Name: 식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 식물 세포벽 탄수화물 분석 프로토콜을 통해 리그노셀룰로오스성 바이오매스의 다당류와 결정성 셀룰로오스를 정량하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이오연료 생산을 위한 최적의 원료 선정에 필수적입니다.

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우리는 최고의 기술 서비스와 존 랄프 귀중한 조언, 토론 및 포플러 나무 샘플에 대해 위스콘신 대학의 매튜 로버트 웨더에게 감사하고 있습니다. 이 작품은 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실 미국 에너지학과 (수상 안돼. DE - FG02 - 91ER20021)과 에너지의 미 교육부 (DOE)에서 오대호의 사무실에 의해 투자되었다 Bioenergy 연구 센터 (과학 DOE BER 사무소 DE - FC02 - 07ER64494).

1. 세포 벽 절연 <ol><li> 갈기 대략 60 - 70mg의 공기 또는 retschmill (1 분, 25 Hz에서)를 사용하여 2ml sarstedt 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인레스 스틸 공 건조 식물 자료를 동결. 대안은 높은 처리량 연삭 및 로봇 칭했다 iWall을 분배의 사용은 부 3에 설명되어 있습니다. </li><li> 세포 벽 절연 절차를 계속하기 전에 강철 공을 제거 세포 벽 재료의 준비의 상세한 프로토콜은 부 3 표시됩니다. 여기에 완성도 프로토콜의 서면 단계를하십시오. </li><li> 1.5 70% 수성 에탄올의 ML, 그리고 철저하게 소용돌이를 추가 </li><li> 펠렛 10 분 알코올 불용성 잔류물을 위해 10,000 RPM에서 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 </li><li> 잔류물에 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1.5 ML를 추가하고 펠렛을 resuspend하기 위해 철저하게 튜브를 흔들 </li><li> 10 분 10,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 </li><li> 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 </li><li> 35 공기의 흐름과 용매를 증발 ° C를 건조까지 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li><li> 예제 0.1 M sodiumacetate 버퍼 산도 5.0 1.5 ML에 다시 중지 펠렛에서 전분의 제거를 시작합니다. </li><li> 20 분 대한 sarstedt 튜브와 열을 모자. 80 ° C 가열 블록에. </li><li> 얼음 정지 냉각 </li><li> 펠렛 다음 에이전트를 추가합니다 : 35 0.01 % Sodiumazide의 μl (난 3), 35 μl 아밀라아제 (50 μg/1mL H 2 O, 바실러스 종, 시그마), 17 μl Pullulanase (바실러스 acidopullulyticus에서 18.7 단위, 시그마) . 튜브와 철저하게 소용돌이를 캡. </li><li> 정지 37 박 이상 incubated입니다 ° 통에 C. 튜브를 Orienting 수평 보좌관은 혼합 향상. </li><li> 100 열 정지 ° C 소화를 종료하기 위해 가열 블록에서 10 분. </li><li> 원심 분리기 (10,000 RPM, 10 분) 및 폐기 뜨는 포함 solubilized 전분 </li><li> , 1.5 ML 물을 추가 vortexing, centriguation 및 세척 물을 decanting하여 나머지 펠렛을 세 번 씻으십시오. </li><li> 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 </li><li> 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 그것은 더 건조 주걱으로 튜브에 재료를 헤어지게하는 것도 필요할 수 있습니다. 마른 재료는 절연 세포 벽 (lignocellulosics)를 제공합니다. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li></ol> 2. 매트릭스 다당류 성분 이 방법은 기본적으로 Albersheim 1 발행 방식의 변경이다. <ol><li> 벽 소재의 monosaccharide 구성을 확인하려면 직접 또는 iWall, 로봇 분쇄 및 무게 로봇을 사용하여 highthroughput 방식 중 2ml starstedt 튜브에 세포 벽 재료 2 MG 나가는거야. </li><li> 내부 표준으로 이노시톨 솔루션 (5mg/ml) 20 UL을 추가합니다. 2 MG 세포 벽 샘플을 위해 100 UG를 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 튜브의 바닥에있는 세포 벽 자료를 수집하는 아세톤 250 UL과 튜브 벽을 씻어하고, 공기에서 아세톤은 매우 부드러운 증발. </li><li> 약한 산성 가수 분해에 대한 각각의 샘플에 2M trifluoroacetic 산성 (TFA) 250 UL를 추가합니다. 어떤 물질이 튜브 벽에까지 치켜하지 않도록 신중하게 TFA를 추가합니다. </li><li> 단단히 뚜껑 121 90 분 품어 ° 가열 블록의 C. </li><li> 얼음 가열 블록 및 샘플을 냉각. </li><li> 10 분 10,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 펠렛 자료를 방해하지 않도록하는 유리 스크류 캡 튜브에 monosaccharide를 파생 매트릭스 다당류를 포함하는 산성 뜨는 100 UL을 전송. 펠렛은 (3을 참조하십시오.) 아래의 결정성 셀룰로오스 분석에 사용할 수 </li><li> 증발 장치의 공기의 부드러운 흐름에 따라 유리관에 TFA를 증발. </li><li> 300 μl 2 - 프로파놀, 소용돌이를 추가하고 25 증발 ° C (세 번 총 반복) </li><li> alditol 아세테이트 derivati​​zation 절차의 첫 번째 단계는 해당 alditols 수있는 단당류의 감소를 수행하는 것입니다. 이러한 목적으로 각 건조 시료에 나트륨 borohydride 솔루션 200 μl를 추가합니다. 신선한 해결책에게 1M 질산 수산화의 1ml 당 나트륨 borohydride의 10mg을 사용하여 각 시간을 준비합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 실온에서 유리관를 떠나 </li><li> 빙초산 150 UL 추가하여 솔루션을 중화 </li><li> 25 와동과 증발 ° C. </li><li> 250 μl 초산 / 메탄올 (1시 9분, V / V), 소용돌이를 추가하고 25 증발 ˚ C </li><li> (세 번 총 반복) 250 μl 메탄올을 추가하고, 공기의 흐름에 따라 증발 </li><li> alditols의 아세틸화 들면, 아세트산 무수물 50 μl와 Pyrid 50 μl를 추가121 20 분 이네, 소용돌이 그리고 품어 ° 가열 블록의 C. </li><li> 얼음 블록 시원하고 샘플 다운은 약 상온으로 온도 감소를 기다리는 동안. </li><li> 상온에서 공기의 부드러운 흐름에 따라 시약을 증발. 주의 : alditol acetates는 매우 휘발성이 있습니다. </li><li> 공기 아래에 200 μl 톨루엔을 추가하고 증발 (X3) </li><li> 마지막 단계에서는 alditol acetates가 추출됩니다. 첫째, 에틸 아세테이트 및 가볍게 소용돌이 500 UL를 추가합니다. </li><li> 이 물을 ML, 캡 튜브와 와동를 추가합니다. </li><li> 맑은 별도의 레이어 (상단에 에틸 아세테이트, 바닥에 물)을 구하는 5 분 2,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기 </li><li> 삽입과 GC / MS 유리병에 에틸 아세테이트 층의 피펫 50 UL. </li><li> GC - 유리병과 뚜껑에 아세톤 100 UL을 추가하여 희석. 샘플 농도가 너무 높은 경우 샘플 볼륨 및 희석 볼륨은 GC / MS를 과부하 방지하기 조정할 수 있습니다. GC - 유리병 4 ° C가, GC / MS 분석을 즉시 진행되지 않는 경우에 저장할 수 있습니다 </li><li> 샘플은 quadrupole MS를 갖춘 GC에 주입하지만, 불꽃 이온화 검출기도 적합합니다. Supelco SP - 2380 (30mm X 0.25mm X 0.25 μm의 필름 두께) 컬럼 4min 용매 지연과 1.5ml/min의 유량과 함께 사용됩니다. 주입 샘플은 다음과 온도 프로그램에 들어서는 아르 : 160에서 초기 개최 ° 2 분 C, 20 ° 200 C / 분 램프 ° C 5 분 개최, 20 ° 245 C / 분 램프 ° C 유지 12 분, 270 스파이크 ° C와 160 ° C 2.26의 초기 온도까지 냉각하기 전에 5 분 기다) 봉우리가 표준 대량 프로필 및 / 또는 유지 시간에 의해 식별됩니다.. 단당류는 표준 곡선에 따라 계량입니다. </li></ol> 3. 결정 셀룰로오스 내용 이 방법은 기본적으로 Updegraf 8 시까지 설명되어 있습니다. 절연 세포 벽 재료 (1 참조) 또는 이미 2M TFA (2.8 참조) 중 남아있는 펠렛 즉시 산성 치료 후 (2.8 참조) 또는 TFA로 처리되어 벽의 재질 :이 절차를위한 시작 물질의 여러 가지가 있습니다 2 - 프로파놀, 말린과 함께 세탁되었습니다 펠릿. <ol><li> Updegraff 시약의 나사 덮인 유리관 1 ML (질산 : 물, 8시 1분 2초 V / V 초산)에서 TFA 펠렛에 추가합니다. </li><li> 100 가열 블록에 밀접하게 캡 튜브, 소용돌이, 그리고 열 ° C 30 분. 이 치료의 결과로만 결정 셀룰로오스는 펠렛의 불용성 남아 있습니다. </li><li> 객실 온도 또​​는 냉각기에 얼음 블록 시원하고 샘플 </li><li> 원심 분리기 샘플 15 분 10,000 rpm으로 </li><li> 펠렛이 없어야하고 제거 펠렛부터 물질이 아니라고 보장 뜨는 폐기하십시오. 이런 목적을 위해 약 두십시오. 튜브의 표면에 뜨는 150 UL. </li><li> , 원심 분리기를 흔들, 물 1.5 ML를 추가하여 위의 완료로 뜨는 취소 </li><li> 아세톤 1.5 ML을 사용하여 프로 시저 추가 3 번 반복 세척 </li><li> 공기 건조 펠렛은 매우 부드럽게 공기 같이, 또는 야간 벤치에서 건조시킬 </li><li> 펠렛 (결정 셀룰로오스)는 Saeman 가수 분해라는 무엇에 의해 지금은 포도당으로 완전히 분해됩니다. 이러한 목적은 sarstedt 튜브에 175 μl 72%의 황산을 추가를위한 </li><li> 또 다른 15 분 30 분, 소용돌이 및 부화에 대한 실온에서 알을 품다 </li><li> 825 μl 물 소용돌이를 추가 </li><li> 5 분 10,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기. 튜브에 남아 약간 갈색 불용성 물질, 리그닌이있을 수 있습니다. </li><li> 뜨는의 포도당 내용은 colorimetric anthrone 분석을 사용하여 assayed입니다. 이 분석은 96 잘 폴리스티렌 microtiter 플레이트에서 수행됩니다. </li><li> 표준 곡선은 1mg/ml 포도당 주식 (0 ° C에서 저장)을 사용하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UL을 pipetting하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UG 표준을 중복 작성을위한 별도의 적합한 우물에. 물을 각각 잘 최대 100 UL을 입력합니다. </li><li> 별도의 셀에하지만 표준으로 동일한 microtiter 접시에 각 시료 표면에 뜨는 10 μl와 물 90 ML를 추가합니다. </li><li> 신선한 Anthrone 시약 (Anthrone이 집중 황산, 2 MG anthrone / ML 황산에 용해) 200 μl를 추가 </li><li> 80 30 분 열 플레이트 오븐에 ° C (알루미늄 히트 스프 레더). 포도당이 포함된 샘플은 푸른 녹색으로 노란색에서 설정합니다. </li><li> 룸 온도에 접시가 식지 철저하게 발라줍니다. </li><li> microtiter 접시 리더를 사용하여 625mm에서 접시의 흡수를 참조하십시오. </li><li> 포도당 (그리고 따라서 결정 셀룰로오스 함량)가 같은 접시에 설립 표준 곡선과 비교하여 흡광도를 기반으로 계산됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 벽 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 경우에는 포플러 줄기 (나무)은 프로토콜 섹션에서 설명한 여러 가지 절차에 의해 분석되었다. 매트릭스 POlysaccharide 구성이 식물 세포 벽에있는 전형적인 설탕 선물을 식별하는 예제 크로마토 그램으로 강조 표시됩니다, fucose, rhamnose, 자일로 오스, arabinose, 갈락토 오스, mannose와 포도당 (및 내부 표준 이노시톨). 높은 자일로 오스 함량에 의해 증명으로 포플러의 주요 hemicellulosic 구성 요소 크실란입니다. 그러나 이러한 당분의 풍부한는 공급 원료의 used4에 따라 달라집니다. 이 분석에서 포도당은 hemicellulose의 xyloglucan 및 비정질 셀룰로스에서 파생됩니다. 분석에 의한 데이터는 몰의 % 또는 UG / MG 벽 재​​료 (또는 건조 중량)로 제시하실 수 있습니다. 결정 셀룰로오스의 내용은 자체 설명이고, 하나는 벽 건조 무게의 20-50% 사이의 가치를 기대할 수 있습니다. 여기 부품 I3에 표시된 결과를 바탕으로 포플러 나무의 리그노셀룰로오스성 구성은 21 % 리그닌, 30 % hemicelluloses 및 41% 결정 셀룰로오스이다. 나머지 화산재 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 :. 리그노셀룰로오스성 분석의 개요 세포 벽 (lignocellulosics)는 원유 건조 식물으로부터 격리됩니다. 벽 재료는 다음 aliquots에 가중치 및 다양한 assays에 대한 세분화됩니다. 매트릭스 다당류 성분은 약한 산성 (2M TFA)와 벽에 자료를 치료 자신의 alditol acetates하는 결과 solubilized 단당류를 derivati​​zing하고, GC - MS에 의해 분석 후에 설정됩니다. 약한 산성 치료의 잔여물은 소위 Updegraff 시약은 뒤에서만 불용성 crystlline의 셀룰로오스를 떠나지로 세탁합니다. 셀룰로오스는 황산에 의해 solubilized 및 포도당 내용을 결정하는 colorimetric 분석하여 계량입니다. 부 3에서 설명한대로 병렬로, 리그닌의 내용과 구성이 결정하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 :. 포플러 (포풀러스 tremoloides)에서 포플러 나무 종합 리그노셀룰로오스성 분석 우드 칩은 설명 프로토콜에 받게되었습니다. 왼쪽 상단 : 매트릭스 다당류 성분, Fuc fucose, rhamnose Rha, 아라 arabinose, Xyl 자일로 오스, 남자 mannose, 걸 갈락토 오스, Glc 포도당, 이노시톨 내부 기준.

<ol><li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li>
<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+I%3A+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
<li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li>
</ol>

설명 방법 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 구성의 급속한 양적 평가를 가능하게합니다. 방법은 즉 매트릭스 다당류 hemicelluloses의 설탕 구성, 결정 셀룰로오스 내용을 포함하여 같은 물질의 조성의 결정 수 있습니다. 인당 다양한 분석 방법의 처리량이 다릅니다. 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 20 샘플이 결정 셀룰로오스 내용에 대한 매트릭스 다당류의 성분과 30 처리할 수 있습니다. 데이터 최적의 공급 원료 작물의 양적 특성으로 인해, 다양한이나 genotypes는 생물 연료 생산을위한 그들의 적합성의 관점에서 평가하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>myo-이노시톨(myo-Inositol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>수소화붕소나트륨(Sodium Borohydride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>피리딘(Pyridine)</td><td>JT Baker</td><td>3348-01</td><td></td></tr><tr><td>무수아세트산(Acetic Anhydride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>7890A GC/5975C MSD</td><td></td></tr><tr><td>5.5mm 스테인리스강 볼</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 열 분산기</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 밀(Mill)</td><td>Qiagen</td><td>TissueLyser II</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>시료 농축기</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

재생, 탄소 중립, 그리고 산업과 사회에 대한 지속적인 원료의 필요성은 21 세기의 가장 눌러 문제 중 하나가되고있다. 이것은 교통 액체 연료의 생산을위한 산업 원료 등 공장 제품의 사용에 흥미를 rekindled있다<sup&gt; 2</sup이러한 biocomposite 자료 등&gt; 및 기타 제품<sup&gt; 6</sup&gt;. 식물 바이오 매스는 지구상에서 가장 큰 미개척 보유 중 하나 남아있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 그것은 주로 에너지 셀룰로오스를 포함한 다양한 고분자 다양한 hemicelluloses 및 폴리페놀 리그닌 구성되어 있으며 세포 벽 구성됩니다<sup&gt; 5</sup&gt; 때문에 때로는 lignocellulosics를 칭했다. 그러나, 식물의 세포 벽을 벽에 강도와 전체 식물의 구조적 무결성에 광범위하게 기여로 저하에 완강히 저항하는 것으로 진화했습니다. 의 필요한 강성에도 불구하고, 세포 벽이 metabolically 활성 및 식물의 성장과 분화와 같은 다양한 세포 활동에 중요한 역할을 담당하고 매우 역동적인 실체이다<sup&gt; 5</sup&gt;. 벽의 다양한 기능으로 인해 엄청난 구조적 다양성은 단일 플랜트 내의 다른 식물 종의 및 세포 유형의 벽 안에있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 따라서 농작물 종, 작물 다양성, 또는 식물의 조직이 biorefinery 사용되는 무엇에 따라, 화학 / 효소 프로세스와 액체 바이오 연료에 대한 다양한 설탕의 후속 발효에 의해 depolymerisation에 대한 처리 단계 조정하고 최적화해야합니다. 이 사실 뒷받침 식물 바이오 매스 feedstocks의 철저한 특성화를위한 필요합니다. 여기 lignocellulosics의 구성의 결정을 가능하게 높은 처리량 분석 매체 (그림 1) 의무가있는 포괄적인 분석 방법을 설명합니다. 방법은 destarched 세포 벽 재료 준비와 함께 시작합니다. 그 결과 lignocellulosics는 다음의 hemicelluloses의 monosaccharide 구성 및 기타 매트릭스 polysaccharides1하고, 결정 셀룰로오스의 내용을 확인하기 위해 갈라 아르<sup&gt; 7</sup&gt;. 리그노셀룰로오스성 바이오 매스의 리그닌 구성 요소를 분석하는 프로토콜은 부분을 설명합니다 I<sup&gt; 3</sup&gt;.

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

산업과 사회를 위한 재생 가능하고 탄소 중립적이며 지속 가능한 원료에 대한 필요성은 21세기의 가장 시급한 과제 중 하나가 되었습니다...

식물 세포벽의 매트릭스 다당류 조성과 결정질 셀룰로오스 함량을 결정하는 과정은 건조된 식물 시료에서 시작하며, 이를 다양한 추출 공정에 처리합니다. 그 결과로 얻은 물질은 세포벽으로만 구성되며, 이후 매트릭스 다당류 조성을 결정하기 위해 분할됩니다. 세포벽 물질을 약산으로 처리하여 주로 헤미셀룰로오스인 비결정질 다당류를 단당류로 가수분해합니다.그 다음 단당류를 이에 대응하는 휘발성 알돌 아세테이트(aldol acetates)로 유도체화하며, 결정성 셀룰로오스를 정량하기 위해 질량 분석계와 결합된 가스 크로마토그래피로 이를 분석하고 정량합니다. 세포벽 성분은 비결정성 벽 성분을 제거하는 산 혼합물인 그래프 시약(graph reagent)으로 처리합니다. 남아있는 결정성 셀룰로오스는 단량체인 포도당으로 분해되며, 이는 화학량론적으로 분석할 수 있습니다.리그닌 함량 및 조성의 결정 방법은 또 다른 JoVE 비디오 출판물인 '식물 세포벽의 종합적인 조성 분석, 파트 1 리그닌(Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin)'에서 설명하고 있습니다. 안녕하세요, 저는 미시간 주립대학교 그레이트 레이크스 바이오에너지 연구 센터의 세포벽 분석 시설 책임자인 Marcus Pauley입니다. 저는 세포벽 분석 시설 매니저인 Cliff Foster입니다.오늘은 다양한 호모셀룰로오스(Homo celluloses) 내의 셀룰로오스인 식물 세포벽 물질에 존재하는 다당류의 조성을 결정하는 방법을 보여드리겠습니다. 이곳 그레이트 레이크스 바이오에너지 연구 센터(Great Lakes Bioenergy Research Center)에서는 이러한 당류를 바이오 연료로 전환하는 기술을 개발하고 있습니다. 최적의 식물 원료를 식별하기 위해서는 먼저 이 바이오매스에 존재하는 당의 종류와 양을 평가해야 합니다.식물 세포벽의 종합적 성분 분석, 제1부 리그닌이라는 제목의 다른 영상에서는 폴리페놀 분석에 집중해 보겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 세포벽을 분리하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.약 60~70 mg의 건조 식물 재료를 2 ml SAR TED 스크류 캡 튜브에 넣고 5.5 mm 스테인리스 스틸 볼을 사용하여 분쇄합니다. 고처리량 대안으로 REM 밀을 사용하는 경우, 파트 1에서 설명한 eyewall이라는 분쇄 및 분주 로봇을 사용하십시오. 분쇄가 완료되면 스틸 볼을 제거합니다.파트 1에서 보여준 방식과 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 세포벽을 계속해서 분리하고 잔류 전분을 제거하십시오. DS 전분 세포벽 물질 2 mg을 2 mL 원심분리 튜브에 정밀하게 측정하여 넣습니다. 이 작업을 고효율로 수행하는 방법으로는 eyewall 로봇을 사용할 수 있습니다.로봇이 분쇄된 식물 시료가 담긴 튜브를 집어 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 구멍이 뚫린 튜브를 VI 피더 위에 놓습니다. 빈 튜브를 저울 위에 올린 후 진동을 통해 VI 피더 아래로 이동시키면, 위쪽 튜브의 구멍을 통해 시료가 아래쪽 빈 튜브로 스며들어 원하는 양의 시료가 모일 때까지 계속됩니다.내부 표준물질로 acetol 100 micrograms를 첨가합니다. 아세톤으로 튜브 벽면을 헹궈 세포벽 물질을 튜브 바닥으로 모은 다음, 공기 흐름 하에서 아세톤을 매우 조심스럽게 증발시킵니다. 이어서 약산 가수분해를 수행합니다.각 샘플에 2 M trichloroacetic acid 또는 TFA 250 µL를 조심스럽게 첨가하되, 시약이 튜브 벽면에 튀지 않도록 주의하십시오. 튜브 캡을 단단히 닫고 가열 블록에서 121 °C로 90분 동안 배양합니다. 그 후 가열 블록과 샘플을 얼음 위에서 냉각시킨 다음, 튜브를 10,000 RPM에서 10분 동안 원심 분리하십시오.매트릭스 다당류의 가용화된 당이 포함된 산성 상층액 100 µL를 펠렛 물질이 섞이지 않도록 주의하며 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 펠렛은 결정성 셀룰로오스 분석에 사용할 수 있습니다. 증발 장치 내의 유리 튜브에서 완만한 공기 흐름 하에 TFA를 증발시킵니다.과량의 산을 제거하기 위해 2-프로판올 300 µL를 첨가하고, 볼텍싱 후 25 °C에서 증발시킵니다. 이 과정을 총 3회 반복합니다. 가스 크로마토그래피를 통해 단당류를 식별할 수 있도록 알돌 아세테이트 유도체화를 수행합니다.먼저 단당류를 해당 개환 알돌(open ring aldols)로 환원시킨 후 아세틸화합니다. 자세한 지침은 함께 제공된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 절차의 각 단계는 이전에 제시된 프로토콜에 따라 시약 첨가, 배양, 공기 흐름 하에서의 증발, 그리고 다양한 세척 단계를 통한 과량의 시약 제거 순으로 진행됩니다.마지막 단계에서는 알돌 아세테이트(aldol acetates)를 추출합니다. 먼저, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 500 µL를 넣고 가볍게 흔들어 섞습니다. 그런 다음 물 2 mL를 넣고 튜브 뚜껑을 닫은 뒤 볼텍싱(vortex)합니다. 튜브를 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 알돌 아세테이트가 포함된 에틸 아세테이트 층이 위로 가고 물 층이 아래로 가는 명확한 층 분리를 유도합니다. 에틸 아세테이트 층에서 50 µL를 취해 인서트(insert)가 있는 GC-MS 바이알에 옮깁니다. GC 바이알에 아세톤 100 µL를 넣어 희석하며, 해당 GC 바이알은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.GCMS 분석을 즉시 진행하지 않을 경우, 쿼드러플 질량 분석기가 장착된 가스 크로마토그래프에 시료를 주입하십시오. 컬럼 및 분석 세부 사항은 동봉된 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 결정성 셀룰로오스 함량을 결정하기 위한 출발 물질은 분리된 세포벽 물질 또는 약산인 TFA로 이미 처리된 벽 물질이며, 산 처리 직후의 상태이거나 보관 가능한 건조 형태일 수 있습니다.이전에 설명한 대로 이소프로판올로 과잉의 TFA를 제거한 후, 두 개의 M sars 튜브에 있는 TFA 펠렛에 아세트산, 질산 및 물로 구성된 1 M Updegraff 시약을 8:1에서 2:1의 부피비로 추가합니다. 튜브 뚜껑을 단단히 닫고 볼텍싱한 후, 가열 블록에서 100 °C로 30분 동안 가열합니다. 이 처리를 통해 펠렛에는 결정성 셀룰로오스만 남게 됩니다.그 외 모든 다당류는 가수분해 후, 얼음 위에 놓인 블록에서 시료를 실온 또는 그 이하의 온도로 냉각합니다. 그런 다음 시료를 10,000 RPM에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 펠렛이 흐트러지지 않고 펠렛의 물질이 제거되지 않도록 주의하며 상층액을 버립니다. 이를 위해 튜브에 약 150 microliters의 상층액을 남겨두고, 물로 펠렛을 여러 번 세척합니다.다음으로, 결정과 셀룰로오스 펠렛을 글루코스로 완전히 가수분해하기 위해 고농도 황산으로 가수분해를 수행합니다. 먼저 sarta tube에 72% 황산 175 µL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 초기 배양 후, 시료를 볼텍싱하고 15분 더 배양합니다.그 다음 물 825 µL를 추가하고 볼텍싱한 후, 샘플을 10,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액에 포도당이 포함되어 있는 동안, 주로 리그닌으로 구성된 갈색의 가용성 물질이 튜브에 일부 남아 있을 수 있습니다. 상층액의 포도당 함량은 비색 anthrone 분석법을 사용하여 측정합니다.본 분석은 96웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 수행합니다. 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 포도당 표준 곡선을 2회 반복 측정하여 작성하십시오. 각 샘플 상층액 10 µL와 물 90 µL를 표준 물질과 동일한 마이크로타이터 플레이트의 별개 웰에 혼합하여 샘플을 준비하고, 마지막으로 갓 조제한 시약 200 µL를 첨가하여 마무리합니다.다음으로, 알루미늄 열 분산기가 있는 오븐에서 80 °C로 30분 동안 플레이트를 가열합니다. 가열이 완료되면 포도당 함유 시료가 노란색에서 청록색으로 변하는 것을 확인하십시오. 플레이트를 실온까지 식힌 후 충분히 흔들어 줍니다.마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 625 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 셀룰로오스의 구성 단위인 glucose의 함량은 동일한 플레이트에서 작성된 표준 곡선과 비교하여 흡광도를 기반으로 계산합니다. 다음은 포플러 나무 조각의 다당류 분석에 대한 대표적인 결과입니다.가스 크로마토그램 피크는 질량 프로파일 및/또는 표준물질의 머무름 시간으로 식별합니다. 단당류는 표준 곡선을 기반으로 정량화합니다. 매트릭스 다당류의 당 분석 결과, 헤미셀룰로오스를 나타내는 xylose가 높은 함량으로 나타났으나 다른 당들도 함께 존재합니다.분석 결과에 따르면, 포플러 재료의 40%가 결정질 및 셀룰로스로 구성되어 있습니다. 이러한 함량과 조성은 식물마다 또는 서로 다른 식물 해부학적 구조 사이에 차이가 있을 수 있음에 유의하시기 바랍니다. 지금까지 폴리페놀 리그닌 분석을 위해 리그노셀룰로스 바이오매스의 다당류 함량 결정 및 조성 분석 방법을 보여드렸습니다.1부를 시청해 주세요. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생물학

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

공촛점 래맨 현미경에 따라 방법은 레이블이없는 식물 세포 벽에 리그닌의 시각화 및 다른 조직, 표본 또는 수종의 lignification의 비교를 내실수 것을 제공됩니다.

라벨 - 무료 현장에서</em식물 세포 벽 Lignification의> 이미징

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

이 연구의 목적은 계층 별 nanocellulose 원 섬유의 조립 및 묽은 수성 현탁액을 조립 절연 리그닌을 사용하여 합성 식물 세포벽 조직을 형성하는 것이었다. 수정 진동자 마이크로 밸런스 및 원자 힘 현미경의 표면 측정 기술은 중합체 - 고분자 나노 복합 재료의 형성을 모니터링하는 데 사용 하였다.

Nanocellulose, 리그닌의 날조 된 자립형 필름, 및 합성 폴리 양이온 : Biomimicking 나무를 향하여

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

이 프로토콜은 라만 이미징 및 다 변수 분석을 사용하여 식물 세포 벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시합니다.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

다 당 류 젤 전기 이동 법 (속도), 예를 들어, mannan를 사용 하 여 구조 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 데모의 주요 목적은 식물 바이오매스 샘플에서 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 상세한 Updegraff 프로토콜을 제공하는 것입니다.

Updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정

학습하세요 식물 세포벽 탄수화물 분석 프로토콜을 통해 리그노셀룰로오스성 바이오매스의 다당류와 결정성 셀룰로오스를 정량하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이오연료 생산을 위한 최적의 원료 선정에 필수적입니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

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