Name: 배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 배아 척수 외식체 배양을 통해 BMP7이 commissural axons의 방향을 재조정하는 능력을 평가하는 방법을. 면역조직화학법으로 축삭 성장을 시각화하여 신경 발달 및 축삭 유도 메커니즘 연구에 활용합니다.

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이 프로토콜은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 연구소에서 개발되었다. 방법은 콜라겐의 척수의 문화 explants에 콘레드 바슬러, 앤 Calof, 토마스 에들런드, 필 해밀턴, Domna Karagogeos, 아리엘 루이즈 I Altaba 및 Toshiya 야마다 등 많은 사람들이 결정. Marysia Placzek과 마크 테시어 - 라빈은 축삭지도 분자를 식별하는 수단으로 체외의 explants에서에서 축삭 성장을 사용할 수있는 기술을 개척. 버틀러 실험실에서 작품은 NIH / NINDS에서 천과 R01 NS063999의 3 월부터 기금에 의해 지원됩니다.

1 부 : Transfected COS 세포 집계의 준비 공중 방울을 사용하여 <ol><li> 종자 COS - 7 (COS) 35mm 문화 요리 세포. 그들이 제조 업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine2000을 사용하여 세포에 플라스미드 표현의 80 % confluency, transfect 1μg에 도달했을 때. </li><li> 방울 매달려 준비하려면, transfection 미디어를 기음과 1ml 1X의 인산 버퍼 솔루션 (PBS)로 transfected COS 세포를 헹굴. 15 분 동안 효소가없는 세포 분리 매체의 0.5ml로 세포를 처리합니다. 반응을 중지 Opti - 멤 + 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민 (P / S / G) + 10% 태아 소 혈청 (FBS)의 솔루션의 1ml을 추가합니다. </li><li> 문화 요리의 표면에서 그들을 제거하고 15ml 원뿔 튜브로 전송하는 세포를 씹다. 펠렛 세포에 2000K에서 2 분 동안 회전. Opti - 멤 + 1X P / S / G + 10% FBS의 100μl에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 접시의 바닥 위에 뚜껑 장소 반전, 35mm 문화 접시 뚜껑의 안쪽에 여러 20μl 방울을 스팟과 세포 집계까지 몇 시간 동안 37 ° C 배양기에서 두십시오. </li></ol> 2 부 : 도설 척수 Explants의 작성 <ol><li> 어머니의 자궁에서 E11 랫 배아를 해부하다 필요한까지 L15 매체 얼음 계속. </li><li> 날카롭게 텅스텐 바늘로 즉시 forelimb 버드 아래의 지역에서, 각 배아의 줄기에서 4-6 세그먼트 섹션을 제거합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 4 잘 Nunc 요리를 잘 하나에서 조직 조각을 수집하고 얼음 계속. </li><li> 모든 배아 세그먼트가 해부를하고있을 때, 1ml L15의 솔루션 + Nunc 요리 잘 순식간에 1mg dispase에 조각을 전송할 수있는 플라스틱 피펫을 사용합니다. 오분 이상없이 오래 실온에서 알을 품다. 이상 dispase있는 조직 조각을 품어하지 마십시오. </li><li> 부화하는 동안, 페트리 접시와 혼합하는 소용돌이에 L15 약 10ml에 가열 inactivated 정상 염소 혈청 (HIGS)의 0.5ml를 추가합니다. 삼분의 일에 잘 Nunc 요리의 솔루션을 1ml를 전송하고 부화가 끝나면이 솔루션에 조직 조각을 전송할 수 있습니다. 얼음 계속. 참고 : 조직 조각이 시간 동안 얼음에 &quot;나머지&quot;를 허용하는 경우 이후의 절개가 쉬울 것입니다. </li></ol> 파트 3 : 마중물 콜라겐 <ol><li> 360μl 콜라겐을 40μl 10X 최소 필수 매체를 추가 튜브를 flicking 또는 간단히 vortexing하여 신속하게 철저하게 섞는다. picofuge에 빠른 속도로 스핀 다운. 이 솔루션은 노란색 것입니다. 최대한 얼음에 보관. </li><li> (아래 참고 참조) 약간 주황색 콜라겐 솔루션을 설정하는 충분한 0.8M 나트륨 중탄산염을 (NaHCO 3) 추가합니다. 다시 말하지만, flicking에 의해 신속하게 그리고 철저하게 혼합하고, picofuge에 잠시 스핀 다운. 솔루션은 혼합 후 분홍색 남아있을 경우, 당신은 너무 NaHCO 3 추가하고 콜라겐의 새로운 튜브로 다시 시작해야합니다. </li><li> 이 시점에서 콜라겐 솔루션은 준비하는 것입니다. 그것은 얼음에 액체 유지되지만, 실온에 데려왔을 때 약 5 분 (분홍색으로 변했) 내에 고체화됩니다. </li><li> 4 잘 Nunc 요리의 각 우물에 콜라겐의 스팟 20μl. 당신의 피펫의 팁을 사용하여 작은 &quot;패드&quot;를 형성하는 콜라겐을 확산. 상온에서 설정 콜라겐을 보자. </li></ol> 참고 : NaHCO 3의 정확한 금액은 콜라겐의 각 배치에 대해 titrated해야합니다. 낮은 시작 (11μl)와 솔루션은 오렌지의 약간 그늘 때까지 다음 0.5 - 1μl stepwise를 추가합니다. &quot;오른쪽&quot;금액은 보통 콜라겐 분홍색을 돌려 것이다 NaHCO 3의 작은 금액보다 1ul 적습니다. NaHCO 3의 금액은 선형 위 또는 아래로 확장되지 않습니다. 4 부 : 도설 척수의 Explants과 콜라겐 매트릭스에서 COS 세포 집계와 함께 그들의 위치의 해부 <ol><li> 갓 둘레에 텅스텐 바늘과 고급 포셉 한 쌍의 (# 5 # 55)를 사용하여 척수를 둘러싼 mesoderm를 제거합니다. </li><li> 텅스텐 바늘로 바닥 판에 평행하게 절단하는 것은 신중하게 척수의 배면의 다섯째를 제거합니다. </li><li> 모서리가로 깨끗하게 가능한 절단하고 있는지 만드는 등의 척추 explant를 이등분하다. 필요한 경우, 모서리를 다시 잘라. 약에 가져온 유리 모세관가 장착되어 입을 피펫을 사용하여 별도의 콜라겐 패드에 각 지느러미 척추 explant을 전송합니다. 지름 0.5mm. </li><li> 지느러미 척추 explant의 측면 가장자리로 거의 같은 넓이의 정사각형으로 transfected COS 세포의 집계를 잘라. </li><li> 입 피펫을 사용하여 지느러미 척추 explant과 콜라겐 패드에이 사각형 중 하나를 전송합니다. </li><li> 입 피펫으로 입 피펫을 사용하여 초과 액체를 대기음. 기음 이상하지 마십시오. </li><li> 패드에 준비하는 콜라겐의 4μl를 적용하고, 텅스텐 바늘을 사용하여직접 조직을 건드리지 않고 explants 통해 콜라겐 이동합니다. explants을 둘러싸고있는 콜라겐의 텅스텐 바늘을 이동하여, 동양 explants 있도록 COS 세포의 집계가 등의 척추 explant의 측면 가장자리에 인접한입니다. </li><li> 콜라겐 설정한 후 explants가 콜라겐에 완전히 쌌다되는 것을 보장하기 위해 콜라겐의 4μl의 응용 프로그램을 반복합니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 30-40시간에 대한 Opti - 멤 + 1xP/S/G 문화 0.5ml를 추가합니다. </li><li> 얼음 접시를 유지, 1xPBS에 0.​​5ml 4 % paraformaldehyde로 45 분간 explants을 수정. </li><li> 1xPBS의 차단 솔루션 + 0.1 % 트리톤 - X100 1퍼센트의 HIGS (PBTN)의 0.5ml로 두 번 씻으십시오. 4 블록 ° C 시간 중 적어도 몇, 야간 부화가 immunohistochemistry에 의해 처리 후 바람직하고 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : Immunohistochemistry에 의해 Commissural Axons의 시각화 <ol><li> PBTN에서 차단 후, 포셉 및 48 잘 접시에 장소 4 잘 접시의 explants을 잘라 버릴거야. </li><li> 각 잘하는 기본 항체의 200μl를 추가하고 4 박 떠나 ° C. commissural axons을 시각화하기 위해 마우스 방지 Tag1 항체의 1시 6분 솔루션을 사용합니다. transfection가 성공 여부를 결정하기 위해, 또한 신호 분자가 에피토프이 태그되었는지 중 신호 분자가 테스트하거나 관련 에피토프되는 대한 일차 항체를 포함합니다. </li><li> 4 PBTN 5 X 1시간 ° C. 각 샘플을 와시 </li><li> 각 잘하는 이차 항체의 200μl를 추가하고 4 박 떠나 ° C. 안티 Tag1 항체가 기본 항체로 사용했다면, FITC 또는 Cy3 중 하나에 결합 염소 항 마우스 IgM 항체 보조를 사용합니다. 가벼운 민감한 차 항체를 사용하면 FITC 또는 Cy3로 결합하는 경우,이 시점부터는 호일로 덮여 48 잘 요리를 보관. </li><li> 각 샘플 5 4에서 X 1시간 PBTN 각 ° C. 와시 </li><li> , 3 잘 우울증 슬라이드에 explant을 전송 Vectashield 매체와 coverslip에 마운트를 초과 액체를 제거합니다. 4 ° C 또는 -20 ° C. 중 하나에서 빛이 금고에 저장 </li></ol> 6 부 : Explants 대표 이미지 성공적인 실험에서, explant와 C​​OS의 집계가 서로 인접 유지하고 콜라겐이 세트로 떨어져 표류하지 않습니다. axons의 최소한의 전면에 자라난 것이있을 것이다; 중요한 axonal 전면에 자라난가 등의 척추 explant 너무 오래 교양있는 것을 나타냅니다. explant에서 성장하고 더 blebs있을 수 없다, 조직 문화 매체와 직접 접촉으로 온다면 blebbing이 발생합니다. axons을 방향으로 신호 분자의 기능은 공촛점 현미경을 사용하여 평가됩니다. 축삭의 reorientation의 범위는 COS 세포 집계 3 가장 가까운 axons의 reorientation의 평균 각도를 측정하여 계량하실 수 있습니다. 그림 1에 표시된, COS 세포는 표현 myc - 태그 BMP7 (파란색)가 지붕 판의 explant가 commissural axons를 (그림 들어갈 수있는 방식과 유사 BMP7의 원본 (그림 1B)에서 멀리 Tag1 + commissural axons (녹색)를 방향 1A). 제어 벡터를 표현 COS 세포는 commissural axons 3,4의 방향에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 explants 또한 모터 뉴런과 지느러미 interneurons을 장식 전사 인자 Isl1 / 2 (빨간색)에 대한 항체로 분류되었습니다. 이 결과는 최초로 표시했다는 BMP 가족 mediates의 일원 지붕 판 chemorepellent 3 활동. <img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" /> 그림 1 : 제발 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22The+development+of+the+rat+spinal+cord%22">The development of the rat spinal cord</a>. , (1984).</li>
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</ol>

이 분석을 수행하는 성공을 결정하는 중요한 요인이 처음이고, 조직이 너무 연장 기간 동안 dispase로 치료해서는 안됩니다, 이러한 치료는 조직이 매우 끈적되고 및 생존 감소가 발생하게됩니다. 둘째, 콜라겐은 완벽하게 준비하는과 최대한 얼음에 보관해야합니다. 이 설정 시작하면 그것은 처리하기 위해 점점 더 어려워 될 것입니다, 핑크 차례 즉. 세는 텅스텐 바늘은 항상 매우 날카로운 보관해야합니다.

배아 척수 commissural axons을 방향을 diffusible 신호 분자의 능력을 시금

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

척추 척수 1 도설 commissural axons은 축삭지도 신호를 식별하는 귀중한 모델 시스템을왔다. 여기, 우리는 시험 관내 분석, commissural axons의 방향 2 외부와 내장 신호의 효과를 연구하기 위해 광범위하게 사용되고 있습니다 &quot;reorientation 분석&quot;에 대해 설명합니다. 에 chemorepellent BMP를 포함하여,이 분석은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 실험실에서 수많은 사람들에 의해 개발되었습니다 (자세한 내용은 응답을 참조)이 분석의 버전은 주요 축삭지도 분자의 reorientation 활동을 증명하는 데 사용되었다 지붕 판 3,4 및 Netrin1 5 소닉 헤지 호그 (쉬) 척수의 바닥 판에 6 chemoattractive 활동. 척수의 지느러미 3 분의 2로부터 2-3 세그먼트로 구성된 Explants은 배아 일 (E) 11 쥐에서 해부하고 입체 콜라겐 젤 7 양식입니다. E11 등의 척추 explants은 당단백질, Tag1 8 그들 axonal 표현식에서 확인할 수 있습니다 새로 태어난 commissural 뉴런을 포함합니다. 문화 30-40시간 과정 동안 commissural 축삭의 궤도는 생체내에서 볼 비슷한 시간 코스 이들 지느러미 explants에 recapitulated 있습니다. 이 axonal 탄도는 테스트 조직이나 지느러미 explant의 측면 가장자리 중 하나를 접촉 후보 신호 분자를 표현 COS 셀 집합 중 하나를 배치하여 도전을 수 있습니다. 추가 조직의 주변에 연장 Commissural axons은 내생 지붕 판과 이소성 조직 측면에서 모두 신호의 영향 아래에서 성장합니다. commissural axons 이러한 상황에서 reoriented 아르 정도는 계량하실 수 있습니다. 이 분석을 사용하여 그것은 모두 commissural 궤도 9 직접이 신호의 필요성뿐만 아니라 commissural axons에게 3,4를 방향에 특정 신호의 자족을 확인 할 수 있습니다.

이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.

배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

척수 신경의 배측 교차 축삭(Dorsal commissural axons)은 축삭 유도 신호를 식별하는 데 있어 매우 유용한 모델 시스템이 되어 왔습니다. 본 연구에서 우리는...

쥐 배아에서 등쪽 척수 절편을 분리하여 3차원 콜라겐 겔에서 배양하며, 후보 신호 분자를 발현하는 세포를 반대편에 배치합니다. 등쪽 척수 절편 내에서 성장하는 축삭의 방향을 재설정하는 해당 신호 분자의 능력을 면역조직화학법을 통해 평가합니다.안녕하세요, 저는 서던캘리포니아대학교 생물과학과의 Samantha Butler 연구실 소속 Virginia Hazen입니다. 저는 같은 Butler 연구실의 Keith Fun입니다. 그리고 저는 Butler 연구실의 Ken Ya Mai입니다.오늘은 콜라겐 매트릭스 내에서 배측 척수 이식물과 형질전환된 cost 세포 응집체를 배양하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 사용하여 후보 리간드 분자들이 척수 뉴런을 방향 지게 하는 능력을 분석합니다. 이번 실험에서는 골 형성 단백질인 BMP seven이 화학적 반발 물질로 작용하는 능력을 조사하겠습니다.시작하겠습니다. co 세포로부터 유래한 comm choral 축삭의 궤적에 영향을 주기 위해 사용될 co 세포 응집체를 준비합니다. 여기서는 관심 분자인 골 형성 단백질 또는 BMP seven의 발현 플라스미드를 형질전환하였습니다.디쉬에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 1X PBS로 세포를 헹굽니다. PBS를 제거하고 0.5 mL의 효소 미포함 세포 해리 배지(enzyme free cell dissociation medium)를 처리하여 15분 동안 반응시킵니다. 소태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 배지 1 mL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.1000 µL 피펫 팁을 사용하여 배양 접시 표면에 세포가 남지 않을 때까지 반복해서 파이펫팅합니다. 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 2분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 2000 RPM에서 상층액을 제거하고, 피펫으로 상하 흡입 및 분사를 반복하여 세포를 재부유시킵니다.35 millimeter 배양 접시 뚜껑 안쪽에 100 µL의 배지를 넣고, 세포 용액 20 µL를 여러 방울 떨어뜨립니다. 접시 위에 뚜껑을 덮어 닫은 후, 세포가 응집될 수 있도록 인큐베이터에 몇 시간 동안 둡니다. 등쪽 척수 이식물을 준비하려면, 갓 채취한 상태를 유지하십시오.얼음 위에 E 11 쥐 배아를 둡니다. L 15 배지 내에서 끝을 뾰족하게 만든 텅스텐 바늘을 사용하여, 각 배아의 전지 싹 바로 아래 몸통 부위에서 4~6개의 체절 섹션을 제거합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 해당 조직을 4구 웰 플레이트의 한 웰에 수집합니다.얼음 위에 놓인 웰 디쉬를 준비합니다. 모든 세그먼트의 해부가 완료되면, 피펫을 사용하여 조각들을 L 15 배지와 디스크 페이스트가 담긴 두 번째 웰 디쉬로 옮깁니다. 조직을 상온에서 5분 이내로 배양합니다.세포 사멸을 방지하기 위해 조직을 과도하게 소화시키지 마십시오. 5% 열불활성화 염소 혈청이 포함된 신선한 L 15 배지 1 mL를 no 디쉬의 세 번째 웰에 넣습니다. 그리고 조직 조각들을 이 웰로 옮깁니다.디스 공간 배양(dis space incubation)이 끝나면, 조직을 얼음 위에 1시간 동안 두어 휴지시킵니다. 이후 마이크로 원심분리 튜브에서 해부를 더 쉽게 하기 위해, 10 x 최소 필수 배지(minimal essential medium) 40 µL를 콜라겐 360 µL에 추가합니다. 그리고 짧게 볼텍싱하여 혼합한 후, 피코 퓨지(pico fuge)에서 원심분리하여 가라앉힙니다.용액은 노란색을 띠며, 콜라겐이 굳는 것을 방지하기 위해 가능한 한 얼음 위에 보관해야 합니다. 콜라겐 용액이 약간 주황색으로 변할 때까지 각 콜라겐 배치에 0.8 M sodium bicarbonate를 적정하여 첨가하십시오. 각 첨가 단계 후에는 용액을 혼합하십시오. 콜라겐 용액이 이 색상이 되면 얼음 위에 보관할 경우 액체 상태를 유지하지만, 상온으로 가져오면 굳을 준비가 된 상태가 됩니다. 혼합 후 용액이 분홍색으로 변하면 새 콜라겐 튜브를 사용하여 다시 시작하십시오. 깨끗한 4-well dish의 각 웰에 20 µL의 콜라겐을 분주하십시오.피펫 팁을 사용하여 콜라겐을 넓게 펴서 작은 패드 형태로 만듭니다. 콜라겐을 실온에서 약 10분 동안 굳힙니다. 해부 현미경 하에서, 새로 갈아낸 텅스텐 바늘과 미세 핀셋을 사용하여 배아 하나에서 척수를 둘러싸고 있는 중배엽을 텅스텐 바늘로 제거하고, 바닥판(floor plate)의 존재로 구분이 가능한 척수의 복측 부분을 제거합니다.가장 복측 가장자리에서, 바닥판(floor plate)은 등측 가장자리의 지붕판(roof plate)보다 약간 더 두껍습니다. 이 예시에서 척수는 복측이 아래로 향하게 놓여 있습니다. 바닥판과 평행하게 조직을 조심스럽게 절단하여 척수의 복측 5분의 1 부분을 제거하십시오.바늘을 사용하여 등쪽 척수 설명(explan)을 수직으로 이분합니다. 절단면이 최대한 깔끔하게 잘렸는지 확인하고, 필요한 경우 다시 다듬으십시오. 0.5 millimeter 직경의 유리 모세관이 장착된 마우스 피펫을 사용하여 각 x 설명(explan)을 각각 별도의 콜라겐 패드로 옮깁니다.텅스텐 바늘을 사용하여 형질전환된 co 세포 응집체를 배측 척수의 가측 가장자리 너비와 거의 동일한 크기의 정사각형 모양으로 자릅니다.구분. 마우스 피펫을 사용하여 정사각형 조각 하나를 x 구분 표시가 된 콜라겐 패드 위로 옮깁니다. 마우스 피펫을 사용하여 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다.소량의 액체가 이후의 콜라겐 도포를 돕기 때문에 과하게 흡입하지 마십시오. 프라이밍된 콜라겐 4 µL를 패드 위에 도포합니다. 조직에 직접 닿지 않게 텅스텐 바늘을 사용하여 콜라겐을 임플란트 위로 이동시킵니다. 콜라겐 내에서 바늘을 움직여 각 x explan의 co 세포 응집체가 그 측면 가장지에 인접하도록 방향을 맞춥니다.콜라겐이 15~20분 동안 굳도록 둡니다. 다음 배아로 넘어가기 전, 조직 배양 후드 내에서 콜라겐 4 µL를 추가로 도포하여 x explan이 콜라겐에 완전히 둘러싸이도록 합니다. 0.5 mL의 배지를 넣고 인큐베이터에서 30~40시간 동안 배양합니다. 흄 후드 내에서 0.5 mL의 PBS 기반 4% Para formaldehyde 용액으로 45분 동안 explant를 고정합니다. 조직을 얼음 위에 둔 상태에서 0.5 mL의 blocking 및 permeation 용액(PBTN)으로 2회 세척합니다.x 외식편을 블로킹 용액에 넣고 4°C에서 배양하며, 가급적 하룻밤 동안 유지하십시오. 포셉을 사용하여 4웰 플레이트에서 X 외식편을 절단한 후, 각각을 48웰 디쉬의 각 웰에 하나씩 넣으십시오.각 웰에 1차 항체 200 µL를 첨가하십시오. 공통 쇄상 신경절(commissural) 축삭을 시각화하려면 mouse anti ttag 항체를 사용하고, 교차 세포 형질전환의 성공 여부를 판단하려면 테스트 중인 분자에 대한 항체를 포함하십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.각 샘플을 4°C에서 PBTN 블로킹 용액으로 1시간씩 5회 세척합니다. PBTN을 제거하고 각 웰에 2차 항체 200 µL를 첨가합니다. 퇴색을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.이전과 동일하게 PBTN으로 샘플을 5회 세척합니다. 각 표본을 3웰 함몰 슬라이드로 옮깁니다. 과잉 액체를 제거하고 invecta shield medium을 도포한 후 커버 슬립으로 덮습니다.슬라이드를 차광 폴더나 상자에 넣어 현미경으로 관찰하기 전까지 4°C 또는 -20°C에서 보관하십시오. 이제 배양, 고정, 염색 후 공초점 현미경으로 촬영한 x 외식편의 대표 이미지를 보여드리겠습니다. 패널 A는 흰색으로 표시된 roof plate의 X 외식편이 tag one 양성 choral 축삭을 자신으로부터 멀어지게 재배향할 수 있음을 보여주며, 이는 roof plate가 축삭 화학 유인 물질(chemo repellent)의 공급원임을 입증합니다. 패널 B는 M tact 신호 분자인 골형성단백질 또는 BMP seven을 분비하는 co 세포가 roof plate와 유사한 방식으로 carceral 축삭을 밀어낼 수 있음을 보여줍니다.발현 플라스미드만 분비하는 세포와 공배양된 축삭은 축삭의 방향에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 지금까지 척수 explant를 박리, 정렬 및 배양하고 세포 응집체를 유도하여 후보 신호 분자가 축삭 재방향성 활성을 가지고 있는지 결정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 콜라겐을 가능한 한 얼음 위에 유지하고, explant가 배양액에 직접 접촉하지 않도록 콜라겐으로 완전히 감싸는 것이 중요합니다.마지막으로, axon이 x explan의 복측 가장자리까지 신장될 때까지만 배양하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.I.

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