 리더를 사용하여 280 nm에서 측정합니다. 입자로 인해 흡광도 값에 약간의 변동이 생길 수 있으므로, 플레이트를 최소 3회 측정하여 흡광도 평균값을 구합니다.서면 프로토콜에 제시된 공식과 적절한 식물 계수를 사용하여 브롬화 수용성 리그닌(bromide soluble lignin, BSL)의 백분율을 결정하십시오. 리그닌은 주로 p-hydroxy phenol, guaiacyl, syringyl 단위의 세 가지 하위 단위로 구성된 폴리페놀 네트워크이며, 식물 재료 내 리그닌의 조성을 결정해야 합니다. 먼저 약 2 mg의 세포벽 물질을 세포 용해용 스크류 캡 유리 튜브에 옮기는 것으로 시작하십시오.다음으로, 2.5% boron tri fluoride ethyl ate와 10% ethane thiol dioxane 용액을 준비하십시오. dioxane은 매우 위험하므로, 시료나 장비를 후드 밖으로 가지고 나가지 마십시오. 매우 주의해서 작업해야 하며, 질소 가스가 채워진 풍선을 사용하여 dioxane 병에서 소실된 부피를 질소로 대체하십시오.샘플당 175 µL의 dioxane, 20 µL의 ETSH, 5 µL의 BF3를 혼합하여 용액을 준비합니다. 혼합 후, 각 샘플에 용액 200 µL를 첨가합니다. 바이알의 헤드스페이스를 질소 가스로 퍼지한 후 캡을 닫습니다.즉시 샘플을 100 °C에서 4시간 동안 가열하며, 매 시간 말에 가볍게 혼합합니다. 얼음 위에서 5분 동안 반응을 중지시킵니다. 그 다음 0.4 M 중탄산나트륨 150 µL를 첨가하여 중화시킨 후 볼텍싱합니다.리그닌 분해 산물을 정제하기 위해, 1 mL의 물과 0.5 mL의 아세테이트를 넣고 볼텍싱한 후 층이 분리될 때까지 둡니다. 에틸 아세테이트 층은 상층에, 물 층은 하층에 위치하게 됩니다. 물이 섞이지 않도록 주의하여 리그닌 성분이 포함된 상층의 에틸 아세테이트 층 150 µL를 2 mL 튜브로 옮깁니다.상층의 에틸 아세테이트 층을 옮긴 후, 농축기를 사용하여 공기 중에서 용매를 증발시킵니다. 아세톤 200 µL를 첨가하고 증발시킵니다. 과잉의 수분을 제거하기 위해 아세톤 처리를 두 번 더 반복합니다.다음으로 리그닌 성분을 휘발성 trimethylsilyl 유도체로 유도체화합니다. 각 튜브에 ethyl acetate 500 µL, purine 20 µL, 그리고 N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide 100 µL를 첨가합니다. 25 °C에서 2시간 동안 배양합니다.2시간이 지난 후, 반응액 100 µL를 GC MS 바이알로 옮기고 아세톤 100 µL를 첨가하십시오. 쿼드러플 질량 분석기(quadruple mass spectrometer) 또는 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 장착된 GC로 시료를 분석하십시오. 컬럼 및 분석 상세 조건은 첨부된 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.포플러 나무를 식물 재료로 사용하여 분석한 리그닌의 대표적인 결과입니다. 이 분석에 따르면, 포플러 재료의 22%가 폴리페놀 리그닌으로 구성되어 있습니다. 리그닌 성분의 조성은 GCMS를 통해 분석되었습니다.피크는 tetra coane 내부 표준물질을 이용한 상대적 머무름 시간 또는 sg 및 h 단량체에 대해 각각 2 99 MZ, 2 69 MZ 및 2 39 MZ의 특성 질량 분석 스펙트럼 아이콘으로 식별합니다. 리그닌 성분의 조성은 총 피크 면적을 100%로 설정하여 정량화합니다. 조성 분석 결과, 이 특정 샘플은 주로 string 또는 S 단위체를 포함하고 있음을 보여줍니다. 하지만 Goya, aol 또는 G 단위체 또한 풍부하게 존재합니다.물론, 양과 단일 단위 조성은 식물 조직과 종에 따라 다를 수 있습니다. 지금까지 다당류 분석을 위해 식물 재료의 리그닌 함량과 조성을 결정하는 방법을 보여드렸습니다. 파트 2로 넘어가십시오.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

공촛점 래맨 현미경에 따라 방법은 레이블이없는 식물 세포 벽에 리그닌의 시각화 및 다른 조직, 표본 또는 수종의 lignification의 비교를 내실수 것을 제공됩니다.

라벨 - 무료 현장에서</em식물 세포 벽 Lignification의> 이미징

이 연구의 목적은 계층 별 nanocellulose 원 섬유의 조립 및 묽은 수성 현탁액을 조립 절연 리그닌을 사용하여 합성 식물 세포벽 조직을 형성하는 것이었다. 수정 진동자 마이크로 밸런스 및 원자 힘 현미경의 표면 측정 기술은 중합체 - 고분자 나노 복합 재료의 형성을 모니터링하는 데 사용 하였다.

Nanocellulose, 리그닌의 날조 된 자립형 필름, 및 합성 폴리 양이온 : Biomimicking 나무를 향하여

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

이 프로토콜은 라만 이미징 및 다 변수 분석을 사용하여 식물 세포 벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시합니다.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

블 리스, lignification 역학 공부에 대 한 이중 라벨 프로토콜 개발 되었다. 합성 monolignol를 사용 하 여 기자와 SPAAC 및 CuAAC bioorthogonal의 순차적 결합 반응,이 방법론 포장 lignins에서 planta에의 속 규제 요인의 심층 분석 하는 방법 클릭 합니다.

Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

여기서, 우리는 초본 식물 바이오 매스에서 리그닌 함량의 추정을위한 수정 된 TGA 방법을 제시한다. 이 방법은 리그닌과 특정 티오에테르 결합을 형성하여 리그닌 함량을 추정하고, 리그닌 함량 추정을 위해 상대적으로 작은 샘플을 필요로 하기 때문에 클라슨 방법에 비해 이점을 제시한다.

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

31 P NMR은 폴리페놀의 구조적 용해를 위한 강력한 도구입니다. 리닌과 탄닌의 다양한 유형의 하이드록시, 페놀 및 카박스실 그룹의 정량화 및 분화를 허용하는 빠르고 쉽고 정밀하며 정량적이며 매우 재현 가능한 분석 절차가 이제 일상적인 분석 도구가 되었습니다.

리닌과 탄닌의 정량적 31P NMR 분석

학습하세요 식물 세포벽 리그닌 함량 및 조성 분석 방법을 통해 바이오매스 활용 가능성을 평가하는 기술을. 아세틸 브로마이드 가수분해와 UV 분광법, GC-MS를 활용한 정량 분석 프로토콜입니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

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