Name: Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: 배우세요 기도 상피 세포 분리 및 배양 프로토콜을 사용하여 기도 상피의 역할을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 폐 질환 메커니즘 연구에 필수적인 원발성 인간 세포를 제공합니다.

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저자는 기관지 조직을 제공하는 박사 리차드 Inculet 매우 감사하고 있습니다. 연구 윤리위원회 승인은 성 요셉의 건강 해밀턴 및 웨스턴 온타리오 / 런던 건강 과학 센터 (박사 데이비드 매코맥), 조직 및 아카이브위원회, 병리의학과의 대학에서 얻은했다. 또한 immunostaining에 필요한 자료의 일부를 제공하는 우리의 알리 문화의 템즈와 다니엘라의 Farkas를 제공 어니 스핏쳐를 (전자 현미경, 맥매스터 대학교) 감사합니다. 이 작품은 온타리오 흉부 학회에서 차단 기간 부여에 의해 투자되었다; 박사 Asma Yaghi는 FSORC 장학금, 성 요셉의 건강, 해밀턴, 온타리오, 캐나다에 의해 지원되었다.

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</ol>

본 연구에서는 우리는 문화와 기본 인간 기관지 상피 세포의 확장에 대한 자세한 방법을 제시. 우리는 explants과 상피 세포의 성장을 촉진 미디어 교양 기관지 조직,의 이식이 아닌 차별 (잠수)과 차별 (공기 - 액체 인터페이스에서 성장) 세포 모델 연구를위한 인간기도 상피 세포의 지속적인 소스를 제공하는 방법을 시연 . 이러한 전지는보다 밀접하게 그들의 진짜 physiologic 환경에서 세포 유사한되는 약물 테스트 시스템에서 이용하​​실 수 있습니다. 그것은 당신이 explants / 이식에서 성장과 조약돌 형태를 확인 세포를 감시하는 것이 매우 중요합니다. 세포가 다른 형태를 보여주면, 세포 explants / 이식을 모두 폐기하고, 오직 성공적인 조직을 이식 계속합니다. 우리 손에 알리 문화는 이전에 보고된 것보다이 설립 더 걸렸습니다. ALI에서 매일 미디어를 변경하면 빠른 상피 세포의 분화와 속눈썹의 성장을 촉진 수도 수도 있습니다. 우리는 ...

기타 요구 사항 : 보육, 생물 안전 캐비닛 (BSC), 원심 분리기, 100mm 문화 접시, 멸균 튜브 (15 ML 50 ML, 2 ML), 멸균 피펫 팁, 메스 핸들과 블레이드, 작은 날카로운 가위, 실험실 외투와 장갑. 이러한 선호하는 공급 업체에서 구할 수 있습니다.

explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

인간 기관지 상피 세포는 질병의 세포 모델에 필요한이며 기능과 인간의 상피 세포의 구조에 excipients 및 pharmacologic 대리인의 효과를 조사합니다. 여기 자세히 폐 수술 (예 : 폐암이나 폐 볼륨 감소 수술)의 시대에서 외과 의사에 의해 수확이다 기관지기도 조직의 기관지 상피 세포를 성장하는 방법을 설명합니다. 윤리 승인 및 통지 동의, 외과 병리에 필요한 무엇 소요되며 병에 걸린 지역에서 원격 기관지 부분으로 우리를 제공합니다. 조직은 다음 문화의 주요 기관지 상피 세포를 성장 사용할 수 explants의 소스로 사용됩니다. 0.5 - 1cm 길이 직경 ≤ 1cm에 대한 기관지 구간은 추위 EBSS 및 초과 parenchymal 조직 제거와 씻어서 있습니다. 세그먼트는 개방 절단 2~3mm에 다진 아르<sup&gt; 3</sup&gt; 조직 조각. 조각은 기본 세포의 원천으로 사용됩니다. 콜라겐의 조합 (30 μg / ML), fibronectin (10 μg / ML), 그리고 BSA (10 μg / ML)로 1-2 시간에 대한 코팅 100mm 문화 플레이트 후, 접시는 4-5 영역과 조직에 긁힌 아르 조각이 긁힌 부분에 배치됩니다 5 % CO에서 다음 상피 세포의 성장에 적합한 배지 (첨가제와 DMEM / 햄 F - 12)가 추가되고 플레이트는 37 인큐베이터에 배치됩니다 ° C를<sub&gt; 2</sub&gt; humidified 공기. 문화 매체는 모든 3-4일 변경됩니다. 상피 세포 3-4 주 약 1.5 cm 직경의 고리를 형성 조각에서 성장. Explants 새로운 사전 코팅 접시에 그들을 이동하여 6 회까지 다시 사용할 수 있습니다. 전지는 계산 풀링 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용 해제, 그들의 숫자를 증가 T75 셀 바인딩의 flasks에 다시 도금입니다. 2-3000000 세포는 4 주 동안 80 % 합류하기 위해 성장과 T75 flasks는 씨앗. 확대 기본 인간의 상피 세포는 교양과 공기 - 액체 인터페이스에서 차별화할 수 있습니다. 방법은 신선하게 분리된 조직에서 인간 기관지 상피 세포의 풍부한 소스를 제공하고 질병의 모델로 이들 세포를 연구 및 약리학 및 독성학 심사에 대해 허용을 여기에서 설명한.

우리가 공기 - 액체 인터페이스에서 차별화된 성장을 포함한 인간 기관지기도 조직의 explants에서 기본 인간 기관지 상피 세포의 성장에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 방법은 인간의 폐 건강과 질병의기도 상피의 역할을 조사하는 주요 세포의 풍부한 소스를 제공합니다.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

질병의 세포 모델을 구축하고 부형제 및 약물이 ...에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간 기관지 상피 세포가 필요합니다.

본 논문에서는 갓 분리한 인간 기관지 분절로부터 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 확장시키는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 코딩 및 스크래칭, 100mm 배양 플레이트, 기관지 조직 복구, 기관지 조직 이식편의 전개, 섬모가 발달하며 성장하는 인간 기관지 상피 세포의 계대 배양, 트랜스웰(transwell) 상의 인간 기관지 상피 세포의 다섯 가지 섹션으로 구성됩니다. 시작하기 전에, 모든 단계는 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내에서 수행되어야 함에 유의하십시오.별도로 명시되지 않는 한, 재료, 시약 및 준비 섹션을 읽고 기본 준비가 되었는지 확인하십시오. 다음의 코팅, 스톡 솔루션 배양, 배지 해리 용액, 코팅 및 스크래치 작업은 100 mm 배양 플레이트에서 수행해야 합니다.모든 과정을 무균 상태로 유지하십시오. 멸균된 100 mm 배양 접시와 코팅 용액을 준비합니다. BST 피펫을 사용하여 코팅 용액 2 mL를 100 mm 접시에 넣고, 접시 바닥이 코팅되도록 가볍게 흔들어 섞어줍니다.코팅 용액이 플레이트 바닥을 고르게 덮었는지 확인하십시오. 남은 용액을 피펫으로 옮겨 두 번째 100 mm 플레이트를 코팅하는 데 사용하십시오. 필요한 플레이트 수만큼 이 과정을 반복하십시오.필요한 플레이트의 수는 조직 절편의 수에 따라 달라집니다. 코팅 용액이 플레이트 바닥을 고르게 덮었는지 확인하십시오. 시연된 바와 같습니다.플레이트를 덮개로 덮습니다. 인큐베이터에서 1~2시간 동안 플레이트를 건조시킨 후, 기관지 조직 explant를 위해 사용하기 전 과잉 용액을 흡입하여 제거합니다. 사용하지 않은 코팅 배양 플레이트는 멸균 백에 넣어 4 °C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.70% ethanol로 소독한 작고 날카로운 가위, 메스 및 핀셋을 사용하여 BSC 내의 플레이트에 긁힘(scratch) 코팅을 하며, 메스로 강하게 눌러 플레이트당 최소 4개의 깊고 작은 XS 모양의 흠집을 만듭니다. 긁힘이 충분히 깊지 않으면 조직 조각들이 고정되지 않고 떠오르게 됩니다. BSC 외부의 P3 디쉬에 조직을 넣습니다. 분리된 인간 기관지 조직을 BSS로 충분히 헹굽니다.기관지 조각들을 개방합니다. 조직을 BS로 가져와 차가운 DM EM ham F 12 및 1% 항생제-항진균제(antibiotic anti mycotic)가 담긴 멸균된 100mm 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 작고 날카로운 가위를 사용하여 조직을 2~3mm 크기의 정육면체 조각으로 절단합니다.핀셋을 사용하여 절단된 조직 한 조각을 각 X의 중앙에 놓고 누릅니다. 조직 조각 또는 X 외식편이 플레이트에 몇 초 동안 부드럽게 부착되도록 둡니다. 그런 다음 완전 배지 10 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 배지를 첨가한 후 조직이 떠 있다면, 핀셋을 사용하여 조직을 X의 홈 안으로 밀어 넣거나 새로운 X를 만듭니다. 홈이 충분히 깊지 않은 경우 새로운 X를 만들어야 할 수도 있습니다.플레이트를 인큐베이터에 넣고 조직을 이식할 준비가 될 때까지 3~4일마다 배지를 교체합니다. 상피 세포가 조직 주변으로 1~2cm 영역을 덮을 만큼 충분히 성장할 때까지 약 4주가 소요됩니다. 100mm 코팅 및 스크래치 플레이트를 사용하십시오.일부 조직 외식편의 배양이 성공하지 못할 수 있으므로, 플레이트의 수는 이식하려는 조직 조각의 수에 따라 결정됩니다. 이전에 코팅하여 4°C에서 보관한 플레이트를 사용하는 경우, 사용 전 실온으로 가져오십시오. 핀셋을 사용하여 원래 플레이트에서 조직을 조심스럽게 집어 새 플레이트의 축 중심에 놓고 가볍게 누릅니다. 성장이 없는 조직은 폐기해야 합니다.조직이 플레이트에 부착되도록 둡니다. 몇 초 동안 배지를 추가하고 배양합니다. X 설명에 대해 앞서 기술한 내용을 추가하십시오.각 100 mm 조직 배양 플레이트당 2 mL의 trypsin 및 EDTA 스톡 용액을 사용합니다. 스톡 용액을 6 mL의 멸균된 0.01 M PBS로 희석하며, 스톡 용액 2 mL를 PBS 6 mL에 혼합하여 최종 농도가 trypsin 250 µg/mL, EDTA 100 µg/mL가 되도록 합니다. 외식편(explants)을 새 플레이트로 옮긴 후, 1~2 cm 크기의 세포 링이 형성된 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다.각 100 mm 플레이트에 따뜻하게 희석된 drips 및 edt 용액 8 mL를 추가합니다. 그리고 37 °C 인큐베이터에 3~15분 동안 넣어둡니다. 자주 확인하십시오.트립신을 너무 오래 처리하면 세포가 손상될 수 있습니다. 현미경으로 플레이트를 확인하여 대부분의 세포가 떨어졌는지 확인하십시오. 8배율 확대 영상에서 보는 바와 같이 세포는 둥글게 변하며 떨어져 나갑니다. EDTA 용액을 불활성화하기 위해 플레이트당 10% FBS가 포함된 배지를 첨가하십시오.모든 플레이트의 부피를 하나의 튜브에 합치거나 조직별로 서로 다른 튜브에 나눕니다. Hema Cytometer를 사용하여 세포 수를 측정하고, 100 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 세포 펠렛이 형성되면, 이를 완전 배지에 재부유시켜 원하는 세포 농도로 맞춥니다.T 75 플라스크당 200만 내지 300만 개의 세포를 분주하고 필요한 만큼 완전 배지를 첨가합니다. 배양하며 배지를 교체합니다. 3~4주마다 세포가 T 75 플라스크 내에서 sub confluence 상태로 성장합니다.약 4주 후에 세포를 떼어내어 확장하거나, 노화를 방지하기 위해 sub confluence 상태에서 사용해야 합니다. 먼저 transwell의 투과성 막을 준비하십시오. 24-well 멀티웰 플레이트에 맞는 6.5 millimeter 인서트를 사용하십시오.멤브레인 양면에 배지를 추가합니다. 바닥면에는 6 mils, 윗면에는 0.1 mils를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.막의 양쪽에서 배지를 조심스럽게 제거하십시오. 기저부 부피부터 시작하여 조심스럽게 제거해야 하는데, 이는 막이 쉽게 손상될 수 있기 때문입니다. 따라서 배지 권장량을 사용하여 배양 인서트의 측면을 따라 배지를 파이펫으로 흡입하십시오.그렇게 하지 않으면 배지가 세포를 접종할 다른 웰로 넘쳐흐를 수 있습니다. 투과성 지지체를 사전 배양한 후, 6.5 millimeter 웰의 막 상단(apical side)에 0.1 mL의 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 접종합니다. 막 하단(basal side)에는 0.6 mL의 배지를 피펫팅합니다.10일 동안 세포의 정단면(epical side)과 기저면(basal side) 모두에 배지를 공급하십시오. 잘 분화된 배양 상태를 확립하기 위해 일주일에 두 번 배지를 교체하십시오. 시연된 방법을 사용하여 기저면의 배지 볼륨을 제거하십시오.먼저, 상단 배지를 교체하고 멤브레인의 기저측에 0.6 mL의 배지를 추가합니다. 이 방법은 세포의 멤브레인 부착을 촉진하고 세포가 장시간 공기에 노출되는 것을 방지합니다. 배지를 빠르게 교체한 후 인큐베이터에 다시 넣습니다.10일째에 AAL 배지를 제거하고 멤브레인의 기저측 배지를 0.6 mL로 교체하여 공기-액체 계면(air liquid interface)을 형성합니다. 6주 동안 공기-액체 계면 상태로 세포를 배양하며, 배지는 일주일에 두 번 교체합니다. 공기-액체 계면 형성 4주 후부터 섬모 세포가 나타나기 시작합니다.액체 계면. 세포들은 섬모 세포로 균일하게 분화될 것입니다. 귀 액체 계면 형성 6주 후의 모습입니다.적출물 및 이식물에서 유래한 건강한 상피 세포가 포함된 인간 기관지 분절입니다. 본 연구에서는 기관지 조직 적출물로부터의 배양이 9개 조직 중 8개에서 성공적으로 이루어졌습니다. 적출물 배양물 중 하나가 감염된 것을 제외하고, 상피 세포 링은 3~4주 만에 반지름 1~2cm에 도달했습니다.성공적인 X explant는 최대 6회까지 다시 배양되었습니다. 모든 성공적인 배양물은 이식 시작 후 48시간 이내에 세포 이동의 증거를 보이거나, B 세포에서 보여지는 것처럼 이러한 상피 세포의 특징인 자갈 모양(cobblestone appearance)의 X explant를 나타냈습니다. 이후의 그림들에서, explant 유래 세포와 커버슬립에 파종된 세포의 사이토신 준비물에 대한 면역 염색 결과, 모든 세포가 상피 특이적 cytokeratin에 양성 반응을 보였으며, 여기에는 T 75 플라스크에서 sub confluence 상태까지 성장한 인간 하위 배양 기관지 세포가 표시되어 있습니다. 자갈 모양의 외형에 유의하십시오.인간 기관지 세포의 계대 배양물은 keratin과 E.Cadherin에 대해 균일한 양성 면역염색을 나타냈습니다. 다른 세포 유형에 대한 특이 항체를 이용한 면역염색에서는 섬유아세포, 중간엽 세포 또는 내피세포에 의한 배양물 오염 징후가 나타나지 않았습니다. 자세한 내용은 본문의 그림 5와 해당 범례를 참조하십시오. 투과성 폴리에스테르 막 또는 트랜스웰(transwells)에서 배양된 세포는 액체-기체 계면(liquid interface)을 통해 여기서 입증된 바와 같이 섬모 상피로 분화되었습니다. 여기서 입증된 것과 다른 형태의 세포가 나타나기 시작하면 세포와 그 이식물을 폐기하십시오. 본 프로토콜에서는 일차 인간 기관지 상피 세포의 배양 및 증식을 위한 상세한 방법을 제시하였습니다.인간 폐 질환 메커니즘의 중요한 경로를 결정하고, 새로운 약물의 독성 및 약리학적 스크리닝을 수행하기 위해서는 인간 세포 기반 연구가 필요합니다. 본 연구에서 설명하는 방법이 여러분이 절제 조직으로부터 인간 기관지 상피 세포를 배양하고, 이를 연구 시스템에 활용하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 감사합니다. 행운을 빕니다.

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인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

일차 인간 기관지 상피 세포는 형질도입이 어렵습니다. 이 프로토콜은 렌티바이러스의 생산과 농도뿐만 아니라 가성층화된 상피로의 분화를 통해 이러한 세포에서 매우 효율적인 형질도입을 달성하는 데 필요한 최적의 배양 조건을 설명합니다.

최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

본 프로토콜은 인간 유도만능줄기세포 유래 제2형 폐포 상피유사세포(iAT2s)를 기술한다. 이들 세포는 3D 배양물에서 자가재생 구체로서 배양되거나 공기-액체 계면(ALI) 배양에 적응될 수 있다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 유형 2 폐포 상피 세포의 3D 구체 및 2D 공기-액체 계면 배양 생성

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

배우세요 기도 상피 세포 분리 및 배양 프로토콜을 사용하여 기도 상피의 역할을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 폐 질환 메커니즘 연구에 필수적인 원발성 인간 세포를 제공합니다.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

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