Name: Haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 Titre를 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 학습하세요 혈구응집검정법을 사용하여 혈청의 항체 반응성과 농도를 정량하는 방법을. U자형 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 적혈구와 반응을 관찰하고 마지막 양성 반응 희석도로 역가를 결정합니다.

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저자는 촬영에 대한 기술과 미스터 폴 목사는 수행 미스 로라 매튜스를 감사하고 싶습니다. 이 프로젝트는 사우스 오스트 레일 리아 대학, 연구소의 의학 프로그램에 의해 투자되었다.

5 배 Veronal 버퍼 살린 (VBS)의 준비 <ol><li> Veronal 버퍼 살린 (VBS)를 준비하려면, 별도의 세 가지 솔루션을 준비해야합니다. </li><li> 증류수의 350ml에 나트륨 Barbitone의 NaCl과 0.94gm의 21.25gm을 용해하여 용액 1을 준비합니다. NaCl과 나트륨 Barbitone의 최종 농도는 각각 1.02M과 13mM 있습니다. </li><li> 뜨거운 증류수의 125ml에 Barbitone의 1.44gm을 용해하여 용액 2를 준비합니다. Barbitone의 최종 농도는 62.5mM입니다. </li><li> 증류수의 100ml에 CaCl 2 MgCl 2 4.41gm의 20.33gm을 용해하여 용액 세를 준비합니다. MgCl 2, CaCl 2의 최종 농도는 각각 2.18M과 440mM입니다. </li><li> 믹스 솔루션 1, 2 룸 온도 냉각. </li><li> 통합 솔루션이 냉각되면, 솔루션 3 1.25 ML을 추가하고 1M HCL을 사용하여 7.3-7.5 수있는 산도를 조정합니다. </li><li> 배 재고 솔루션을 준비하는 증류수로 500ml로 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 1X 작업 솔루션을 준비하려면, 증류수와 주식 1:5 희석. </li></ol> Revercells의 희석 <ol><li> 부드럽게 전도에 의해 Revercells의 주식 솔루션을 resuspend 후 4 600g에서 5 분 세포 원심 분리기의 1ml를 제거 ° C. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 뜨는을 제거하고 Veronal가 살린 버퍼 1X의 3ml에있는 세포를 resuspend. </li><li> 세포는 이제 4 ° C까지 사용할 수 저장할 수 있습니다. </li></ol> 절차 <ol><li> 96 잘 U 바닥 접시의 행 A1 - A12에 1X VBS의 50ml를 전송합니다. </li><li> 자 A1면, 안티 - A 혈청 50μl를 추가하고 피펫을 사용하여 철저히 섞는다. </li><li> 신선한 피펫 팁을 사용하여, 잘 A1에서 액체의 50μl을 제거하고 잘 A2로 전송할 수 있습니다. 철저하게 혼합하고 잘 A11에 도달하고이 우물에서 마지막 50μl를 삭제 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 혈청 샘플은 현재 순차적으로 1시 2분에서 1:2048 2 배 희석되었습니다. 이 VBS 부정적인 컨트롤로 더 혈청 잘 A12에 추가되지 않습니다. </li><li> 하나 이상의 혈청 샘플은 평가되어야하는 경우, 반복 행의 B 등의 4.1-4.4 단계 </li><li> 일단 모든 dilutions가 있었고, 모든 우물 1 %의 Revercells의 50μl를 추가합니다. 참고 : Revercells 시간을 통해 해결하고 부드럽게 우물에 총동원되고 이전에 중단되어야합니다. </li><li> 부드럽게 microtitre 트레이의 측면을 두드리고하여 샘플을 믹스, 커버와 37 1H에 대한 진행 haemagglutination 반응 ° C.를 떠나 보육 또는 적절하게 가열 방을 사용할 수 있습니다. </li><li> 부화 다음, 조심스럽게 인큐베이터에서 트레이를 제거하고 haemagglutination에 대한 번호판을 검사합니다. VBS 컨트롤은 좋​​지 검사 가장 먼저해야합니다. 반응이 부정적이라면, 결과는 유효합니다. VBS 샘플은 긍정적인 haemagglutination 결과를 보여주는 경우, 결과는 사용할 수 없습니다와 과정은 반복되어야합니다. 부정적인 반응이 잘의 중앙에 세포의 작은 집중 펠렛으로 나타납니다 동안 긍정적인 haemagglutination 반응은 우물의 바닥에 넓은 시트로 표시됩니다. 중간 결과는 pelleted 세포의 중앙 코어와 함께 긍정적인 세포의 후광을 것입니다. 혈청 반응 수있는 AB를 가지고 본 결과가 발생하지만, AB의 부족한 금액은 전체 반응을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 대표적인 결과 섹션 예상 결과 두 도표 표현이 있습니다. 결과의 무효와 유효 기간 설정의 예제는 제공됩니다. 백신 혈청 titre도 결정됩니다. </li></ol> 대표 결과 : 비디오는 대표적인 결과의 예를 포함하고 있습니다. 아래 (Fig1과 그림 2) 도표 방식에 표시된 두 예제입니다. 두 번째 결정하는 titre을 허용 유효한 분석하는 동안 첫 번째 예제는 VBS 컨트롤이 긍정적으로 해석될 수없는 반응입니다. <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. haemagglutination의 예를 들어 긍정적인 결과는 실패했습니다 어디에. 위의 도표 표현에서 heamagglutination 반응은 허용되지 않습니다. VBS 혈청 부정적인 컨트롤은 물론의 기본에있는 시트 형성에 의해 입증으로 긍정적인 haemagglutination 반응을 표시합니다. 이것은 오류가 발생하고 그 결과가 수락 수 없다는 것을 나타냅니다. 이 경우 프로세스는 반복해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 긍정적인 결과가 올바르게 작동이 haemagglutination의 예. 도표 표현에서 heamagglutination 반응이 유효합니다. VBS 대조군은 부정적인 반응 haemagglutination에게 표시됩니다S는 우물의 바닥에 형성 하였다 펠렛에 의해 입증. 마지막으로 긍정적인 우물이 혈청 샘플에 대한 titre 128 (예 : 128분의 1의 상호)을 나타냅니다 행 7입니다. 이것은 혈청에서 적당한 금액에 존재하는 항체의 예입 것입니다.

haemagglutination 분석 시간이 짧은 기간 내에 평가하기 위해 혈청 샘플의 수많은 수있는 아주 간단한 방법입니다. 그것은 적합한되는 눈은, 전문 장비가 필요없이 읽을되는 장점도 있습니다. 이 기술은 또한 haemagglutination - 억제 테스트의 일환으로, 소변에있는 인간 chorionic gonadotrophin 호르몬의 검출을 위해 수정할 수 있습니다. 표준 haemagglutination 테스트와 관련하여, 관리가 제대로 수행할 수있는 분석하기 위해서는 주의할 필요가 몇 가지 영역이 있습니다. 첫째,이 기법은 오목 표면에 세포의 정착에 따라 달라집니다. 따라서, 그것은 U - 또는 라운드 바텀 microtitre 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 부정과 긍정적인 반응이 동일로 표시됩니다 일반적으로 엘리사에 사용되는 같은 평면 바닥 플레이트의 사용은 적합하지 않습니다. 또한 다른 혈청 샘플을 사용하는 경우, 반응 항체가 다양한 농도에 존재 가능성이있는 것으로 평가해야합니다. 높은 항체 농도에서, 항원...

<table><tbody><tr><td>Revercells</td><td>CSL</td><td>02490201</td><td>최종 농도 1%로 사용</td></tr><tr><td>Anti-A 혈청</td><td>CSL</td><td>02611305</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 U-바닥 플레이트</td><td>TRP</td><td>92097</td><td>반드시 U-바닥이어야 함</td></tr><tr><td>Veronal 완충 식염수</td><td></td><td></td><td>최종 농도 1x로 사용</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 배양실/인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 titre를 결정

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Haemagglutination는 응집의 구체적인 형태이며, 항체가 미립자 항원의 역할을 적혈구에 바인딩할 때 사용됩니다. 적혈구들이 쉽게 사용할 수 있으므로 특히 유용 타겟하고 응집이 육안을 사용하여 관찰할 수있다. 이 기술은 일반적으로 혈액 그룹화 및 바이러스에 대한 항체 부량의 titre (AB)를 결정하는 데 사용됩니다. 이 비디오에서는 haemagglutination 분석을 준비하고 수행에 관련된 단계는 혈액형 A - 항원은 적혈구 (Revercells)에 추가 특정 항체를 사용하여 증명합니다. 항혈청는 순차적으로 Revercells의 정지를 추가하는, U - 96 잘 하단 microtitre 트레이에 희석합니다. 샘플은 60 분 동안 혼합 후 ° C 37 incubated 수 있습니다. 이 시간 후, 샘플 그때 쉽게했습니다 + 적 및 중간 (-/+)의 haemagglutination 반응에 대한 채점 수 있습니다. 이 방법은 신속하고 간단한 방법을 사용하여 평가하는 혈청 샘플의 반응과 titre을 허용합니다. 비디오 분석을 수정할 수있는 방법을 titre를 결정하는 방법 결과를 읽고 해석하는 방법 분석 뒤에 이론, 그리고이 기술의 사용과 관련된 문제를 다룰 것입니다.

Haemagglutination는 항체가 적혈구에 바인딩 유착의 한 형태입니다. 적혈구가 모두 쉽게 사용할 수 있으며 그 결과는 즉시 육안을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이 비디오는 결과를 해석하고 titre을 결정, haemagglutination 분석에 관련된 단계를 설명합니다.

Haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 Titre를 결정

혈구응집은 응집의 특수한 형태로, 입자성 항원으로 작용하는 적혈구에 항체가 결합할 때 사용됩니다. 적혈구...

헤마글루티닌 분석법을 이용한 혈청의 반응성과 역가 측정. 응집 반응은 가용성 항체와 입자성 항원 사이에서 일어나는 반응입니다. 여기에는 세포나 운반 분자가 포함될 수 있습니다.운반체 표면의 에피토프는 항체가 결합하여 운반체들을 서로 가교 결합하게 하며, 이는 항원 항체 복합체라고 불리는 복잡한 격자 구조의 형성으로 이어집니다. 혈구 응집은 항체가 입자성 항원 역할을 하는 적혈구에 결합하는 특수한 형태의 응집 반응입니다. 적혈구는 쉽게 구할 수 있을 뿐만 아니라 그 결과를 육안으로 쉽게 확인할 수 있어 유용한 표적이 됩니다.혈청 샘플을 단계별로 희석한 후 96-웰 U-바닥 플레이트에 넣습니다. 그 다음 적혈구 현탁액을 첨가합니다. 고농도로 존재하는 항체가 적혈구와 결합하면 거대한 격자 구조가 형성됩니다.이 격자가 중력에 의해 가라앉으면서 ubo 플레이트의 모양에 맞게 형성됩니다. 위에서 보았을 때, 적혈구가 넓은 층을 이루고 있는 것이 관찰됩니다. 이는 헤마글루티닌 반응 양성을 의미합니다.항체 수준이 낮으면 격자가 형성되지 않으며, 적혈구가 UBO 플레이트의 모양에 따라 바닥에 모여 작은 펠렛을 형성합니다. 이는 음성 혈구 응집 반응입니다. 이 도식은 양성 반응을 보여줍니다.세포들이 가라앉으면서 격자를 형성하며, U자형 바닥 플레이트의 모양에 맞춰 배열됩니다. 왼쪽과 오른쪽에 보이는 평면도에서는 적혈구가 넓은 층을 이루고 있는 것을 볼 수 있습니다. 중간 정도의 항체가 존재할 경우, 일부 글자 형태의 응집이 관찰될 것입니다.혈구 응집 반응을 통해 기지의 항원에 대한 서로 다른 혈청 시료의 반응성을 테스트할 수 있습니다. 또한 혈청 시료의 역가(titer)를 결정할 수 있으며, 역가는 양성 반응이 관찰된 마지막 희석 배수를 의미합니다.일반적으로 혈청 샘플 내의 항체 농도가 높을수록 타이터(titer)가 높습니다. 이 도식은 음성 혈구 응집 반응을 보여줍니다. 적혈구를 가교 결합시키기에 항체의 양이 불충분한 상태입니다.세포가 중력에 의해 가라앉으면서 웰의 측면을 따라 내려가 바닥에 단단한 펠릿을 형성합니다. 오른쪽 도표는 위에서 본 적혈구의 모습입니다. 이 실험을 위해서는 1개의 96-웰 U-바닥 플레이트가 필요합니다.평평한 바닥의 플레이트를 사용하면 세포가 펠렛 형태로 침전되지 않아 결과 해석이 불가능하므로, 반드시 U자형 바닥 플레이트를 사용해야 합니다. 각 행의 웰에 50 µL의 테스트 혈청, 1% Riva 세포 현탁액, 그리고 1배 농도의 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 분주할 수 있는 피펫을 사용하십시오. 1번부터 12번까지, 50 µL의 PBS를 분주하십시오.이것을 희석액으로 사용합니다. 이제 A1 웰에 혈청 50 µL를 넣으십시오. 이것이 첫 번째 2배 희석액입니다.perpet을 사용하여 혈청 샘플이 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 혼합이 완료되면 well A1에서 50 µL를 취하여 well A2로 옮깁니다. 이것이 두 번째 1:2 희석 단계이며, 결과적으로 4배 희석이 됩니다.3번부터 11번 웰까지 사용하여 이 희석 시리즈를 계속 진행하십시오. 12번 웰은 royal buffer saline 음성 대조군으로 사용되므로 혈청을 넣지 마십시오. 이제 충분히 혼합된 1% Riva 세포 현탁액을 취해, A1번 웰부터 A12번 웰까지 50 µL씩 옮기십시오.세포를 첨가한 후, 플레이트를 덮고 가볍게 두드려 샘플과 세포가 잘 섞이도록 합니다. 그다음 37°C에서 60분 동안 배양합니다. 이때 습도가 유지되는 배양기를 사용하는 것이 적절합니다.60분 동안의 배양 기간 동안 항원-항체 상호작용이 일어나며 세포가 가라앉기 시작합니다. 시청하고 계신 영상은 60분 전체 기간을 촬영한 타임랩스 사진입니다. 이 화면은 5번부터 10번 웰(well)을 확대한 모습입니다.우리는 이미 이 실험에서 VBS 대조군이었던 12번 웰을 확인했습니다. 세포들이 단단한 펠렛(pellet)을 형성한 것으로 보아 분석이 적절하게 수행되었음을 알 수 있습니다. 5번과 6번 웰은 양성 혈구 응집의 예시입니다.7번 웰은 중간 응집 결과의 예이며, 8번, 9번, 10번 웰은 혈구 응집 반응에서 음성입니다. 이 결과에 따라, 양성 반응이 관찰된 마지막 웰인 7번 웰의 희석 배수를 기준으로 역가가 결정됩니다.

determining-reactivity-titre-serum-using-haemagglutination

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

이 비디오는 특정 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 혈응집 억제 분석을 보여줍니다. 테스트 웰에서의 적혈구 응집 억제 및 대조군 웰에서의 적혈구 응집의 확인은 뚜렷한 시각적 패턴을 통해 달성됩니다. 이 분석은 면역 반응, 백신 효과를 평가하고 바이러스학 및 면역학에서 바이러스 감염을 연구하는 데 중요한 역할을 합니다.

표적 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 Hemagglutination Inhibition Assay

이 비디오는 인간 혈청에서 α2,6 연결된 시알산을 과발현하는 Madin-Darby Canine Kidney cell을 사용하여 중화 항체를 측정하는 Microneutralization 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 종종 인플루엔자 인간 혈청학에...

인간 혈청에서 중화 항체 역가를 측정하기 위한 미세중화 분석

이 동영상은 혈청 샘플에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하는 분석을 보여줍니다. NA에 대한 항체를 포함하는 혈청 샘플을 페투인(fetuin)으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 바이러스를 추가하면 항체가 바이러스 NA가 fetuin을 쪼개고 갈락토오스 부분을 노출시키는 것을 방지합니다. 그런 다음 과산화효소(peroxidase-conjugated lectin)가 첨가되어 노출된 갈락토스에 결합합니다. NA 억제 항체 역가는 비색 테스트를 사용하여 측정되며, 여기서 과산화효소 기질은 고정된 렉틴 접합 과산화효소에 의해 절단되어 색상을 생성합니다.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

혈청에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 렉틴 분석법(ELLA)을 설명합니다. 이 분석은 땅콩 응집소를 사용하여 NA가 fetuin으로 코팅된 96웰 플레이트에서 시알산을 제거할 때 접근할 수 있는 갈락토오스 잔류물을 정량화합니다.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

제시 프로토콜 인플루엔자 백신 받는 사람 혈 청 샘플에서 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 hemagglutination 억제 시험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 hemagglutination에 의해 최적의 바이러스 성 항 원 농도를 결정합니다. 두 번째 분석 결과 hemagglutination 저해 하 여 인플루엔자-특정 항 체 titers 단정.

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

이 기사는 뉴캐슬병 바이러스 혈청학적 검사를 위해 4개의 혈구응집소 항원을 준비하는 간단한 방법을 제시합니다. 보다 엄격한 역적정 방법 및 잘 정의된 조정 프로세스와 결합하여 항원의 혈구응집역가를 정확하게 측정함으로써 테스트 효율성을 높이고 위양성을 줄이며 가금류의 질병 감시를 개선합니다.

뉴캐슬 질병 바이러스 혈청학의 혈구 응집 억제 분석을 위한 항원 준비의 최적화

고전 경로는 항체에 의해 활성화되고 대상 세포 용해에 culminates 있습니다.

50 % Haemolytic 보완 (CH 측정 50</sub혈청>) 활동

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