Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

이 기사에서는 갓 분리된 인간 기관지 분절에서 인간 기관지 상피 세포의 성장 및 확장을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 코딩 및 스크래치, 100mm 배양 플레이트, 기관지 조직 복구, 엑스플랜 기관지 조직 이식, 섬모가 성장하는 인간 기관지 상피 세포의 통과, 트랜스웰의 인간 기관지 상피 세포의 5개 섹션으로 구성됩니다. 시작하기 전에 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행된다는 점에 유의하십시오.

달리 명시되지 않는 한, 재료, 시약 및 준비 섹션을 읽고 현명하게 준비했는지 확인하십시오. 다음 코딩, 재고 용액 배양, 매체 해리 솔루션, 코팅 및 긁힘. 100mm 배양 플레이트는 bst에서 수행해야합니다.

모든 것을 멸균 상태로 유지하십시오. 멸균 100mm 배양 플레이트와 코팅 용액을 놓습니다. BST 피펫에서는 두 개의 코팅 용액과 100 밀리미터 플레이트가 소용돌이 치며 플레이트의 바닥을 코팅합니다.

코팅 용액이 플레이트 바닥을 고르게 덮고 있는지 확인하십시오. 남은 용액을 피펫으로 빼내고 두 번째 100mm 플레이트를 코팅하는 데 사용합니다. 필요한 만큼의 접시에 대해 반복합니다.

필요한 플레이트의 수는 조직 이식의 수에 따라 다릅니다. 코팅 용액이 플레이트 바닥을 고르게 덮고 있는지 확인하십시오. 시연된 바와 같이.

덮개로 접시를 덮으십시오. 인큐베이터에서 플레이트를 1-2시간 동안 건조시키고 사용하기 전에 접근 용액을 흡입합니다. 기관지 조직 설명에 사용합니다. 사용하지 않은 코팅된 배양 플레이트는 멸균 백에 넣어 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

70% 에탄올이 함유된 스프레이 깨끗하고 작고 날카로운 가위, 메스 및 집게를 사용하고 메스로 단단히 눌러 BSC 스크래치 코팅된 플레이트에 넣어 플레이트당 최소 4개의 깊고 작은 XS를 형성합니다. 긁힌 자국이 충분히 깊지 않으면 조직 조각이 주사기에 가라앉지 않고 BSC 밖으로 떠다니며 조직을 P 3 접시에 담습니다. 분리된 인간 기관지 조직을 Bss out에서 철저히 헹굽니다.

기관지 조각을 엽니다. BS로 조직을 가져오고 DM EM 햄 F 12 플러스 1% 항생제 항균제를 가진 메마른 100 밀리미터 조직 배양 판으로 옮기십시오. 날카롭고 작은 가위를 사용하여 조직을 2-3mm 입방체 조각으로 자릅니다.

잘라낸 티슈 한 장을 집게로 각 X의 중앙에 놓고 누릅니다. 조직 조각 또는 X 외식식물이 몇 초 동안 플레이트에 부드럽게 부착되도록 합니다. 그런 다음 10mil의 완전한 미디어를 부드럽게 추가합니다. 조직이 떠오르는 경우 미디어를 추가한 후 집게를 사용하여 조직을 X의 융기로 밀어 넣거나 융기가 충분히 깊지 않은 경우 새 X를 만들기 위해 새 X.It 만들어야 할 수 있습니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣고 3-4일마다 배지를 교체하면 조직을 이식할 준비가 됩니다. 조직 주변에 1-2cm 영역을 덮을 만큼 충분한 상피 세포가 자라면 약 4주가 걸립니다. 100mm 코팅되고 긁힌 접시를 사용하십시오.

일부 조직 익스플랜은 성공하지 못할 수 있기 때문입니다. 플레이트의 수는 이식하는 조직 조각의 수에 따라 다릅니다. 이전에 코팅되어 섭씨 4도에서 보관된 플레이트를 사용하는 경우 사용하기 전에 실온에 두십시오 집게를 사용하여 원래 플레이트에서 조직을 조심스럽게 집어 새 플레이트의 축 중앙에 놓고 부드럽게 누르십시오 성장이 없는 조직은 버려야 합니다.

조직이 플레이트에 부착되도록 합니다. 몇 초 동안 미디어를 추가하고 배양합니다. X explan에 대해 앞에서 설명한 내용을 추가합니다.

그래서 2 mil의 여행과 각 100 밀리미터 조직 배양 플레이트에 대한 EDTA 재고 솔루션. 6mil의 steryl 0.01 몰 PBS와 2mil의 스톡 용액으로 스톡을 6mil PBS로 희석하여 2개의 50 마이크로그램 / mil에서 트립신의 최종 농도를 얻고 EDTA의 경우 100 마이크로그램 Per mil로 희석합니다. Explants를 새 플레이트로 옮긴 후 1-2cm의 세포 고리가 있는 플레이트에서 배지를 흡인합니다.

8mil의 따뜻한 희석 드립을 추가하고 각 100mm 플레이트에 용액을 추가합니다. 그리고 인큐베이터를 섭씨 37도에서 3분에서 15분 동안 놓습니다. 자주 확인하십시오.

트립신을 너무 오래 방치하면 세포가 손상됩니다. 현미경으로 플레이트를 확인하여 대부분의 세포가 들어 올려졌는지 확인하고 세포는 8Mils의 따뜻함에서 표시된 것처럼 둥글게 되어 분리됩니다. EDT에서 솔루션을 비활성화하기 위해 플레이트당 미디어의 10%FBS.

모든 플레이트의 부피를 하나의 튜브 또는 다른 조직의 별도 튜브로 결합합니다. Hema Cytometer 원심분리기를 사용하여 100G에서 5분 동안 세포를 계수합니다. 세포 펠릿은 튜브의 바닥에 형성되어 세포 펠릿을 원하는 세포 농도로 완전한 배지에 재현탁시킵니다.

T 75 플라스크당 각각 2개에서 300만 개의 세포를 배치하고 필요에 따라 완전한 배지를 추가합니다. 배지를 배양하고 변경합니다. 3-4주마다 세포가 D 75 플라스크에서 sub confluence로 성장합니다.

약 4주 안에 세포를 들어 올려 확장하거나 sub confluence에서 사용하여 sene을 방지해야 합니다. 트랜스웰의 투과성 멤브레인을 준비하는 것부터 시작합니다. 24개의 웰 다중 웰 플레이트에 맞는 6.5mm 인서트를 사용합니다.

멤브레인의 양쪽에 매체를 추가합니다. 아래쪽이 6mils, 위쪽이 0.1mils를 가리킵니다. 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.

멤브레인의 양쪽에서 매체를 조심스럽게 제거합니다. 기초 부피부터 조심스럽게 시작하면 멤브레인이 쉽게 손상될 수 있습니다. 따라서 배지를 배양 인서트 옆으로 피펫팅하고 권장되는 볼륨을 사용하십시오.

그렇게하지 않으면 종자 세포에 다른 우물로 매체가 누출되는 결과가 있습니다. 투과성 지지체를 사전 배양한 후, 세포막의 서피칼 쪽까지 0.1mils의 세포 현탁액으로 6.5mm 웰의 세포를 막의 표피면으로 조심스럽게 피펫팅합니다. 피펫 0.6m, 멤브레인의 기저면에 중간.

10일 동안 외측 및 기저측의 세포에 영양을 공급합니다. 잘 차별화된 배양 교류를 위해 일주일에 두 번 배지를 섭취하십시오. 시연된 방법을 사용하여 기저 부피를 제거합니다.

먼저 epical volume을 교체하고 멤브레인의 기저 쪽에 0.6mils의 medium을 추가합니다. 이 방법은 세포가 막에 부착하는 것을 촉진하고 세포가 장기간 공기에 노출되는 것을 방지합니다. 미디어를 신속하게 교환하고 인큐베이터를 다시 설치하십시오.

10일차에 AAL 배지를 제거하고 멤브레인의 기저 측에 있는 0.6mil 배지를 교체하여 공기 액체 계면을 만듭니다. 6주 동안 공기 액체 계면의 세포를 유지하고 일주일에 두 번 매체를 교체합니다. 섬모 세포는 귀가 생성된 후 4주 후에 나타나기 시작합니다.

액체 인터페이스. 세포는 섬모 세포로 균일한 분화를 달성합니다. 귀 액체 인터페이스를 만든 후 6 주.

explan 및 이식에서 건강한 상피 세포를 가진 인간 기관지 분절. 본 연구에서는 기관지 조직의 배양에서 성공적인 배양이 9개 조직 중 8개 조직에서 발생했습니다. 엑스플랜 배양 중 하나가 감염되면서, 상피 세포의 고리는 3-4주 만에 반경 1-2cm에 도달했다.

성공적인 X 엑스플란은 최대 6회까지 다시 배양되었습니다. 모든 성공적인 배양은 이식 시작 후 48시간 이내에 세포 이동의 증거를 보여주거나, B 세포에서 볼 수 있듯이 X explan은 B에서 볼 수 있듯이 이러한 상피 세포에 대해 뚜렷한 조약돌 모양을 가지고 있습니다.그리고 후속 그림에서, explan에서 세포의 시토신 제제의 면역 염색 및 커버 슬립에 시딩된 세포는 모든 세포가 상피 특이적 사이토케라틴에 대해 양성임을 밝혔습니다. sub confluence로 성장한 인간 subculture 기관지 세포와 T 75 플라스크가 여기에 나와 있습니다. 조약돌 모양에 주목하십시오.

인간 계배양 기관지 세포는 케린에 대해 균일한 양성 면역 염색을 보였으며 다른 세포 유형에 대한 특정 항체로 면역 염색을 할 수 있으나 섬유아세포, 중간엽 또는 내피 세포에 의한 배양물의 오염 징후를 나타내지 않았습니다. 자세한 내용은 그림 5 및 그 범례를 참조하십시오 : 투과성 폴리 에스테르 막 또는 트랜스웰에서 배양 된 세포 또는 여기에서 입증 된 바와 같이 섬모 상피로 분화 된 액체 계면, 여기에서 설명 된 바와 같이 다른 형태를 가진 세포가 나타나기 시작하면 세포와 세포의 또는 이식을 폐기하십시오. 이 프로토콜에서는 1차 인간 기관지 상피 세포의 배양 및 확장에 대한 자세한 방법을 제시했습니다.

인간 폐 질환 메커니즘의 중요한 경로를 결정하고 신약의 독성 및 약리학적 스크리닝을 위해 인간 세포 기반 연구가 필요합니다. 여기에 설명된 방법을 통해 외식에서 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 이러한 세포를 연구 시스템에서 사용할 수 있기를 바랍니다. 고맙고 행운을 빕니다.