로블롤리 파인로부터 RNA 분리의 개선 방법 ( P. taeda L.) 및 기타 코니퍼 종

다음 내용은 조지아 대학교(University of Georgia)와 워넬 임학 및 천연자원 대학(Warnell School of Forestry and Natural Resources) 연구진에 의해 제작되었습니다. 본 시연 영상에서는 미국 내 임산물 생산에 있어 가장 중요한 침엽수종인 lob lolly pine으로 흔히 알려진 Pinus Teta로부터 xylem 및 phloem 조직을 채취하고 이후 RNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 나무를 베어낸 후(본 사례에서는 40년생 나무), 주 줄기를 약 50 cm 길이의 볼트로 절단합니다.

그 다음, 수피 제거를 용이하게 하기 위해 전기톱으로 볼트의 세로 방향 여러 곳에 흠집을 냅니다. 망치와 나무 끌을 사용하여 수피를 들어 올려 구획별로 벗겨낼 수 있게 합니다. 이어서, 유세포 조직을 손으로 제거하여 수피 구획의 내부에서 벗겨낸 뒤 즉시 액체 질소에 침지시킵니다.

수피를 제거한 후, 단면 면도날로 볼트 표면을 긁어내어 얇은 2차 xylem 층을 수집할 수 있습니다. 수분이 많은 xylem 조직은 즉시 액체 질소에 넣습니다. 이번 수확에서는 주 줄기에서 가지를 절단하기 전에 일반적으로 압축재(compression wood) 및 반대재(opposite wood)로 지칭되는 반응재 샘플도 함께 수집하였습니다.

먼저 분지의 방향을 스프레이 페인트로 표시하여, 분지 상단의 반전재(opposite wood)와 하단의 압축재(compression wood)라는 두 가지 조직 유형이 포함된 영역을 결정할 수 있게 합니다. 수피 제거 과정에서, 먼저 체인톱을 사용하여 압축재와 반전재를 구분하는 선을 따라 분지에 절개선을 긋고, 반응재의 유형에 해당하는 영역의 수피만 제거한다는 점을 제외하고는 주간 볼트와 동일한 방식으로 수피 제거를 수행합니다.

수확되는 나무는 어느 시점에서든 제거됩니다. 보통 이러한 작은 가지에서 커다란 수피 부분을 제거하는 것이 더 어렵습니다. 2차 xylem 반응재 표본은 면도날로 긁어낸 후 즉시 액체 질소에 침지시키는 방식으로 일반 2차 xylem과 동일하게 수집합니다.

압축재의 특징인 적갈색을 확인하십시오. 큰 나무에서 여러 개의 샘플을 채취하고 처리하려면 많은 인력이 필요하며, 각 담당자가 지정된 작업을 수행하여 모든 조직 유형을 동시에 채집함으로써 RNA 분해를 줄여야 한다는 점에 유의하십시오. 액체 질소로 급속 냉동된 샘플은 이후 라벨이 부착된 보관 백으로 옮겨져 드라이아이스와 함께 실험실로 운반됩니다. 첫 번째 단계는 Specs model 68 50 프리저 밀(freezer mill)을 사용하여 조직을 분쇄하는 것입니다. 유발과 공이로 갈아내는 방식과 비교했을 때, 이 단계는 액체 질소로 샘플을 차갑게 유지하면서 목질 조직 샘플의 RNA 추출 수율을 유의미하게 높여줍니다.

먼저 조직을 손으로 작게 조각낸 후 시료 챔버에 넣습니다. 챔버를 캐리어에 삽입하여 고정시킨 다음, 시료를 2분 동안 분쇄합니다. 최종 결과물은 거친 분말 형태의 농도를 띠게 됩니다.

RNA 추출 프로토콜은 이틀에 걸쳐 진행됩니다. 첫째 날에는 65°C로 가열한 RNA 추출 버퍼에 2.5g의 냉동 조직을 첨가합니다. 샘플을 격렬하게 흔들어 혼합한 후, 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하고 완만하게 뒤집어 섞어 샘플을 다시 혼합합니다.

다음으로 샘플을 회전 휠에 5분 동안 둡니다. 그 후 샘플을 고속 Teflon Oakridge 튜브로 옮기고 SS 34 로터에서 12,000 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. 상층의 수성 분획을 새 튜브로 추출하고 1/2 부피의 chloroform을 첨가합니다.

시료를 1분 동안 볼텍싱한 후 다시 회전 휠에 5분 동안 둡니다. 2차 원심분리 후, 수성 분획을 다시 50 mil 고속 폴리프로필렌 튜브로 추출하여 10,000 RPM에서 20분 동안 원심분리합니다. 잔류 입자를 제거하기 위해 시료를 50 mil Falcon 튜브에 붓고, 시료 부피의 1/4에 해당하는 10 molar 염화리튬을 첨가합니다.

시료를 흔들어 섞은 후 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, 염화리튬으로 침전시킨 시료를 먼저 4°C에서 11,000 RPM으로 30분 동안 원심분리합니다.

상층액을 따라내어 버리고, 튜브를 화학용 와이프 위에 뒤집어 1분 동안 둡니다. 과잉 액체를 제거한 후, 육안으로 확인 가능한 RNA 펠릿을 65 °C로 미리 가열한 800 µL의 뜨거운 SSTE 버퍼에 재현탁합니다. 펠릿이 완전히 용해되도록 펠릿 주변부와 전체적으로 여러 번 파이펫팅하십시오.

다음으로, 재현탁된 RNA를 Two Mil and Beyond RNA-free 마이크로 튜브로 옮깁니다. 샘플을 65 °C 워터배스에서 1~2분 동안 가열한 후, 볼텍싱하여 샘플이 완전히 재현탁되도록 합니다. 필요한 경우 이 과정을 반복할 수 있습니다.

이제 동일한 부피의 완충 페놀 클로로포름을 첨가합니다. 샘플을 15~20초 동안 볼텍싱하고 14,000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 수성 층을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 동일한 부피를 첨가합니다.

샘플은 이전 추출 과정과 동일하게 볼텍싱 및 마이크로 원심분리합니다. 최종 유기 추출 단계를 위해, Lock gel 튜브를 먼저 11,000 RPM에서 2분간 마이크로 원심분리합니다.

다음으로, 이전 추출 단계에서 얻은 RNA 샘플을 페이즈 락 젤(phase lock gel)에 넣고, 클로로포름을 샘플 부피의 절반만큼 첨가한 뒤 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그 후 샘플을 11,000 RPM에서 5분간 원심 분리하고, 상층액인 RNA 샘플을 새로운 Ambion RNA-free 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 다음 단계는 3 M sodium acetate pH 4.8을 샘플 부피의 1/10만큼, 100% ethanol을 2배 부피만큼 첨가하여 RNA를 간단히 침전시키는 것입니다.

시료를 볼텍싱하고 -80 °C 냉동고에 30분 동안 짧게 보관한 후, 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 작은 흰색 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% ethanol 1 mL로 세척한 후 흡입하여 제거하며, 최종 흡입 후 에탄올 세척을 반복합니다. 튜브를 벤치 위에 5분 동안 열어두어 잔류 에탄올을 증발시킵니다.

RNA 펠릿을 100 µL의 DEPC 처리수에 넣고, 볼텍싱과 65 °C 가열을 통해 재현탁합니다. 필요한 경우 이 과정을 반복할 수 있습니다. 이후 시료 농도를 측정합니다.

분광 광도법을 통해 262/280 및 262/230 비율을 계산하여 시료 내 단백질 및 탄수화물 오염 정도를 추정합니다. 1% AGROS 겔 전기영동을 사용하여 게놈 DNA 오염 및 RNA 분해 정도를 통해 시료의 품질을 정성적으로 추정합니다. 주요 시료의 무결성은 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 리보솜 28S/18S 비율과 RNA 무결성 지수(RIN)를 결정함으로써 추가로 평가합니다. LOB lolly pine의 조직 시료 채취 및 총 RNA 분리에 관한 영상을 시청해주셔서 감사합니다.

다음 인원들이 본 교육 영상의 촬영 및 제작을 담당하였습니다.