Name: Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 배우세요 섬유소 젤 비드 분석을 통해 혈관신생의 발아, 루멘 형성, 가지화 및 문합을 시각화하는 방법을. 이 체외 분석법은 혈관생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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준비 CELLS <ol><li> FBS / 펜 - Strep (1:100) 1~2일 구슬선 전에 M199/10 %에 HUVEC와 섬유아 세포를 가져와. </li><li> 섬유아 세포에 대한 퍼가기 전에 HUVEC와 하루 구슬 장식하기 전에 EGM - 2 (Clonetics) 하루 매체를 전환합니다. </li><li> ~ 400 HUVEC 당 비드의 농도가 필요합니다. </li><li> 물론 당 20,000 섬유아 세포이 필요합니다. </li></ol> HUVEC있는 비즈 코팅 - DAY -1 <ol><li> HUVEC을 Trypsinize. </li><li> (원심 분리기하지 마십시오!) 정착 구슬을 허용합니다. 뜨는을 대기음 따뜻한 EGM - 2 배지 1 ML에 간단히 비즈 씻으십시오. </li><li> 외과 튜브에 따뜻한 EGM - 2 배지의 1.5 ML에 혼합 2,500 구슬 w / 1X10 6 HUVEC. 인큐베이터에 수직으로 그것을 놓으십시오. (필요한 경우 ~ 10 우물가. 최대 규모 이것만으로도 충분하다) </li><li> 관 매 20 분 흔들어, 37 ° C에서 4 시간 동안은 부화. (좋은 코팅 돋아 중요합니다.) </li><li> 사시간 후, EGM - 2의 5mL의 T25 플라스크에 코팅 구슬을 전송 및 O / N.를 떠나 </li></ol> DAY 0 - 섬유소 젤 IN 코팅 구슬을 포함 <ol><li> 2.0 MG / ML 피브리노겐 솔루션 (조리법 섹션을 참조하십시오) 준비합니다. </li><li> 피브리노겐 솔루션 0.15 단위 / aprotinin의 ML을 추가합니다. </li><li> 15mL 원뿔 관에 코팅 구슬을 전송하고 구슬 좀 쉬라 구. EGM - 2의 1mL와 1.5mL 원심 튜브로 전송에 Resuspend 구슬. </li><li> 천천히 위아래 pipeting하여 EGM - 2의 1mL와 배 비즈 씻으십시오. </li><li> coverslip에 구슬을 카운트하고 ~ 500 구슬 / ML의 농도에서 피브리노겐 용액에 resuspend. </li><li> 각 잘하는 0.625 단위 / 트롬빈의 ML을 추가합니다. </li><li> 24 - 잘 접시의 각각 잘 수있는 피브리노겐 / 비드 정지의 0.5 ML를 추가합니다. 각 잘 대해 피펫 팁을 변경합니다! </li><li> 피펫 팁로 가볍게 ~ 4-5 번 아래로 가서 의해 트롬빈과 섬유소를 섞는다. 큰 거품을하지 않도록주의하십시오. </li><li> 후드 5 분 접시를 남겨, 다음 응고를 생성하기 위해 10-15 분 37 ° C - 배양기에 놓으십시오. </li><li> 응고를 기다리는 동안, 섬유아 세포를 trypsinize. </li><li> 1 EGM - 2의 ML 당 잘 현명한 드롭을 추가합니다. </li><li> 물론 당 20,000 세포의 농도에서 섬유소 젤 위에 시드 섬유아 세포. </li></ol> 참고 : 일반적으로 섬유소 젤이 형성되면, 당신은 겔에 작은 거품을 볼 수 있습니다. 걱정하지 마세요, 그들은 3-4 일 내에 사라집니다. 다른 모든 일 즉, 일 2, 4, 6, 등 미디어를 변경 ... 3 일 또는 4에 의해 당신이 돋아보고 시작합니다.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

시험 관내 angiogenesis의 assays에서 (3D) 입체은 2D 문화를 사용하여 얻을 수있는 것보다 생체내의 실제 환경에 훨씬 가까운 모델을 제공 강력히 주장하고있다. 그것은 우수한 3D 시스템은 재현성 수 있으며, angiogenesis의 주요 단계의 몇몇을 모방 수있을 것이 분명합니다. 몇 가지 이전 3D assays가 개발되었습니다 있지만, 이러한 많은도 microvascular 세포를 얻기 위해 열심히 사용, 아니면 단계의 일부를 요점을 되풀이하다. 이 비디오에서는, 우리는 설명하고 혈관 연구에 쉽게 얻을 수 있고 가장 일반적으로 사용되는 EC 인간의 배꼽 정맥 EC를 이용 체외의 angiogenesis 분석의 최적화를 수행합니다. 분석은, 며칠의 과정을 통해, 지속적으로 편광 EC 둘러싸인 명확 특허 세포 루멘 긴 선박을 재현. 선박의 EC 분기와 퓨전 (문합)의 나중 단계도 관찰됩니다. 중요한 것은,이 문화의 HUVEC이 돋아, 마이 그 레이션, 정렬, 확산, 튜브 형성, 분기 및 문합 포함하여 생체내이나 체외에서 중, microvascular...

<table><tbody><tr><td>Cytodex-3 Beads</td><td>시약</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/bottle. 1. 건조된 비드 0.5 g을 50 mL PBS (pH = 7.4)에 넣고 RT에서 최소 3시간 동안 수화 및 팽윤시킨다. 50 mL 튜브를 사용하여 로커(rocker) 위에 놓는다. 2. 비드가 가라앉을 때까지 기다린다 (~ 15 min). 상층액을 제거하고 신선한 PBS (50 mL)로 비드를 몇 분간 세척한다. 3. PBS를 제거하고 다음의 신선한 PBS로 교체한다: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 beads/mL 또는 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 beads/ mL. 4. 비드 현탁액을 실리콘 처리된 유리병(Windshield Wiper 또는 Sigmacote)에 넣는다. 5. 115&amp;#x00B0;C에서 15분 동안 오토클레이브하여 비드를 멸균한다. 6. 4&amp;#x00B0;C에 보관한다.</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/bottle. 동결건조된 aprotinin을 증류수(DI water)에 4 U/mL 농도로 재구성한다. 멸균 필터링을 수행한다. 1 mL씩 소분한다. -20 &amp;deg;C에 보관한다.</td></tr><tr><td>Fibrinogen Type I</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. fibrinogen 2 mg/mL를 DPBS에 용해한다. 응고 가능 단백질 %를 확인하고 그에 따라 조정한다. 37 &amp;#x00B0;C 항온수조에서 가열하여 fibrinogen을 용해시킨다. 튜브를 뒤집어 혼합한다. 볼텍싱(vortex)하지 않는다. 0.22 um 필터로 멸균 필터링한다.</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1,000 units. 멸균수에 50 U/mL 농도로 재구성한다. 0.5 mL씩 소분한다. -20 &amp;deg;C에 보관한다.</td></tr></tbody></table>

angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis는 angiogenic 자극에 대응, 새로운 선박은 기존 vasculature에서 만들어지는 복잡한 다단계 프로세스입니다. 이러한 단계는 다음과 같습니다 세포외 기질, 코드로 EC의 정렬에 내피 세포의 지하 막, 증식 및 마이 그 레이션 (돋아) (EC)의 저하, 분기, 루멘 형성, 문합, 새로운 지하 막 형성합니다. 시험 관내 assays의 많은이 과정을 연구하기 위해 개발하지만, 대부분의 전용 angiogenesis의 특정 단계를 모방하고, morphologically assays 내에 혈관이 자주 생체내에서 선박과 유사하지되었습니다. Nehls 및 Drenckhahn로 이전 작업을 바탕으로, 우리는 인간 제대 정맥 EC와 섬유아 세포를 이용 체외의 angiogenesis 분석에 최적화했습니다. 이 모델 recapitulates는 angiogenesis의 핵심 초기 단계의 모든하고, 중요한 혈관 편광 EC 둘러싸인 세포 특허 루멘을 표시합니다. EC는 cytodex의 microcarriers에 코팅 및 섬유소 젤에 포함됩니다. 섬유아 세포들은 EC의 구슬의 표면에서 돋아 촉진 필요한 가용성 요소를 제공하는 젤 위에 계층입니다. 며칠 후, 수많은 혈관은 쉽게 위상 대조 및 시간 경과 현미경 하에서 관찰 수있는 선물입니다. 이 동영상이 문화를 설정의 주요 단계를 보여줍니다.

이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 - angiogenesis의 주요 기능은 - 표시됩니다.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

혈관신생은 혈관신생 자극에 반응하여 기존의 혈관계로부터 새로운 혈관이 생성되는 복잡한 다단계 과정입니다. 이러한...

안녕하세요, 제 이름은 Mar Katsu입니다. 저는 UC Irvine 분자생물학 및 생화학과의 Hughes Lab 소속입니다. 제가 fibrin bead assay를 수행하도록 하겠습니다.전체 과정은 완료까지 이틀이 소요됩니다. 첫째 날에는 비드에 pubic 세포 또는 human umbilical vein endothelial cells를 코팅합니다. 둘째 날에는 이렇게 코팅된 비드를 fibrin gels에 매립한 후, 이 겔 위에 fibroblasts를 층별로 배치합니다.우리는 in vitro 환경에서 혈관 신생의 여러 단계를 연구하기 위해 이 분석법을 사용합니다. 첫째 날인 1부에서는 CY X three Bead를 사용합니다. 그리고 둘째 날에는 fibrinogen, thrombin, aprotinin cytx의 세 가지 시약을 사용합니다.세 번째 비드는 Amazon Biosciences 제품이며, 혈관 내피 세포가 비드에 부착될 수 있도록 특히 콜라겐으로 코팅되어 있습니다. 다음 시약은 sigma에서 구입한 fibrinogen입니다. 이것은 비드 어세이에서 실제 겔 또는 혈전(clot)을 형성합니다.트롬빈은 응고 인자입니다. 이 단백질은 피브리노겐을 피브린으로 전환하므로, 이를 분석법에 첨가합니다. 아프로티닌은 혈청 프로테아제 억제제입니다.단백질 분해 효소가 피브린 겔을 분해하는 것을 방지하기 위해 이것을 사용합니다. 여기 보이는 것은 vac입니다. 이것들이 비드 분석에 사용하는 세포들입니다.이 특정 세포들은 passage 3 단계의 세포들입니다. 보통 passage 2에서 passage 3 사이의 세포들을 사용합니다. 보시다시피 이 세포들은 뚜렷한 cobblestone 형태를 띠고 있습니다.이 시점에서 이 세포들은 100% 합류도(confluency)에 도달한 것으로 보이며, 이 합류도 상태에서 세포를 사용해야 합니다. 이것이 beat 2 분석의 1일 차 과정이며, 수행 방법은 다음과 같습니다. 기본적으로, 이와 같이 튜브를 여러 번 뒤집어 비즈를 현탁시키면 되며, 4시간 동안 20분마다 이 작업을 반복합니다.이것으로 거의 다 끝났습니다. 자, 오늘은 A b 분석의 둘째 날이며, 이 비드들은 방금 내피세포로 코팅되었습니다. 여기서 보시는 것은 기본적으로 코팅되지 않은 비드와 코팅된 비드 사이의 차이를 강조하여 보여주는 것입니다.왼쪽은 분명히 코팅되지 않은 비드입니다. 비드 표면의 돌기를 통해 알 수 있

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Research

연구

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Biology

생물학

이 동영상은 혈관신생 초기 단계에서 내피 발아를 연구하기 위해 주피세포를 통합한 변형된 마이크로캐리어 비드 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 혈관 신생의 분자 메커니즘과 항 혈관 유전 치료의 효과를 이해하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

초기 단계 혈관 형성 평가를 위한 비드 발아 분석: 주피세포가 있는 곳에서 발아하는 내피를 연구하기 위한 체외 비드 기반 모델

시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

국소 혈관 신생을 자극하는 장기 특이적 미세환경의 재현은 손상된 조직의 성공적인 재생을 위해 필수적입니다. 이 보고서는 폐 특이적 미세환경이 성체 쥐의 혈관 신생과 폐포 재생을 조절하는 방법을 탐구하기 위해 살아있는 쥐의 폐 표면에 피브린 젤을 이식하는 새로운 방법을 보여줍니다.

마우스 폐에 섬유소 젤의 주입은 폐 관련 신생 혈관 연구에

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.

증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.

혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay

피브린 하이드로겔과 함께 기계적으로 분리된 기질 혈관 분획(SVF)은 조직 공학 및/또는 상처 치유 목적을 포함한 다양한 적응증에 대해 생존 가능한 지방 유래 기질 세포를 위한 쉽고 효율적인 운반체를 제공합니다. 여기에서는 중개 연구 및 임상 응용을 위한 기계적 SVF(mSVF)-피브린 하이드로겔 구조체의 준비를 제시합니다.

기계적으로 분리된 Stromal Vascular Fraction과 Fibrin Hydrogel의 조합: 처리 프로토콜

여기에서는 Sipunculus nudus의 섬유소 용해제를 신속하게 분리하고 표시하기 위한 피브리노겐-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 프로토콜을 제시합니다.

Fibrinogen-Polyacrylamide Gel Electrophoresis를 통한 Sipunculus nudus 의 활성 Fibrinogenolytic Agents의 신속한 분리 및 표시

배우세요 섬유소 젤 비드 분석을 통해 혈관신생의 발아, 루멘 형성, 가지화 및 문합을 시각화하는 방법을. 이 체외 분석법은 혈관생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

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