Name: 의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 배우세요 MamAΔ41 단백질 정화 방법을 M. magneticum AMB-1에서. 친화성, 이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 고순도 단백질을 얻고 마그네토솜 관련 단백질 연구에 활용하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 그들의 조언과 의견을 자신의 지원과 Geula 다비도프, 노암 Grimberg와 첸 박사 Guttman에 대한 아미르 Aharoni을 인정합니다.

1. E.에 엄마가 진의 복제와 표현 대장균 5' - GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG - 3 '와 5' - GCGCGGCAGCCATA - TGGCATACG - 3'돌연변이 유전자 mamAΔ41는 primers와 Magnetospirillum magneticum AMB - 1의 게놈 DNA의 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭되었습니다. 증폭된 DNA 조각에서 NcoI 사이트는 개시 코돈 ATG에서 도입하고 종료 코돈은 ScoI 사이트로 교체되었습니다. 조각은 NcoI와 SacI와 소화하고 pET52b (+)의 각 사이트에 복제, pET52bMamAΔ41 - AMB1에 상승을 제공했다. 이 구조에서 mamAΔ41 유전자는 C - 말단에있는 10 그 태그로 프레임에 융합되었다. 플라스미드는 대장균 E. 스트레인 BL21에 electroporated되었습니다. E. 대장균은 pET52bMamAΔ41을 품고 BL21가 (15) 자동 유도에서 3 시간 동안 암피실린 (50 MG / ML) 310 ° K를 포함하는 매체를 성장했다 변형. 재배 온도는 310 °에서 다음 300 ° K로 이동 300 ° K.시 추가 48 H에 대한 유지되었다 세포는 277에서 10 분 ° K. 대한 5,465그램에서 원심 분리에 의해 수확했다 8리터 문화가 젖어 세포 펠렛 60 그램 생산. 2. 생물 정보학 계산 ProtParam 서버 (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)를 사용하여 분자량 (MW), 아미노산 순서에 따라와 280nm에서 단백질의 1mg/1ml의 예측 흡수의 계산. 10His 태그 - MamAΔ41에 대한 MW는 22529 다 (240 아미노산)이며 MamAΔ41 (트롬빈에 의해 그의 태그 제거 후 남은 9 아미노산 포함)에 대한 MW가 20596.5Da (187 아미노산)입니다. 10His 태그 - MamAΔ41에 대한 280nm에서 단백질의 1mg/1ml의 예측 흡수는 0.595이고 0.579 MamAΔ41위한 것입니다. 또한, 아미노산 서열은 시스테인 잔류물을 포함하지 않습니다. 따라서, 감소 대리인은 정화 과정 필요는 없습니다. 3. MamAΔ41의 정제 <ol><li> 재고 솔루션 준비, 밖으로 무게 다음과 같은 농도에서 (200 ML 각) 준비 : 이미다졸 (MW 228.2 g / 몰) 4M 솔루션, NaCl (MW 58.44 g / 몰) 5M 솔루션 트리스 - HCL (MW 121.3 g / 몰 ) 1M 솔루션은 산도 = 8을 조정합니다. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 두 증류수 (DDW)과 혼합을 추가합니다. 0.22μm 필터 및 실온에서 보관과 필터 솔루션을 제공합니다. </li><li> 준비 및 재고 솔루션 (Table1)로부터 6 신선한 버퍼를 필터링합니다. </li><li> 희석 및 버퍼 1시 2분 비율, 세포의 g는 버퍼로 볼륨 (ML)에서 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 샘플의 DNA 조각을 깰하기 위해 DNase I (1 MG / ML)의 박테리아의 각 10gr에 대한 10μl를 추가합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 프로 테아제 억제제 칵테일의 박테리아의 각 20gr을위한 1ml를 추가합니다. 얼음 20 분 알을 품다. </li><li> 25,000 PSI 프랑스어 언론의 두 사이클에 의해 세포를 중단. sonication 달리, 프랑스 언론은 얇은 구멍을 통해 높은 압력 하에서 세포를 강제하여 대량 (&gt; 10ml) 세포 압출 것을 목표로하고 있습니다. 피스톤은 온도 상승으로 인해 그 사용 및 조립하기 전에 십분 얼음에 냉각해야합니다. </li><li> 25ml 초원 심 분리기 튜브에 lysed 세포를 전송 및 샘플은 튜브의 목 라인에 도달할 때까지 버퍼와 (50mg) 정확하게 그 균형을. </li><li> 277에서 1 시간 동안 27만g에서 울트라 원심 분리하여 별도의 세포 부스러기 ° K. </li><li> 컬럼에 20 % 에탄올에 보존 아르 니켈 NTA 수지, 4 ML을 추가하여 만든 중력 니켈 NTA 칼럼 (2.5cm 직경)를 준비합니다. 완전히 액체 포기 후 DDW 40 ML로 세척하고 완전히 유체 포기. 버퍼 A. 40 ML과 열의 사전 equilibrated 수지 </li><li> 중력 니켈 NTA 칼럼에서 울트라 원심 분리 튜브에서 용해 분수를 적용합니다. -을 통해 흐름을 수집 (언바운드 단백질)와 277K에서 보존, 액체 포기. </li><li> 펠렛을 스크랩하기 위해 작은 팁을 사용하여 울트라 원심 분리 튜브에서 펠렛 샘플을 수집합니다. 50μl 5 % 2X의 β - 메르 캅 토 에탄올 SDS - PAGE 샘플 버퍼에 제보를 섞는다. </li><li> -을 통해 흐름을 수집하고 277K에서 보존, 유체 포기 100 ML 버퍼 B.있는 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 15 표시 eppendorf 튜브 (1.5ml)을 준비합니다. </li><li> 용리 - 가까이 열 밸브 다음 컬럼에 버퍼 C의 1ml를 로드할 수, 밸브 열고 흐름을 통해 컬렉션의 다음 3 분 알을 품다. 이 단계를 세 번 반복합니다. </li><li> Elute 정지 나머지 한 ML 버퍼 C 증가에와 밸브를 닫습니다. </li><li> 분수의 280nm에서 OD를 측정하여 단백질 피크의 위치를​​ 평가하고, OD 아직도&gt; 0.3 경우, 추가 샘플이 필요합니다. </li><li> 수집 분수의 SDS - PAGE 분석. 이러한 분석은 다음 예제와 함께 수행되어야 흐름을 통해 언바운드 단백질은 -을 통해 흐름을 씻고 Ultra - 원심 분리 펠렛 샘플. 10μl 5 % 2X SDS - PAGE 샘플 버퍼의 β - 메르 캅 토 에탄올 각 샘플에서 10μl를 섞습니다. 15% SDS - PAGE에 샘플을로드 180 볼트에서 45 분 동안 실행. </li><li> InstantBlue 솔루션 15 ML에 젤 스테인, 1 시간 동안 흔들. 플라스틱 상자를 커버하고 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다. </li><li> 젤을 평가, 단백질 표현이 나타내는 밴드에 따라 높이와 특정 경우, 선택한 eluted 분수를 병합합니다. </li><li> 10 그분의 태그를 제거하기 위해 결합 샘플을 제조 업체의 추천에 따라, 소 트롬빈 (10 대 / μl), 1 MG 단백질 당 10μl 트롬빈를 추가합니다. </li><li> 투석은 초과 이미다졸 제거를 위해 사용되며 이온 교환 바인딩을하는 동안 필요한 수준에 NaCl 농도를 감소합니다. 투석을위한 7 KD 분자량의 원하는 길이를 잘라 (MWCO) 투석 튜브를 잘라. DDW로 씻어 한 끝 (또는 클립 인감)에서 매듭을합니다. 상단의 일부 공간을 떠나있는 동안 가방에 병합된 단백질 솔루션을 전송 최대 클램프. </li><li> 4 리터 냉장 투석 버퍼에 잠수함 투석 튜브 (버퍼 D). 277에서 천천히 밤을 통해 솔루션을 저어 ° K. </li><li> , 비커의 투석 튜브 출력을 가지고 작은 상처를 만들고 50ml 튜브에 단백질을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 이온 교환 크로마 토그래피 : 빠른 성능 액체 크로마 토그래피 (FPLC)에 사전 포장 MonoQ 4.6/100 PE 열을 조립. DDW 여과 물 5 열 볼륨 (CV)로 컬럼을 씻으십시오. 버퍼 D. 5 CV와 Equilibrated 열 </li><li> DDW (두 루프 볼륨)와 사출 루프를 세척하고 주사 루프의 단백질을로드 버퍼 D.과 반복합니다. </li><li> 단백질 샘플을 (1 ML / 분 유량) 주사와 한정되지 않은 단백질의 SDS - PAGE 감지 분수를 수집 시작합니다. </li><li> 초기 단백질 볼륨 (3.23 단계)는 사출 루프보다 큰 경우에는 전체 표본이 칼럼에로드되기 전까지는, 루프를 세척하지 않고 단계 3.25-3.26를 반복합니다. </li><li> 억제할 수없는 단백질을 제거하기 위해 버퍼 C 3 CV와 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 높은 흐름 속도가 비용에 사용될 수 있지만 버퍼 D &amp; E (100 % 버퍼 E는 그라디언트의 마지막 때), 유량 1 ML / 분 (사이 40 2000mM NaCl의 60 분 선형 그라디언트로 단백질을 Elute 큰 볼륨하지만, 덜 집중, 단백질 봉우리). 그들은 280nm 크로마토 그램에서 나타나는 단백질의 봉우리를 수집합니다. </li><li> 클린 사전 포장 열을 추천을 제조했다. </li><li> 수집 분수의 SDS - PAGE 분석. 이러한 분석은 다음 예제와 함께 수행되어야 억제할 수없는 단백질 흐름 통해 단백질 봉우리 흐름을 통해. SDS - PAGE를 실행하고 단계 3.17-3.18에 대한 언급으로 얼룩. </li><li> 단백질 미리 묻은 마커에 따라 예측된 MW에서 단백질 밴드 존재 젤을 평가해보십시오. 관련 단백질을 포함 선택 용출 분수를 병합합니다. </li><li> 크기 배제 크로마 토그래피에 필요한 NaCl 농도를 낮게하기 위해, 병합된 샘플을 Dialyze. 로 버퍼 F. 대해 단계 3.21-3.23에 언급된 투석을 수행 </li><li> 사용 Vivaspin - 15 10,000 MWCO 8 테이블 원심 분리기, 4000 RPM의 MG / ML.을 단백질 샘플을 집중 쿼츠 쿠베트에서 280nm에서 OD를 측정하여 원하는 농도를 확인합니다. 단백질이 너무 집중되면 버퍼 F로 희석하고 다시 측정합니다. </li><li> 크기 제외 미리 포장 열, FPLC에 HiLoad 60분의 26 Superdex 200, 조립, DDW 필터링 물 3 CV로 컬럼을 씻어. 버퍼 F. 3 CV와 Equilibrated 열 </li><li> 주사 루프의 단백질 시료에 대한 4 개 이상 ML을 로드할 수 없습니다 버퍼 F.와 동일한 볼륨에 의해 다음 5ml DDW (두 루프 볼륨)과 주사 루프를 씻으십시오. </li><li> 단백질 샘플을 (3.5 ML / 분 유량) 주사하고 그들이 280nm 크로마토 그램 나타나는 단백질 피크 분수를 수집 시작합니다. 그것이 열 볼륨에 도달할 때까지 버퍼 흐름을 보자. </li><li> 초기 단백질 볼륨 (3.23 단계)는 사출 루프보다 큰 경우에는 전체 표본이 칼럼에로드되기 전까지는, 루프를 세척하지 않고 단계 3.25-3.26를 반복합니다. </li><li> 제조 추천에 따라 청소 미리 포장 열. </li><li> 수집 분수의 SDS - PAGE 분석. 이러한 분석은 단백질 봉우리 샘플로 수행하여야한다. SDS - PAGE를 실행하고 단계 3.17-3.18에 대한 언급으로 얼룩. </li><li> 젤 평가 : 단백질 봉우리 특정하는 경우, 정확한 예측 MW에있는 단백질 미리 스테인드 마커와 한 밴드에 따라 관련 단백질의 eluted 분수를 선택 병합 볼 수 있습니다. </li><li> &gt; 20 테이블 원심 분리기에 MG / ML, 4000 RPM에 Vivaspin - 15 10,000 MWCO를 사용하여 단백질 샘플을 집중. 280nm에서 OD를 측정하여 원하는 농도를 확인합니다. 정화 MamAΔ41 그러면 26.5 결정화에 대한 MG / ML에 집중했다. </li> &lt;리튬&gt; 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 (든 - TOF)를 사용하여 샘​​플 순도 및 단백질 식별을 확인합니다. <li> 각각 25 - 50μl 단백질, 단백질은 질량 분석기와 SDS - PAGE에 따라 투석을하는 경우, 사전 표시된 eppendorf 튜브에 집중 MamAΔ41를 나눕니다. </li><li> 플래시 193 ° K.에 액체 질소와 저장소에 냉동 </li></ol> 4. 대표 결과 이 프로토콜이 올바르게 완료되면 하나는 높은 정화, 크기 동질적인 농축 단백질 샘플을해야합니다. 이러한 단백질 샘플 결정화 실험을 위해뿐만 아니라 효소 반응 속도론, 구속력 친화력 등의 생화학 연구, 그리고 준비가되어 있습니다. 정화 프로토콜의 주요 단계의 대표적인 결과입니다 여기에 설명되어 있습니다. 니켈 - NTA 친화 칼럼의 용출 프로필 SDS - PAGE 분석 ~ 22kDa (그림 1)의 적절한 MW의 용해 분율로 표현 단백질 이상의 높은 공개한다. 흐름을 통해 한정되지 않은 단백질에 단백질이 통한 흐름과 울트라 원심 분리 펠렛 샘플 세척하면이 SDS - PAGE 분석도 최소를 공개해야합니다. 적절한 단백질 큰 대역이 샘플에 나타나지 않는 경우도 잘못된 버퍼 준비, 세포 파괴 또는 문화 자동 유도 조건과 성장의 문제에 문제를 고려해야합니다. 이온 교환 크로마 토그래피는 니켈 수지 (정전기 상호 작용이나 히스티딘 / 부정적인 아미노산 풍부한 단백질 루프에 의한)과 포경 그의 - 태그 바람직한 단백질에 묶인 채로 다른 E.coli의 단백질 위해 바람직한 단백질 간의 분리하기 위해 preformed입니다. 이 열은 증가 NaCl 농도에서 긍정적으로 충전 수지 자신의 바인딩 선호도에 따라 단백질을 분리합니다. 높은 부정 청구 단백질에 부정 청구 것들을 검토할 appose 높은 NaCl 농도에 elute 것입니다. 이 칼럼의 장점은 높은 흐름 속도와 바인딩 용량입니다. 이온 교환 크로마토 그램 (그림 2) 증가 NaCl 농도 3 단백질의 집단 사이 좋은 분리를 보여준다. SDS - PAGE 분석이 더욱 정화 단계가 필요한지 여부를 바람직한 하나 평가를 분리, 각 인구의 MW를 결정하기 위해 필요합니다. 두 번째 인구가 소 트롬빈에 의해 죽습 세 번째 인구가 낮은 농도로 인해 SDS - PAGE에서 탐지되지 않습니다되었습니다 MamAΔ41 + 그의 태그 (~ 22kDa) 동안 첫 번째 인구는 MamAΔ41 (~ 20 KDA)입니다. 단백질의 봉우리가 명확히 분리되지 않으면 하나는 잘못된 버퍼 준비를 고려하거나 NaCl 기울기의 기울기를 변경해야합니다. 크기 제외 크로마 토그래피는 니켈 - NTA 수지에 묶인 채로 및 이온 교환 크로마 토그래피 동안 분리되지 않은 다른 E.coli 세포 단백질 위해 바람직한 단백질 간의 분리하기 위해 preformed입니다. 이 항목은 자신의 크기에 따라 단백질을 분리합니다. 대형 단백질 큰 볼륨으로 eluted 것입니다 작은 반대 작은 용출 권 elute 것입니다. 칼럼 크로마토 그램 (그림 3)은 하나의 주 인구로 바람직한 단백질의 좋은 분리를 보여준다. 인구는 ~ 20 KDA의 MW로 적절한 단량체 크기 elute 나타납니다. ~ 80 KDA 밴드 (NI - NTA 수지를 바인딩 E.coli 전형적인 단백질)의 존재는 열 로딩하기 전에 SDS - PAGE에서 발견이 실행되는 동안 사라지게됩니다. 이 ~ 80 KDA 단백질의 농도가 시작하는 낮은 것이므로, 그 인구는 희석 및 SDS - PAGE 분석은 정화 효율을 결정하기 위해 필요에 의한 크로마토 그램에 나타나지 않습니다. 우리는 하나 반드시 해당 MW의 순수한 단백질의 존재를 확인할 수 있도록 SDS - PAGE로 주봉의 희석 및 농축 샘플을 로딩하는 것이 좋습니다. 이 단계에 의해 단백질이 정화이며 균질성이 든 - TOF에 의해 평가해야합니다. 이 분석은 10,176 다 (그림 4)에서 20,347 MW 다 다른의 MW의 단백질을 공개했다. ~ 10 KDA 단백질은 ~ 20 KDA 단백질이 부과 두 배가됩니다. 그의 태그 제거 후 남은 9 아미노산과 MamAΔ41의 예측 MW는 20596.5 다되었습니다. 얻은 든 - TOF MW에 비교하여 우리는 그들이 떨어져 248 다 것으로 나타났습니다. 이 차이가 든 - TOF 측정 오류 및 / 또는 첫 번째 메티오닌의 일반적인 저하와 두 번째 글리신으로 인해에서 발생할 수 있습니다. 결론을 위해서는 단백질이 높은 정화하고 추가 실험에 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. 버퍼 공법. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 니켈 - NTA 칼럼 정화의 대표 SDS - PAGE 분석 오른쪽에서 왼쪽으로,. P 울트라 원심 분리기 펠릿 (3.11 프로토콜 단계), W - 씻어 (3.12 프로토콜 단계), U - 억제할 수없는 단백질 (3.10 프로토콜 단계), E - 용출 샘프 다섯 차선레 (3.14 프로토콜 단계), M - 단백질 마커 (숫자 MW를 나타냅니다.) 화살표 MamAΔ41을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 이온 교환 크로마 토그래피 단계 (A) 이온 교환 (MonoQ 열) 크로마토 그램의 분석, 블루 - 수집 분수의 표시 - 흡수 280nm, 단백질 농도, 그린 - NaCl 농도, 레드를 나타냅니다. 이온 교환 정화 단계 (B) 대표 SDS - PAGE 분석. 왼쪽에서 오른쪽으로, M - 단백질 마커 (숫자 MW를 나타냅니다), A6 - 첫번째 피크 분율, A8 초 피크 ​​분수. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 크기 배제 크로마 토그래피 분석 (A) 크기 배제 (Superdex 200 열) 크로마토 그램, 블루 - 흡수 280nm, 단백질 농도, 수집 분수의 빨간 표시를 나타냅니다. 크기 제외 정화 단계 (B) 대표 SDS - PAGE 분석. 왼쪽에서 오른쪽으로, M - 단백질 마커 (숫자 MW를 나타냅니다), PreI - 사전 주입 샘플, 첫 번째 정상에서 수집한 A4 - 6 결합 분율, A4 - 6D - 희석 분율은 정상에서 수집했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 (든 - TOF) 정화 MamAΔ41의 질량 스펙트럼. 매트릭스 Sinapic 산성 (SA)입니다. MamAΔ41도 같이 20,347 다에 나타난 것은 다 10176에 MamAΔ41의 두 배로 부과 수종입니다.

<ol><li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+Bacteria+and+Magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.</a> Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).</li>
<li>D'Andrea, L. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPR+proteins%3A+the+versatile+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">TPR proteins: the versatile helix.</a> Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).</li>
<li>Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+folding%3A+localized+functions+of+cytosolic+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">More than folding: localized functions of cytosolic chaperones.</a> Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).</li>
<li>Brocard, C., Hartig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+targeting+signal+1%3A+is+it+really+a+simple+tripeptide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).</li>
<li>Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+PTS1-+and+Rab8b-binding+properties+of+Pex5p+and+Pex5Rp%2FTRIP8b%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b.</a> Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).</li>
<li>Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein-import+machinery%3A+correlating+structure+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function.</a> Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).</li>
<li>Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+evolved+discriminators+in+the+3-TPR+domain+of+the+Toc64+family+involved+in+protein+translocation+at+the+outer+membrane+of+chloroplasts+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Model%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria.</a> J Mol Model. 15, 971-982 (2009).</li>
<li>Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+and+outer+membrane+assembly+in+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).</li>
<li>Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+residues+in+Mycobacterium+tuberculosis+protein+kinase+G+play+a+role+in+regulating+kinase+activity+and+survival+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host.</a> J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).</li>
<li>Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratricopeptide+repeats+in+the+type+III+secretion+chaperone%2C+LcrH%3A+their+role+in+substrate+binding+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion.</a> Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).</li>
<li>Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+proteomic+analysis+of+the+magnetosome+membrane+in+Magnetospirillum+gryphiswaldense%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).</li>
<li>Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+vesicles+are+present+before+magnetite+formation%2C+and+MamA+is+required+for+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).</li>
<li>Okuda, Y., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+a+magnetosome-associated+protein%2C+TPR-containing+MAM22%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).</li>
<li>Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+localizations+of+Mam22+and+Mam12+in+the+magnetosomes+of+Magnetospirillum+magnetotacticum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum.</a> J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
</ol>

단백질 정제는 생화학 단백질이나 구조 연구의 주요 단계입니다. 각각의 단백질 자체 동작과 독특한 있기 때문에 하나의 속성을 정의하고 이에 따라 그 정화를 수정해야합니다. 단백질 대상은 생물 정보학 도구를 사용하여 정화위한 첫 단계로 분석을해야합니다. 그들은 대상 ISO - 전기 지점을 계산 환경 및 특수 이온 / 리간드에 대한 필요성을 감소 / 산화에 대한 필요성을 평가하는 데 사용됩니다. 대상 독자성을 반영 우리 프로토콜의 몇 가지 중요한 변경 사항이 있습니다. 이러한 수정은 버퍼, 작동 온도 및 열 조정이 포함됩니다. 첫 번째 중요한 수정 사용 (섹션 3.3)는 버퍼가 올바른 산도 범위, 이온 / 리간드와 단백질의 안정성과 기능에 필요한 이온 강도를 반영하기 위해 변경해야 할 버퍼입니다. 목표가 불안정의 기호 (열화, 강수량이나 기능의 손실)을 표시하는 경우 하나가 테스트하고 다른 더 적당한 버퍼를 검색합니다. 또 다른 중요한 문제는 정화 속도와 작동 온도입니다. 이 단백...

<table><tbody><tr><td>프렌치 프레스(French Press)</td><td>장비</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>압력 셀(Pressure cell)</td><td>장비</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>장비</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>로터(Rottor)</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>직경 2.5cm, Glass Econo-Column 크로마토그래피 컬럼</td><td>장비</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His Bind 레진</td><td>장비</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>장비</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>장비</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>고속 액체 크로마토그래피- AKTA purifier 10</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>이온 교환 컬럼 &amp;#8211; MonoQ 4.6/100 PE</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>크기 배제 충전 컬럼-HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>장비</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon - Vivaspin15 &amp;#8211; 10,000 MWCO</td><td>장비</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>탁상 원심분리기</td><td>장비</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>장비</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl ((hydrotymethyl) aminomethane)</td><td>시약</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시약</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸(Imidazole)</td><td>시약</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (Deoxyribonuclease I)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>우혈성 트롬빈(Bovine Thrombin)</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>글리신(Glycine)</td><td>시약</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>도데실 황산나트륨 (SDS)</td><td>시약</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>시약</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>시약</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

의 정화 m. magneticum 스트레인 amb - 1 magnetosome 관련 단백질 mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic 박테리아는 지자기의 필드 함께 스스로를 동쪽을 향하게 수 있습니다 수생 미생물의 다양한 그룹을 구성. 이 문제는 적합한 환경에서 검색을 돕기 위해 생각됩니다<em&gt; (1)</em&gt;. 이 기능은 magnetosome에 의해 수여됩니다 지질의 선형 체인 어셈블리로 구성되어 subcellular organelle은 자철광 또는 greigite의 ~ 50 나노미터 크리스탈 biomineralize하고 묶으에 각 수 vesicles. 기능 vesicles의 형성에 필요한 것으로 표시되었다 magnetosome의 주요 구성 요소가 마마입니다. 엄마가 가장 특징 magnetosome - 관련 단백질 중 하나입니다 매우 풍부한 magnetosome - 관련 단백질입니다<em&gt; 생체내에</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. 이 문서는, 엄마의 정화에 초점을 맞추고있는 연구 임에도 불구하고<em&gt; 생체내에</em&gt; 더 명확한 기능이나 구조 자세한 사항은 그것을 발견되지 않았습니다. 생물 정보학 분석 엄마가 단백질을 포함하는 테트라 - tricopeptide 반복 (TPR)입니다 것을 제안했습니다. TPR은 단백질의 다양한 큰 접어 이러한이나 성형 일환으로 발견 구조적 모티프이며, 그것은 단백질 - 단백질 상호 작용과 mediates 다중 단백질 단지에 대한 템플릿 역할<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs는 진핵 세포 organelle 프로세스와 많은 세균 경로에 많은 중요한 작업에 참여<em&gt; (8-14).</em엄마 이해하기&gt; 위해서는 단백질을 포함하는 독특한 TPR은 매우 정제된 단백질은 첫 단계로 필요합니다. 이 문서에서는, 우리는에서 안정적인 엄마를 삭제 돌연변이 (MamAΔ41)에 대한 정화 프로토콜을 제시<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB - 1.

엄마가 magnetosome 활성화에 참여하는 표시되었습니다 독특한 Magnetosome 관련된 단백질이다. 여기에서 엄마가 삭제 돌연변이의 정화 프로토콜 (MamAΔ41)을 제시<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB - 1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

자기성 세균(Magnetotactic bacteria)은 지구 자기장을 따라 스스로 방향을 잡을 수 있는 수생 미생물들의 다양한 집단으로 구성됩니다. 이러한 행동은 ...

정제 과정은 Mame. Delta 41 재조합 단백질을 발현하는 세포 펠릿에서 시작됩니다. 세포막 파괴 후 가용성 분획과 불용성 분획을 분리합니다. 가용성 재조합 단백질을 추출하기 위해, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 태그가 붙은 재조합 단백질을 다른 세포 단백질로부터 분리합니다.이온 교환 크로마토그래피를 통해 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 후에도 남아 있는 다른 세포 단백질로부터 mamma Delta 41을 분리합니다. 크로마토그래피를 통해 mamma Delta 41을 추가로 분리하고 그 올리고머 상태를 확인합니다. 마지막으로, 재조합 단백질의 순도와 균질성을 분석합니다.안녕하세요, 저는 Benon University of the Negative 생명과학과의 XVA 실험실 책임자인 Raza입니다. 그리고 Z 실험실의 Natalie입니다. 오늘은 재조합 단백질 정제 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 자성 관련 단백질을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 프로토콜을 시작하겠습니다. MAME Delta 41 단백질은 10-his 융합 단백질로 발현됩니다.Epi Brazilin이 포함된 자동 유도 배지에서 BL 21 e coli 세포를 310 K에서 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 온도를 300 K로 변경하고 48시간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리를 통해 세포를 회수하고, 상층액을 따라낸 후 얻어진 세포 펠릿의 무게를 측정합니다.8 L의 배양액에서 약 60 g의 습윤 세포 펠렛이 생성되어야 합니다. 단백질 정제 전, 4 M imidazole, 5 M sodium chloride 및 1 M tris HCl pH 8의 200 mL 스톡 용액을 준비하십시오.이중 증류수(DDW)를 사용하여 용액이 투명해질 때까지 볼텍싱한 후 0.22 µm 필터로 여과합니다. 스톡 용액은 새로 조제하여 여과하고, 버퍼 A부터 F까지는 이 비디오에 동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 여과하십시오. 단백질 정제를 시작하려면, 세포 질량 대비 버퍼 부피의 비율을 1:2로 하여 세포를 버퍼 A에 재현탁하십시오.박테리아 10 g당, 샘플 내의 모든 DNA 단편을 분해하기 위해 dna one 10 µL를 첨가합니다. 그 다음, 유리 프로테아제 억제제 칵테일인 E dt 1 mL를 첨가합니다. 박테리아 20 g당, 해당 용액을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.배양 후, 25,000 PSI에서

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 면역자기 표적화 및 말초 혈액 단핵 세포 현탁액에서 분리하여 B 세포를 정제하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 특정 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 특정 항체 또는 리간드(자성 입자에 연결됨)로 원치 않는 세포 유형을 라벨링하여 자기 분리에 의해 이종 세포 현탁액에서 고갈시키는 것을 포함합니다.

음성 면역자기 선택: 말초 혈액 단핵 세포에서 B 세포를 정제하는 방법

이 동영상에서는 마그네틱 마이크로비즈를 사용하여 타겟 바이오유체에서 엑소좀을 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 절차를 통해 엑소좀을 빠르게 포획할 수 있으며, 엑소좀은 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

마그네틱 비드 기반 엑소좀 추출: 생체 유체에서 특정 엑소좀을 분리하는 기술

우리는 자연 물에 적용 할 수있는 magnetotactic 박테리아 (MTB)를 수집하는 방법을 보여줍니다. MTB는 고립과 박테리아의 자연 자기의 활용 비교적 간단한 설정을 사용하여 침전 샘플 풍부하게 할 수 있습니다. 절연 MTB 그런 다음 빛과 전자 현미경를 사용하여 자세하게 검토 할 수 있습니다.

당연히 환경에서 Magnetotactic 박테리아를 발생의 수집, 절연 및 강화

이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.

미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

엑소좀은 생체 유체 내에서 발견되는 미세소포 구조로, 잠재적으로 중요한 질병 차별적 바이오마커를 운반할 수 있습니다. 여기에서는 비균일 전기순환 구형파를 사용하여 엑소좀이 파괴된 후 엑소좀을 특이적으로 추출하고 RNA/단백질 표적 모두에 대한 엑소좀 화물을 신속하게 테스트하기 위한 새로운 방법을 사용합니다.

전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

코발트 도핑된 마그네토페리틴의 합성 및 양이온화를 위한 프로토콜과 양이온화된 마그네토페리틴으로 줄기세포를 빠르게 자화하는 방법을 제시합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

우리는 성장 하는 두 가지 유형의 성장 매체에서 Magnetospirillum 의 여러 변종에 대 한 절차를 제시. MSR-1 Magnetospirillum gryphiswaldense 긴장은 성장 액체와 O2 농도 기온 변화도에 반 고체 미디어 M. magneticum AMB 1 긴장과 M. magnetotacticum 변형 MS-1 액체 매체에서 성장 하는 동안.

속 Magnetospirillum의 Magnetotactic 박테리아 성장: 변종 MSR-1, 자녀-1 및 MS-1

여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법

이 프로토콜은 피코에리트린(PE) 표지된 유세포검사 항체와 항PE 미생물구슬을 이용한 자기 구슬 기반 분류 방법을 설명하며, 고가의 세포 분류기나 표적 특이적 맞춤 구슬 없이 고가의 세포 분류기나 표적 맞춤형 비드 없이 고가의 세포 분류기나 표적 특이적 비드 없이 높은 사후 표적 표적 양성률을 가진 특정 중간엽 줄기세포 아군을 분리합니다.

간접 자기 구슬 전략을 이용한 포도플라닌 양성 중간엽 줄기세포 아군의 분리 및 검증

배우세요 MamAΔ41 단백질 정화 방법을 M. magneticum AMB-1에서. 친화성, 이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 고순도 단백질을 얻고 마그네토솜 관련 단백질 연구에 활용하세요.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

더 많은 동영상 탐색