버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

이 프로토콜은 단백질 발현을 조절할 수 있는 조절 가능한 프로모터를 사용합니다. 이 실험에서는 메티오닌 억제성 프로모터에서 N 2 도메인을 발현하는 고복제 2미크론 플라스미드를 사용합니다. 야생형 효모 세포는 이것으로 형질전환됩니다.

플라스미드 및 형질전환체는 uol이 결여된 플레이트에서 선택된다. 하룻밤 사이에 자란 후. 선택적 배지에서 세포는 코르티솔 매개 성장에 의해 동기화됩니다. 체포.

마지막으로, 시간 경과 실험 동안 메티오닌이 결핍된 배지로 세포를 전달함으로써 발현이 유도됩니다. 단백질 농도는 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 모니터링되고 현미경에 의한 형태학적 표현형 발달에 의해 모니터링됩니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 생명과학과의 클라우디아입니다.

나는 알라르의 드 바리 무지(de Bari Muji)이고 나는 AL 실험실에 있다. 오늘 우리는 체내 단백질 농도의 함수로서 형태학적 표현형의 발달을 분석하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 2가 없는 내세포 적응 단백질의 N 2 영역의 과발현에서 관찰되는 세포 분열 표현형의 형태학적 및 분자적 측면을 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 프로토콜은 관심 단백질을 발현하는 효모 균주를 구성하는 것으로 시작합니다. 우리의 경우, 우리는 야생형 효모 균주 W3 0 3을 메티오닌 억제성 프로모터 2 밀리몰 메티오닌 억제의 제어 하에 n번째 2를 포함하는 고복제 플라즈마 DNA로 변형시켰다.

메티오닌이 결핍된 배지는 최대 발현을 허용하지만, 최근에 형질전환된 세포가 포함된 플레이트에서 6개의 콜로니를 선택하고 원뿔형 플라스크에 0.2밀리몰의 메티오닌을 50ml의 선택적 배지에 접종하고 다음 날 아침 200RPM으로 진탕한 후 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 600나노미터에서 배양물의 광학 밀도를 측정하여 세포 밀도를 추정합니다. 20 OD 600 나노미터/밀리리터의 세포에 해당하는 것을 멸균 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리로 수확합니다.

DMSO에서 밀리리터당 1밀리그램의 스톡에서 밀리리터당 15마이크로그램의 최종 농도로 세포 주기를 동기화하기 위해 볼텍싱을 통해 YPD 배지에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 섭씨 30도에서 200RPM으로 흔들면서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 유사분열에서 정지된 세포의 비율을 확인합니다.

현미경으로 보고 같은 크기의 새싹을 가진 세포의 수를 세어 다음 단계로 진행합니다. 정지가 90% 이상인 경우에만 5분 동안 2200RPM에서 원심분리로 세포를 수확합니다. 얼음처럼 차가운 물로 3회 세척한 후, 리서스, 약 0.5 OD 600 밀리리터 나노미터의 세포 밀도에서 메티오닌이 결핍된 선택적 매체에 펠릿을 현탁시킵니다.

세포 부피의 절반을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 메티오닌을 최종 농도인 0.2 millimolar로 첨가합니다. 이것은 단백질 발현의 기초 수준으로 인한 효과를 제어하는 역할을 합니다. 두 배양물을 모두 섭씨 30도의 인큐베이터로 되돌립니다.

세포는 매시간 6시간 동안 표현형 발달을 위해 분석됩니다. 각 배양액의 세포 현탁액 1ml를 멸균 마이크로 fuge 튜브로 포인트 이동하고 원심분리로 세포를 수확하고 상층액을 흡인하고 펠릿을 70마이크로리터의 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 멸균수에 1밀리리터당 1밀리그램의 육수에서 30마이크로리터의 메틸렌 블루를 추가합니다.

다음으로, 이 현탁액 약 6마이크로리터를 깨끗한 유리 슬라이드에 피펫으로 넣고 드롭 위에 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립을 부드럽게 눌러 유리 계면 사이에 얇고 균일한 세포 층을 형성합니다. 커버 슬립을 9개의 사분면으로 나누고 사분면당 3개의 이미지를 촬영합니다.

필드당 셀 수는 정확한 정량화가 가능하도록 30개 셀을 넘지 않아야 합니다. 연구 중인 표현형을 보여주는 세포의 수를 세어보며, 이 예에서는 서로 분리되지 않는 길쭉한 새싹 및/또는 연결된 새싹이 있는 싹이 싹트는 효모 세포입니다. 우리는 또한 n번째에 유도된 세포 분열 결함 이후 파란색으로 식별되는 죽은 세포의 수를 계산합니다.

두 번의 과발현은 세포 사멸로 이어져 항상 표현형 특이적 결함을 시각화합니다. 멸균 마이크로 퍼지 튜브에서 1ml의 배양액을 포인트 분취하고 원심분리 reus로 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 100 마이크로리터, 밀리리터당 1밀리그램, 열량 백색 용액에 멸균수에 현탁시키고 어두운 곳에서 실온에서 5분 동안 배양합니다.

석회백색으로 염색하면 e 세포벽을 시각화할 수 있습니다. 하나의 XPBS로 펠릿을 세 번 세척합니다. 최종 펠릿을 100마이크로리터의 PBS에 현탁합니다.

현미경으로 세포를 관찰하고 세포벽을 시각화하기 위해 UV 광학 장치를 사용하여 100배 배율로 이미지를 획득합니다. FS E 필터를 사용하여 GFP 태그가 지정된 셉틴 획득 이미지를 시각화하기 위해 커버 슬립을 9개의 사분면으로 나누고 타임랩스 비디오를 계산하기 위해 사분면당 3개의 이미지를 촬영하여 앞서 보여준 방법을 사용하여 세포벽 결함 및 셉틴 불일치 국소화가 있는 세포의 비율을 정량화합니다. 단일 효모 세포의 현미경 검사에는 아그로스 베드를 만들기 위해 배지가 내장된 아그로스 베드가 필요합니다.

먼저 오목한 움푹 들어간 부분이 있는 유리 슬라이드를 70% 알코올로 청소하고 슬라이드가 자연 건조되는 동안 자연 건조시킵니다. 메티오닌이 결핍된 5ml의 선택적 배지에 0.06g의 아그로스를 넣고 전자레인지에 넣어 아그로스가 완전히 빨리 용해될 때까지 끓입니다. 슬라이드에 매체를 포함하는 200마이크로리터의 아그로스를 피펫팅합니다.

움푹 들어간 곳과 뒤집힌 다른 깨끗한 유리잔 위로 미끄러져 아래에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 젤이 응고되면 상단의 슬라이드를 함몰 슬라이드에서 부드럽게 멀리 이동하여 표면을 항상 평행하게 유지하십시오. 이것은 아그로스 베드의 표면이 함몰 슬라이드의 표면과 같은 높이가 되도록 합니다.

섬세한 티슈로 아그로스 침대를 둘러싼 슬라이드 부분을 청소합니다. 이제 슬라이드를 4시간에 걸쳐 사용할 준비가 되었습니다. 배양액에서 1ml의 세포를 멸균 마이크로 fuge 튜브로 옮기고 원심분리로 수확합니다.

상층액을 흡인하고 메티오닌이 결핍된 100마이크로리터의 새로운 선택적 배지에 세포를 재현탁합니다. 커버 슬립의 가장자리에 바셀린을 바르십시오. 그런 다음 아그로스 베드 중앙에 세포 현탁액 한 방울을 놓고 그 위에 커버 슬립을 부드럽게 눌러 균일하게 펴 바릅니다.

커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 가장자리에 매니큐어를 바르면 위치를 고정합니다. 매니큐어가 마르면 슬라이드를 가열된 현미경 무대에 놓습니다. Zeiss Axio camm, MRM 흑백 디지털 카메라가 장착된 Zeiss Axio 200 M 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 필드가 붐비기 때문에 적절한 간격으로 10개 이하의 셀을 포함하는 필드를 선택합니다.

세포가 분열할 때 약 5시간 동안 5분마다 자기장의 이미지를 촬영합니다. 초점을 반복적으로 재조정하지 않으려면. 이미지 획득 소프트웨어를 프로그래밍하여 매 시점에서 몇 개의 Zack 이미지를 자동으로 획득합니다.

최상의 초점을 가진 이미지는 세포에 대한 적절한 열을 보장하기 위해 필름을 조립하기 위해 나중에 선택되며, 이미징 표현형 회귀의 전체 기간 동안 현미경의 투과 백색광을 켜 두어 제공되는 가열 단계 외에 외부 열원은 Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 필름으로 조립하여 연구할 수 있습니다. 여기에서 우리는 관심 단백질을 과발현하는 대표적인 결과를 보여줍니다. N번째 둘.

첫째, n번째 2의 단백질 발현입니다. 실험 과정 동안, HA nth를 발현하는 세포로부터의 용해물을 0.2 밀리몰 메티오닌의 존재 하에서 성장한 면역 블롯 세포가 최소한의 단백질 발현을 갖는 것과 같이 단클론 항 HA 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 그러나 메티오닌이 결핍된 배지에서 성장한 세포는 실험 과정에서 S 2의 농도가 지속적으로 상승하는 것을 보여줍니다.

다음으로, 6시간 동안 메티오닌의 존재 또는 부재 하에서 성장한 세포를 분석하였는데, 이는 낮은 n번째 2 농도는 세포 분열 표현형 또는 세포 사멸만을 유도할 수 없기 때문이다. 메틸렌 블루(methylene blue)로 염색한 후 파란색으로 표시된 것처럼 죽은 세포의 비율이 낮습니다. 마찬가지로, 세포당 핵의 수, 세포벽 및 셉틴 조직은 예상대로 정상입니다.

대조적으로, M 2의 발현은 메틸렌 블루로 염색될 때 파란색을 유지하는 연결된 길쭉한 새싹의 긴 사슬에 의해 입증된 바와 같이 대규모 세포 분열 결함 및 세포 사멸로 이어집니다. 대부분의 표현형 세포는 DPI 염색으로 표시된 바와 같이 다핵 형성되어 있습니다. Calcior white staining은 비정상적인 세포벽 패치의 축적을 나타냅니다.

또한, 셉틴은 심하게 잘못 국소화되고 무질서합니다. 시간 함수로서의 표현형 정량화는 이 그래프에 표시되며, 열린 원은 0 밀리몰 메티오닌을 나타내고 닫힌 원은 0.2 밀리몰 메티오닌을 나타냅니다. 여기서 우리는 시간이 지남에 따라 세포에 n번째 2 농도가 쌓임에 따라 세포 분열 표현형을 나타내는 세포의 비율도 증가한다는 것을 알 수 있습니다.

0.2에서 성장한 대조 세포. 밀리 메티오닌은 표현형 발달이 세포 배양 조건 때문이 아니라 단백질 농도 증가의 함수임을 보여줍니다. 마지막으로, n번째 두 과발현에 대한 표현형 발달은 타임 랩스 비디오 현미경에 의해 캡처됩니다.

n번째 4시간 후, 2개의 과발현 세포는 가벼운 형태학적 세포 분열 표현형을 보입니다. 영화가 진행됨에 따라 정점 새싹이 비정상적으로 연장되어 매우 길쭉한 새싹이 자라는 것을 볼 수 있습니다. 우리는 또한 세포 분리 사건이 일어나기 전에 새로운 새싹이 출현하는 사건을 봅니다.

또한, 새싹은 어머니 세포의 여러 영역에서 나와 가지를 일으키는 것이 관찰됩니다. 우리는 방금 신진 목록에서 단백질 농도의 함수로 형태학적 표현형의 발달을 특성화하고 분석하는 방법을 보여주었습니다. 이 절차를 수행하면 더 빠른 속도가 세포를 손상시킬 수 있으므로 권장 원심분리 속도로 세포를 쓰다듬는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

메틸렌 블루와 클로라이드는 동쪽 세포를 밝히는 데 독성이 있으므로 이미징 직전에 추가하는 것을 기억하는 것도 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.