배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

쥐 배아에서 등쪽 척수 절편을 분리하여 3차원 콜라겐 겔에서 배양하며, 후보 신호 분자를 발현하는 세포를 반대편에 배치합니다. 등쪽 척수 절편 내에서 성장하는 축삭의 방향을 재설정하는 해당 신호 분자의 능력을 면역조직화학법을 통해 평가합니다.

안녕하세요, 저는 서던캘리포니아대학교 생물과학과의 Samantha Butler 연구실 소속 Virginia Hazen입니다. 저는 같은 Butler 연구실의 Keith Fun입니다. 그리고 저는 Butler 연구실의 Ken Ya Mai입니다.

오늘은 콜라겐 매트릭스 내에서 배측 척수 이식물과 형질전환된 cost 세포 응집체를 배양하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 사용하여 후보 리간드 분자들이 척수 뉴런을 방향 지게 하는 능력을 분석합니다. 이번 실험에서는 골 형성 단백질인 BMP seven이 화학적 반발 물질로 작용하는 능력을 조사하겠습니다.

시작하겠습니다. co 세포로부터 유래한 comm choral 축삭의 궤적에 영향을 주기 위해 사용될 co 세포 응집체를 준비합니다. 여기서는 관심 분자인 골 형성 단백질 또는 BMP seven의 발현 플라스미드를 형질전환하였습니다.

디쉬에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 1X PBS로 세포를 헹굽니다. PBS를 제거하고 0.5 mL의 효소 미포함 세포 해리 배지(enzyme free cell dissociation medium)를 처리하여 15분 동안 반응시킵니다. 소태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 배지 1 mL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.

1000 µL 피펫 팁을 사용하여 배양 접시 표면에 세포가 남지 않을 때까지 반복해서 파이펫팅합니다. 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 2분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 2000 RPM에서 상층액을 제거하고, 피펫으로 상하 흡입 및 분사를 반복하여 세포를 재부유시킵니다.

35 millimeter 배양 접시 뚜껑 안쪽에 100 µL의 배지를 넣고, 세포 용액 20 µL를 여러 방울 떨어뜨립니다. 접시 위에 뚜껑을 덮어 닫은 후, 세포가 응집될 수 있도록 인큐베이터에 몇 시간 동안 둡니다. 등쪽 척수 이식물을 준비하려면, 갓 채취한 상태를 유지하십시오.

얼음 위에 E 11 쥐 배아를 둡니다. L 15 배지 내에서 끝을 뾰족하게 만든 텅스텐 바늘을 사용하여, 각 배아의 전지 싹 바로 아래 몸통 부위에서 4~6개의 체절 섹션을 제거합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 해당 조직을 4구 웰 플레이트의 한 웰에 수집합니다.

얼음 위에 놓인 웰 디쉬를 준비합니다. 모든 세그먼트의 해부가 완료되면, 피펫을 사용하여 조각들을 L 15 배지와 디스크 페이스트가 담긴 두 번째 웰 디쉬로 옮깁니다. 조직을 상온에서 5분 이내로 배양합니다.

세포 사멸을 방지하기 위해 조직을 과도하게 소화시키지 마십시오. 5% 열불활성화 염소 혈청이 포함된 신선한 L 15 배지 1 mL를 no 디쉬의 세 번째 웰에 넣습니다. 그리고 조직 조각들을 이 웰로 옮깁니다.

디스 공간 배양(dis space incubation)이 끝나면, 조직을 얼음 위에 1시간 동안 두어 휴지시킵니다. 이후 마이크로 원심분리 튜브에서 해부를 더 쉽게 하기 위해, 10 x 최소 필수 배지(minimal essential medium) 40 µL를 콜라겐 360 µL에 추가합니다. 그리고 짧게 볼텍싱하여 혼합한 후, 피코 퓨지(pico fuge)에서 원심분리하여 가라앉힙니다.

용액은 노란색을 띠며, 콜라겐이 굳는 것을 방지하기 위해 가능한 한 얼음 위에 보관해야 합니다. 콜라겐 용액이 약간 주황색으로 변할 때까지 각 콜라겐 배치에 0.8 M sodium bicarbonate를 적정하여 첨가하십시오. 각 첨가 단계 후에는 용액을 혼합하십시오. 콜라겐 용액이 이 색상이 되면 얼음 위에 보관할 경우 액체 상태를 유지하지만, 상온으로 가져오면 굳을 준비가 된 상태가 됩니다. 혼합 후 용액이 분홍색으로 변하면 새 콜라겐 튜브를 사용하여 다시 시작하십시오. 깨끗한 4-well dish의 각 웰에 20 µL의 콜라겐을 분주하십시오.

피펫 팁을 사용하여 콜라겐을 넓게 펴서 작은 패드 형태로 만듭니다. 콜라겐을 실온에서 약 10분 동안 굳힙니다. 해부 현미경 하에서, 새로 갈아낸 텅스텐 바늘과 미세 핀셋을 사용하여 배아 하나에서 척수를 둘러싸고 있는 중배엽을 텅스텐 바늘로 제거하고, 바닥판(floor plate)의 존재로 구분이 가능한 척수의 복측 부분을 제거합니다.

가장 복측 가장자리에서, 바닥판(floor plate)은 등측 가장자리의 지붕판(roof plate)보다 약간 더 두껍습니다. 이 예시에서 척수는 복측이 아래로 향하게 놓여 있습니다. 바닥판과 평행하게 조직을 조심스럽게 절단하여 척수의 복측 5분의 1 부분을 제거하십시오.

바늘을 사용하여 등쪽 척수 설명(explan)을 수직으로 이분합니다. 절단면이 최대한 깔끔하게 잘렸는지 확인하고, 필요한 경우 다시 다듬으십시오. 0.5 millimeter 직경의 유리 모세관이 장착된 마우스 피펫을 사용하여 각 x 설명(explan)을 각각 별도의 콜라겐 패드로 옮깁니다.

텅스텐 바늘을 사용하여 형질전환된 co 세포 응집체를 배측 척수의 가측 가장자리 너비와 거의 동일한 크기의 정사각형 모양으로 자릅니다.구분. 마우스 피펫을 사용하여 정사각형 조각 하나를 x 구분 표시가 된 콜라겐 패드 위로 옮깁니다. 마우스 피펫을 사용하여 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다.

소량의 액체가 이후의 콜라겐 도포를 돕기 때문에 과하게 흡입하지 마십시오. 프라이밍된 콜라겐 4 µL를 패드 위에 도포합니다. 조직에 직접 닿지 않게 텅스텐 바늘을 사용하여 콜라겐을 임플란트 위로 이동시킵니다. 콜라겐 내에서 바늘을 움직여 각 x explan의 co 세포 응집체가 그 측면 가장지에 인접하도록 방향을 맞춥니다.

콜라겐이 15~20분 동안 굳도록 둡니다. 다음 배아로 넘어가기 전, 조직 배양 후드 내에서 콜라겐 4 µL를 추가로 도포하여 x explan이 콜라겐에 완전히 둘러싸이도록 합니다. 0.5 mL의 배지를 넣고 인큐베이터에서 30~40시간 동안 배양합니다. 흄 후드 내에서 0.5 mL의 PBS 기반 4% Para formaldehyde 용액으로 45분 동안 explant를 고정합니다. 조직을 얼음 위에 둔 상태에서 0.5 mL의 blocking 및 permeation 용액(PBTN)으로 2회 세척합니다.

x 외식편을 블로킹 용액에 넣고 4°C에서 배양하며, 가급적 하룻밤 동안 유지하십시오. 포셉을 사용하여 4웰 플레이트에서 X 외식편을 절단한 후, 각각을 48웰 디쉬의 각 웰에 하나씩 넣으십시오.

각 웰에 1차 항체 200 µL를 첨가하십시오. 공통 쇄상 신경절(commissural) 축삭을 시각화하려면 mouse anti ttag 항체를 사용하고, 교차 세포 형질전환의 성공 여부를 판단하려면 테스트 중인 분자에 대한 항체를 포함하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

각 샘플을 4°C에서 PBTN 블로킹 용액으로 1시간씩 5회 세척합니다. PBTN을 제거하고 각 웰에 2차 항체 200 µL를 첨가합니다. 퇴색을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

이전과 동일하게 PBTN으로 샘플을 5회 세척합니다. 각 표본을 3웰 함몰 슬라이드로 옮깁니다. 과잉 액체를 제거하고 invecta shield medium을 도포한 후 커버 슬립으로 덮습니다.

슬라이드를 차광 폴더나 상자에 넣어 현미경으로 관찰하기 전까지 4°C 또는 -20°C에서 보관하십시오. 이제 배양, 고정, 염색 후 공초점 현미경으로 촬영한 x 외식편의 대표 이미지를 보여드리겠습니다. 패널 A는 흰색으로 표시된 roof plate의 X 외식편이 tag one 양성 choral 축삭을 자신으로부터 멀어지게 재배향할 수 있음을 보여주며, 이는 roof plate가 축삭 화학 유인 물질(chemo repellent)의 공급원임을 입증합니다. 패널 B는 M tact 신호 분자인 골형성단백질 또는 BMP seven을 분비하는 co 세포가 roof plate와 유사한 방식으로 carceral 축삭을 밀어낼 수 있음을 보여줍니다.

발현 플라스미드만 분비하는 세포와 공배양된 축삭은 축삭의 방향에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 지금까지 척수 explant를 박리, 정렬 및 배양하고 세포 응집체를 유도하여 후보 신호 분자가 축삭 재방향성 활성을 가지고 있는지 결정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 콜라겐을 가능한 한 얼음 위에 유지하고, explant가 배양액에 직접 접촉하지 않도록 콜라겐으로 완전히 감싸는 것이 중요합니다.

마지막으로, axon이 x explan의 복측 가장자리까지 신장될 때까지만 배양하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.I.