배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

이 영상에서는 배아 척수에서 운동 뉴런을 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 먼저 E 13 쥐 배아를 수확한 후 척수를 분리하는 과정으로 시작합니다. 분리 과정 중에 척수는 지붕판(roof plate)을 따라 절개하여 펼쳐진 책(open book) 형태로 준비합니다.

등쪽 조직 조각을 절개하여 튜브에 수집합니다. 등쪽 조직은 trypsin과 기계적 파쇄를 통해 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 교차 신경세포를 polylysine이 코팅된 유리 커버슬립이나 조직 배양 접시에 배양합니다.

이후 이를 통해 축삭 성장 및 유도의 세포 및 분자 기전을 연구할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 몬트리올 임상 연구소의 신경 발달 분자 생물학 연구실의 세바스찬입니다. 안녕하세요, 저 또한 신경 발달 분자 생물학 연구실의 스티브 모엔입니다.

오늘은 배아 척수에서 교차 뉴런을 분리하고 배양하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 축삭 유도의 세포 및 분자 기전을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

오늘은 해부 과정 전반에 걸쳐 L 15 배지가 담긴 접시에 놓인 갓 채취한 E 13 쥐 배아로부터 척수를 적출하겠습니다. 배아와 용액을 계속 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 모든 해부 단계에서 척수를 과도하게 잡아 늘리지 않도록 주의하십시오. 이는 완전한 형태의 척수를 분리하는 데 방해가 될 수 있습니다.

해부 현미경 하에서 배아를 모든 배외 조직 및 배아막으로부터 분리합니다. 그런 다음 배아 하나를 해부 접시에 놓습니다. 미세 가위를 사용하여 여기에 표시된 각도에 따라 머리와 후방 부위를 잘라냅니다.

이렇게 하면 평평한 표면이 생성되어 척수까지 쉽게 접근할 수 있도록 배아를 배치하는 데 도움이 됩니다. 배아의 복측이 아래로 향하게 하고 앞쪽이 바깥쪽을 향하도록 배치하십시오. 핀셋을 사용하여 배아의 한쪽 면을 단단히 고정하십시오.

포셉을 꽉 쥐거나 갑자기 놓지 마십시오. 그렇지 않으면 두 번째 포셉으로 잡고 있는 조직이 찢어질 수 있습니다. 척수 측면의 피부를 잡으십시오. 고정 포셉의 끝부분을 비틀어 줍니다.

배아의 등 쪽을 덮고 있는 피부를 벗겨 뇌수막으로 둘러싸인 척수를 노출시키고, 척수 오른쪽에 있는 조직을 부분적으로 분리합니다. 닫힌 핀셋을 사용하여 고정 핀셋이 위치한 높이부터 조직을 찌릅니다. 척수를 건드리지 않으면서 최대한 척수에 가깝게 접근하십시오.

척수 전체를 따라 여러 번 반복합니다. 이렇게 하면 일부 등쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglia)이 부착되고 배쪽 기관들이 파괴됩니다. 앞쪽 끝에서부터 시작하여 앞쪽과 뒤쪽 끝에 일부 조직이 부착된 상태로 남겨둡니다.

갈고리 모양의 텅스텐 바늘을 사용하여 뇌수막을 절개하고 roof plate를 따라 척수를 엽니다. 배아를 180도 회전시킨 다음, 동일한 방법을 사용하여 남은 쪽의 조직을 파쇄합니다.

그 다음 척수 왼쪽에 있는 조직, 즉 이전에 손상되었던 원래 오른쪽 부분을 완전히 분리하고 척수를 옆으로 눕힌 뒤 핀셋을 사용하여 남아 있는 중간엽 조직과 후근신경절의 대부분을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 뇌수막의 짧은 플랩을 벗겨 엽니다. 이 시점에서 뇌수막과 척수는 샌드위치 형태의 두 층 조직이 됩니다.

포셉을 사용하여 척수의 앞쪽 끝부분에 있는 더 큰 부분을 고정합니다. 포셉으로 분리된 두 세그먼트를 잡고 뇌수막을 벗겨냅니다. 이때 부드럽고 일정한 동작으로 수행해야 하며, 불균일하게 벗겨낼 경우 뇌수막 층이나 척수가 손상될 수 있습니다.

견인 과정에서 뇌수막 층이 찢어지면, 뇌수막에 붙어 있는 척수 부분은 보통 회복이 불가능합니다. 다만 때로는 가능할 수도 있습니다. 더 많은 배아를 처리하기 전에, 플라스틱 파이펫을 사용하여 분리된 척수를 10% 열불활성화 말 혈청이 포함된 L 15 배지가 담긴 얼음 위의 디쉬로 조심스럽게 옮기십시오.

배아의 온도를 낮게 유지하고 조직의 무결성을 보존하기 위해 해부 접시의 배지를 차갑게 식힌 L 15로 교체하십시오. 등쪽 척수 해부 단계로 넘어가기 전에 모든 배아에서 척수를 채취하십시오. 등쪽 척수 해부를 시작하려면, 신선하게 분리한 척수 하나를 10% 열 불활성화 horse serum이 포함된 L 15가 담긴 페트리 접시에 넣으십시오.

후뇌의 일부가 포함된 더 넓은 전방 부위를 잘라냅니다. 그 다음 척수를 평평하게 펴서 펼쳐진 책 모양으로 놓습니다. 척수를 펼친 상태에서 직선형 텅스텐 바늘로 고정하고, L자형 텅스텐 바늘을 사용하여 척수 절반 너비의 약 5분의 1에 해당하는 조각을 잘라내는데, 이때 배측 조직은 펼쳐진 척수의 가장 외측 부분에 위치합니다. 더 넓은 조각을 자르면 수율은 증가하지만 배양의 순도는 감소합니다.

여러 개의 등쪽 스트립(dorsal strips)을 10% 말 혈청이 포함된 L 15 배지가 들어 있는 15 milliliter 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 둡니다. 이후의 모든 과정은 조직 배양 후드 근처 또는 내부에서 진행됩니다. 이러한 배양의 경우, 일반적으로 해부 전에 용액과 장비를 미리 준비하는 것이 중요합니다.

tation 단계에서는 두 가지 크기의 화염 연마된 파스타 파이프를 사용하며, 하나는 원래 크기의 절반 지름이고 다른 하나는 그보다 약간 더 작습니다. 시작하기 전, 파이프 내부로 배지를 흡입하여 30초 동안 그대로 두어 두 개의 화염 연마된 파이프를 혈청 함유 배지로 코팅하십시오. 이렇게 하면 ation 과정 동안 유리가 세포에 달라붙는 수를 줄일 수 있습니다.

먼저 등쪽 조각들이 튜브 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. 층류 정화대(lamina flow hood) 아래에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액의 대부분을 제거합니다. 차가운 마그네슘 및 칼슘 제거 HBSS 3 mL로 빠르게 세척하십시오.

등쪽 신경관 조각이 2분 동안 가라앉도록 둡니다. 그 다음 파스타를 사용하여 HBSS를 제거합니다. 부피를 4.7 milliliters까지 채웁니다.

따뜻한 HBSS를 사용하여 2.5% trypsin 0.3 mL를 첨가하여 최종 농도가 0.15% Tryin이 되도록 하고 부드럽게 혼합한 후, 37 °C 항온수조에서 7분 동안 배양합니다. 배양 중간에 한 번 부드럽게 혼합해 줍니다. 배양이 완료되면 DNAse를 첨가하여 최종 농도가 150 units/mL가 되게 하고, magnesium sulfate를 첨가하여 최종 농도가 0.15%가 되도록 한 뒤 짧게 혼합합니다.

이제 등쪽 신경관 절편들이 조각나 있어야 합니다. 조직 조각들을 200 G에서 4분 동안 원심분리하십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고, 튜브 바닥에 약 50~100 µL의 액체만 남기십시오.

튜브를 가볍게 튕겨 펠릿을 풀어줍니다. 그다음 따뜻한 HBSS 5 mL를 첨가하여 세포를 세척합니다. 상온에서 2분 동안 세포가 가라앉도록 둡니다.

세포를 다시 원심 분리하여 세척합니다. 이번에는 2 mL의 따뜻한 HBSS에 다시 현탁합니다. 직경의 절반 크기인 화염 연마 피펫(fire polish pipet)을 사용하여 세포를 4~6회 천천히 파이펫팅하여 분쇄하고, 더 큰 덩어리를 깨뜨려 세포 사멸을 줄이기 위해 튜브 벽면을 향해 액체를 분사합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하고 과하게 피펫팅하지 마십시오. 화염 연마된 가장 작은 구경의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 동일한 방식으로 천천히 3~4회 흡입 및 배출함으로써 세포를 추가로 해리시킵니다. 죽은 세포와 잔해물로 인해 응집체가 형성되는 경향이 있으므로, 모든 세포 덩어리를 완전히 해리시킬 필요는 없습니다.

조직 파편이 1분 동안 가라앉도록 둡니다. 그런 다음 hemo soter에서 계수하기 위해 부유 세포가 포함된 SUP 상층액 20 µL를 제거합니다. 이때 뉴런은 trypan blue 염색판 기준으로 최소 95%의 생존율을 보여야 합니다. 뉴런을 귀하의 응용 분야에 적절한 농도로 neurobasal 플레이팅 배지에 분주합니다.

16~18시간 후, 세포가 떨어지는 것을 방지하기 위해 배지를 neural basal growth media로 교체합니다. 뉴런의 경우, 진공 펌프로 흡입하는 대신 피펫으로 배지를 조심스럽게 제거합니다. 다음은 PLL 코팅된 유리 커버슬립에 분리된 commissural neurons를 배양한 대표적인 결과이며, 배양 4시간 후의 모습과 배양 30시간 후 뉴런이 표면에 부착된 모습입니다.

대부분의 뉴런은 가시적인 성장 원추를 가진 신장된 축삭을 가지고 있습니다. 이러한 뉴런은 면역형광 실험에 쉽게 활용될 수 있습니다. 본 예시에서는 미세소관은 녹색으로, 액틴은 적색으로, 그리고 NA는 청색으로 표지되었습니다.

지금까지 배아 척수에서 교차 신경세포를 분리하고 배양하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 교차 신경세포의 순도는 분리해낸 등쪽 띠의 두께에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.