식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

식물 세포벽의 매트릭스 다당류 조성 및 결정질 셀룰로오스 함량을 측정하는 것은 다양한 추출을 거친 건조된 식물 물질로 시작합니다. 생성된 물질은 세포벽으로만 구성된 다음 매트릭스 다당류 조성을 결정하기 위해 분할됩니다. 벽 재료는 가수 분해하기 위해 약한 산, 비 결정질 다당류로 처리되며, 이는 주로 헤모 셀룰로오스를 단당류로 처리합니다.

그런 다음 단당류는 해당 휘발성 알돌 아세테이트로 유도되며, 이는 결정질 셀룰로오스 측정을 위해 질량 분석기에 연결된 가스 크로마토그래피로 분석 및 정량화됩니다. 내용물 벽은 비결정성 벽 구성 요소를 제거하는 산 혼합물인 그래프 시약으로 처리됩니다. 잔류 결정질 셀룰로오스는 단량체 포도당으로 분해되며, 이는 측정 할 수 있습니다.

리그닌 함량 및 조성의 결정은 Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin이라는 제목의 또 다른 J 비디오 간행물에서 입증되었습니다. 안녕하세요, 저는 미시간 주립 대학의 오대호 생물 에너지 연구 센터의 벽 분석 시설 책임자인 마커스 폴리(Marcus Pauley)입니다. 저는 세포벽 분석 시설의 관리자인 Cliff Foster입니다.

오늘은 식물 세포벽 물질에 존재하는 다당류, 즉 다양한 호모 셀룰로오스의 셀룰로오스 성분을 결정하는 방법을 보여드리겠습니다. 이곳 오대호 바이오에너지 연구 센터(Great Lakes Bioenergy Research Center)에서는 이러한 당을 바이오 연료로 전환하는 기술을 개발합니다. 최적의 식물 공급 원료를 식별하기 위해서는 먼저 이 바이오매스에 존재하는 당의 종류와 풍부함을 평가해야 합니다.

식물 세포벽의 포괄적 인 조성 분석, 1 부 리그닌이라는 제목의 또 다른 비디오에서는 폴리 페놀 분석에 중점을 둘 것입니다. 시작하겠습니다. 세포벽을 분리하여 이 절차를 시작합니다.

2mil SAR TED 나사 캡 튜브에 5.5mm 스테인리스강 볼로 약 60-70mg의 건조 식물 재료를 분쇄합니다. REM 밀을 고처리량 대안으로 사용하여 1부에서 설명한 대로 eyewall이라는 연삭 및 디스펜싱 로봇을 사용합니다. 연삭이 완료되면 강구를 제거하십시오.

계속해서 세포벽을 분리하고 파트 1에 표시되고 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 잔류 전분을 제거합니다. 2mg의 DS 전분 세포벽 물질을 2개의 밀 사레드 튜브에 넣습니다. 이 작업을 수행하는 높은 처리량 방법은 아이월 로봇입니다.

로봇은 분쇄된 식물 재료가 들어 있는 튜브를 가지고 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 피어싱된 튜브를 VI 피더에 놓습니다. 빈 튜브를 저울에 놓고 원하는 양의 재료가 축적될 때까지 적재된 상단 튜브의 구멍을 통해 빈 하단 튜브로 재료가 침투하는 진동을 통해 VI 피더 아래로 이동합니다.

내부 표준물질로 아세톨 100마이크로그램을 추가합니다. 튜브 벽을 아세톤으로 헹구어 튜브 바닥의 세포벽 물질을 수집하고 공기 흐름 아래에서 아세톤을 매우 부드럽게 증발시킵니다. 다음으로 약산 가수분해를 수행합니다.

각 샘플에 250마이크로리터의 2몰 트리클로로아세트산 또는 TFA를 조심스럽게 첨가하여 튜브 벽에 물질이 튀지 않도록 합니다. 튜브를 단단히 덮고 섭씨 121도의 가열 블록에서 90분 동안 배양합니다. 다음 얼음에 난방 구획 그리고 표본을 냉각하고 10 분 동안 10, 000 분당 회전수에 관을 분리기

매트릭스 다당류의 가용화된 당을 포함하는 산성 상등액 100마이크로리터를 캡 바이알을 조이면서 펠릿 물질을 방해하지 않도록 합니다. 펠릿은 결정질 셀룰로오스 분석에 사용할 수 있습니다. 증발 장치에서 부드러운 공기 흐름 아래에서 유리관의 TFA를 증발시킵니다.

300 마이크로 리터의 두 프로판올을 첨가하여 과도한 산 소용돌이를 제거하고 섭씨 25도에서 증발시킵니다. 총 3회 반복합니다. 가스 크로마토그래피로 단당류를 식별할 수 있도록 알돌 아세테이트 유도체화를 수행합니다.

먼저, 단당류를 상응하는 열린 고리 알돌로 줄인 다음 아세틸화합니다. 자세한 지침은 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 절차의 각 단계는 이전에 표시된 프로토콜, 즉 공기 흐름 아래에서 시약 배양 증발을 추가한 다음 다양한 세척 단계를 통해 과도한 시약을 제거합니다.

마지막 단계에서는 알돌 아세테이트를 추출합니다. 먼저 에틸 아세테이트 500 마이크로 리터를 넣고 가볍게 소용돌이칩니다. 그런 다음 2mil의 물을 넣고 튜브와 와류를 덮고 튜브를 5분 동안 원심분리하여 Al Dettol 아세테이트가 포함된 에틸 아세테이트가 위에 있고 바닥에 물이 있는 투명한 별도의 층을 얻습니다. 피펫 바닥에 50마이크로리터의 에틸 아세테이트 층을 GCMS 바이알에 넣고 인서트를 GCMS 바이알에 100마이크로리터의 아세톤을 첨가하여 희석하고 GC 바이알을 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

GCMS 분석이 즉시 진행되지 않으면 4중 질량 분석기가 장착된 가스 크로마 포토그래퍼에 샘플을 주입합니다. 실행에 대한 칼럼 및 세부 사항은 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 결정성 셀룰로오스 함량을 측정하기 위한 출발 물질은 산 처리 직후 또는 저장 가능한 건조 형태로 약산 TFA로 이미 처리된 분리된 세포벽 물질 또는 벽 물질일 수 있습니다.

앞서 보여진 바와 같이 이소 프로판올로 과도한 TFA를 제거한 후, 두 개의 M sars에 있는 TFA 펠릿에 아세트산, 질산 및 물로 구성된 최대 degra 시약 1M을 튜브에 넣고 8:1-2 부피 대 부피 비율을 추가합니다. 튜브를 와류로 단단히 덮고 섭씨 100도의 가열 블록에서 30분 동안 가열합니다. 이 처리의 결과, 펠릿에는 결정질 셀룰로오스만 남게 됩니다.

다른 모든 다당류는 얼음 블록에서 실온 또는 냉각기로 가수 분해 된 시원한 샘플입니다. 다음 분리기는 10, 원심분리 후에 15 분 동안 000 분당 회전수에 표본을 원심분리기하고, 펠릿이 교란되지 않다는 것을 보증하는 상등액을 폐기하고 펠릿에서 아무 물자도 제거되지 않는다는 것을 보증한다. 이를 위해 튜브에 약 150 마이크로 리터의 상층액을 남겨두고 펠릿을 물로 여러 번 씻으십시오.

다음으로, 결정과 셀룰로오스 펠렛을 포도당으로 완전히 가수 분해하기 위해 농축 황산으로 동일한 가수 분해를 수행한다. 먼저 175마이크로리터의 72%황산을 사르타 튜브에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 초기 배양 후 샘플을 볼텍스하고 15분 더 배양합니다.

다음 물 및 와동의 825 마이크로리터를 추가하고 10, 5 분 동안 000 분당 회전수에 표본을 분리기화하십시오. 약간의 갈색 및 용해성 물질이 있을 수 있으며, 포도당은 상층액에 있는 동안 대부분 리그닌이 튜브에 남아 있습니다. 상등액의 포도당 함량은 Colormetric anthone assay를 사용하여 분석합니다.

이 분석은 96웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 수행됩니다. 포도당 표준 곡선을 함께 제공되는 서면 프로토콜의 지침에 따라 복제하여 수리합니다. 각 시료 10마이크로리터, 수퍼낫 및 물 90마이크로리터를 새로 준비하고 던진 시약 200마이크로리터를 추가하여 표준 마감재와 동일한 마이크로타이터 플레이트의 별도의 웰에 결합하여 샘플을 준비합니다.

그런 다음 알루미늄 열 분산기가 있는 오븐에서 섭씨 30도에서 80분 동안 플레이트를 가열합니다. 가열이 완료되면 샘플이 포함된 포도당이 노란색에서 청록색으로 변하는 것을 관찰하십시오. 접시를 실온으로 식히고 철저히 흔듭니다.

마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 625나노미터에서 흡수를 판독합니다. 셀룰로오스의 구성 요소인 포도당의 함량은 동일한 플레이트에 설정된 표준 곡선과 비교한 흡광도를 기준으로 계산됩니다. 다음은 포플러 나무 조각의 다당류 분석의 몇 가지 대표적인 결과입니다.

기체 크로마토그램 피크는 질량 프로파일 및/또는 표준물질의 머무름 시간으로 식별됩니다. 단당류는 표준 곡선을 기반으로 정량화됩니다. 매트릭스 다당류의 당 분석은 헤미 셀룰로오스 xam을 나타내는 크실로스의 함량이 높지만 다른 당도 존재합니다.

분석에 따르면 포플러 물질의 40%는 결정과 셀룰로오스로 구성되어 있습니다. 이러한 함량과 구성은 식물마다 또는 다른 식물 해부학적 구조에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 폴리페놀 리그닌 분석을 위해 리그나노 셀룰로오스 바이오매스의 다당류 함량 및 조성 분석을 결정하는 방법을 보여주었습니다.

1부를 시청하세요. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.