크리스토퍼 휴즈 : Angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

안녕하세요, 제 이름은 크리스토퍼 휴즈 박사입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스(University of California Irvine)의 교수이며, 제 연구실에서는 혈관 신생에 대해 연구하고 있습니다. 그리고 우리는 특히 혈관신생 과정을 조절하는 유전자에 관심이 있습니다.

우리는 Nelson의 연구를 기반으로 체외 분석을 최적화했으며, 이 분석에서 혈관 신생 중에 진행되는 모든 다양한 과정을 볼 수 있으며, 테덱스 비드, 작은 비드를 내피 세포로 코팅합니다. 그런 다음 이를 피브린 겔에 삽입합니다. 성장 인자를 제공합니다.

그리고 며칠에 걸쳐 내피 세포가 구슬에서 싹을 틔웁니다. 그들은 이동하고, 정렬하고, 증식하고, 튜브를 만들고, 분기하고, 문합을 형성합니다. 그래서 약 10일이 지나면 우리는 문화의 네트워크와 같은 완전한 모세혈관을 갖게 됩니다.

글쎄요, 엔비보(envivo)와 혈관신생 분석법(angiogenesis Assays)의 문제점 중 일부는, 예를 들어 쥐에서 수행되는 것들은 시스템을 조작하는 것이 그리 쉽지 않다는 것입니다. 동물 내부에서 이런 일이 일어나고 있을 때 상상하기 어렵고, 실제로 혈관 신생이 일어나는 것을 볼 수 없습니다. 그리고 체외 배양에서 시스템을 조작하고 싶다면 내피 세포를 유전적으로 조작하고, 유전자를 켜고 끄고, 그것이 발아 혈관 신생에 미치는 영향을 살펴보는 것이 매우 쉽습니다.

그리고 동물 전체에서 그렇게 하는 것은 훨씬 더 어렵습니다. 넉아웃이나 넉인을 해야 합니다. 이것이 두 가지 주요 장점입니다.

조작하기 쉽고 시각화하기 쉽습니다. 그래서 수년에 걸쳐 다양한 체외 무산소 분석법이 개발되었으며 모두 장점과 단점이 있습니다. 특히 잘 알려진 것은 매트릭스 겔 분석법으로, 내피 세포가 마트리겔(matrigel)이라고 하는 세포 외 기질 위에 배치됩니다.

그리고 문제는 내피 세포가 탯줄과 같은 구조를 만들지만 실제로는 제대로 된 알루미늄 혈관을 만들지 못한다는 것입니다. 싹이 트는 것도 보이지 않고, 문합도 보이지 않습니다. 콜라겐 젤 모델이 있는데 좋을 수 있습니다.

내피 세포의 증식을 볼 수 없는 경우가 많습니다. 문합은 보이지 않는 경향이 있습니다. 우리가 개발한 피브린 겔 분석법은 90년대 중반에 발표된 Nelson Kar의 모델을 기반으로 합니다.

그리고 우리는 이제 혈관 신생의 모든 단계를 볼 수 있을 정도로 극적으로 개선되었습니다. 우리는 초기 싹이 트는 것, 즉 이주를 볼 수 있습니다. 우리는 세포의 증식을 보고, 내강이 형성되고, 가지가 갈라지고, 마침내 문합을 통해 체외에서 완전한 혈관 네트워크를 형성하는 것을 봅니다.

따라서 이 분석법은 혈관 신생의 모든 다른 단계를 보고 싶다면 최고의 체외 시스템이라고 생각합니다. 이 체외 분석의 또 다른 장점은 레이저 캡처, 미세 해부를 할 수 있고, 배양물을 스핀다운하여 매우 평평하게 만든 다음 레이저 캡처 마이크로 해부 현미경을 사용할 수 있다는 것입니다. 우리는 실제로 개별 세포를 제거할 수 있으며 특히 팁 세포에 관심이 있습니다.

그래서 우리는 그것들을 잘라내고 있으며, 특히 관절 세포와 몸통 세포, 즉 실제로 내강을 만드는 세포에서 유전자 발현을 볼 수 있습니다. 그리고 우리의 가설은 이 두 세포 집단 사이에 차별적인 유전자 발현이 있을 것이라는 것입니다. 우리는 그것을 볼 수 있습니다, 생체 내 시스템에서 그렇게 하는 것은 거의 불가능할 것입니다.

따라서 우리는 이것이 in vitro Assay를 사용하는 또 다른 주요 이점이라고 생각합니다. 이 분야에서 수행된 초기 연구는, 제가 넬슨 레콘(Nelson Recon)이 언급했듯이, 그들은 미세혈관 내피 세포를 사용했습니다. 그리고 미세혈관 내피 세포(microvascular endothelial cell)에 대한 많은 생각이 있는데, 이 세포는 생체 내에서 실제로 새로운 혈관을 형성하는 것이 미세혈관 EC이기 때문에 이와 같은 분석에 사용하고 싶어하기 때문입니다.

우리는 ve로 이것을 시도하기로 결정했습니다. 이들은 몇 가지 이유로 인간의 제대 정맥 내피 세포입니다. 그 중 하나는 이러한 세포를 얻기가 매우 쉽다는 것입니다.

병원에 갈 수 있고, 분만실에서 탯줄을 얻을 수 있으며, 세포를 매우 쉽게 분리할 수 있습니다. 또한 이러한 세포는 수년 동안 배양에 사용되어 왔습니다. 그들은 매우 잘 특성화되어 있습니다.

그래서 우리는 이 분석을 설정하고 최적화하여 이러한 이유로 이 세포를 사용할 수 있도록 했습니다. 그리고 흥미롭게도, 이 큰 혈관 내피 세포는 미세혈관 내피 세포와 배양의 형태를 취하는 것으로 나타났습니다. 그들은 큰 혈관 ec에 의해 정상적으로 발현되는 많은 유전자를 잃고 일반적으로 미세혈관 내피 세포와 관련된 유전자를 발현하기 시작합니다.

그리고 그들은 콩나물처럼 모세관을 형성하고, 루멘을 만들고, 전 세계를 문화의 실제 모세혈관처럼 보이게 할 수 있는 완벽한 능력을 가지고 있습니다. 그래서 그들은 사용하기 쉽고, 사용하기 쉬우며, 우리가 원하는 것을 수행합니다. 그들은 싹을 틔우고 적절한 알루미늄 용기를 만듭니다.

이 분석을 정량화하고자 할 때 실제로 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다. 우리는 새싹의 수, 새싹의 길이, 새싹의 지름, 분지점의 수, 문합 수와 같은 정량적 기준을 볼 수 있지만 질적 기준도 살펴봅니다. 그래서 우리는 그것들이 루멘을 형성하고 있는지 볼 수 있습니다.

그리고 그것이 아마도 우리가 가장 관심을 갖고 있는 것일 것입니다. 우리가 수행하는 많은 분석에서 적절한 루멘 형성입니다. 그리고 그것은 실제로 질적 평가에 가깝지만, 혈관이 커짐에 따라 실제로 그 내강의 직경도 측정할 수 있습니다.

그래서 우리는 이러한 문화권에서 섬유아세포를 사용합니다. 우리는 비드를 피브린 겔에 삽입하고 겔 위에 섬유아세포를 도금합니다. 섬유아세포는 적절한 발아와 내강 형성에 절대적으로 필요합니다.

섬유아세포가 없으면 약간의 싹이 틔웁니다. 그러나 내피 세포는 서로 붙어 있지 않는 경향이 있습니다. 무슨 일이 일어나는가 하면, 그들은 서로에게서 멀어집니다.

그래서 이 새싹에서 개발하는 모든 구조는 무너지는 경향이 있습니다. 그리고 며칠 후, 내피 세포는 세포사멸을 겪습니다. 따라서 섬유아세포는 적어도 체외 시스템에서는 혈관 신생에 필수적인 요인을 만들고 있는 것으로 보입니다.

그리고 우리는 그러한 요인이 무엇인지 아는 데 매우 관심이 있었습니다. 우리가 발견한 것은 섬유아세포가 배지로 무언가를 분비하기 때문에 섬유아세포에서 조건 배지를 취할 수 있고 이는 적절한 발아와 내강 형성을 지원한다는 것입니다. 그래서 우리는 확실히 용해성 인자를 다루고 있습니다.

따라서 우리는 섬유아세포가 만드는 것이 무엇인지, 이 시스템의 혈관 신생에 매우 중요한 것이 무엇인지 아는 데 매우 관심이 있습니다. 우리는 모든 일반적인 용의자, VEGF, 기본 fg F는 문화에 있으며, 더 많은 것을 추가해도 섬유 아세포를 대체하지 않습니다. 우리는 또한 안지오포이에틴 원, TGF 베타, H, GF 등, 등등을 시도했습니다.

지금까지 우리는 중요한 요인을 찾지 못했습니다. 그래서 우리가 지금 하고 있는 것은 섬유아세포의 상태 배지에서 인자를 정제하는 것입니다. 그래서 우리는 다양한 열, 양이온, 교환, 크기 제외에 조건 매체를 배치하고 있으며, 그 중 활성이 있는 부분을 얻고 있습니다.

그리고 우리는 이제 그 활동을 추적하고 있으며, 그 분획을 취하고, 어떤 것이 활성인지 찾고, 거기에서 그것들을 겔에 실행하고, 겔에 상대적으로 적은 수의 띠가 있는지 확인한 다음, 그것들을 잘라내고 질량 분석기에 의한 염기서열 분석을 할 수 있습니다. 그리고 그것은 우리에게 많은 흥미로운 날들을 주고 있습니다. 우리는 현재 꽤 많은 후보 유전자를 가지고 있으며, 그것들이 실제로 우리가 찾고 있는 인자인지 확인하기 위해 개별적으로 테스트하고 있습니다.

그래서 우리는 알려진 많은 혈관 신생 인자를 테스트했으며 veg GF와 basic FGF가 이 분석에서 적절한 발아를 위해 실제로 필수적이라는 것을 알고 있습니다. 그러나 이것이 전부는 아닙니다. 제가 말씀드렸듯이 중요한 파생 요인이 있는데, 우리가 이 문제를 살펴본 한 가지 방법은 생체 내에서 혈관 형성이 매우 높은 종양 세포를 채취하여 생쥐에서 큰 종양을 생성하고 혈관화가 심하게 형성된 종양 세포를 취

우리는 이 종양 세포를 관찰했는데 이 세포들은 매우 높은 수준의 채소를 발현하고 이를 배양에 넣었습니다. 그래서 우리는 섬유아세포를 이 종양 세포로 대체했으며, 이 세포는 이 분석에서 강력한 혈관 신생을 지원하지 않습니다. 그리고 그것은 매우 흥미 롭습니다.

이것이 시사하는 바는, 다른 사람들도 제안한 바는, 종양, S 기질, 즉 섬유아세포와 조직의 다른 지지 세포, 그리고 내피 세포 사이에 혼선이 있다는 것입니다. 그리고 종양 세포는 내피 세포에 직접 작용하는 일부 인자를 생산할 수도 있지만, 섬유아세포와 다른 기질 세포를 자극하여 강력한 혈관 신생을 지원하는 인자를 만드는 다른 인자도 생산할 수 있습니다.