Name: 버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 조절 가능한 프로모터를 이용한 단백질 농도 의존적 형태학 표현형 분석 방법. 이 기법은 세포주기 동기화와 현미경 관찰을 통해 단백질 기능 연구에 필수적인 통제된 발현 시스템을 제공합니다.

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우리는 도움이 토론과 지원을위한 브라이언 G. 쿤과 클라우디아 B. 한나 감사합니다. 이 프로젝트는 데프에서 자금 업을 시작하여 지원했다. 생물 과학, R. 클라우디오 아길라르와 퍼듀 암 센터를 통해 R. 클라우디오 아길라르에 미국 암 학회 기관 연구 부여 퍼듀 대학.

A.의 세포 배양 및 단백질 유도 이 섹션은 효모 세포에서 regulatable 발기인의 단백질 표현의 유도로 다음 세포 배양 조건, Nocodazole와 세포주기 동기화를 설명합니다. <ol><li> 야생 유형 효모 스트레인 W303 (leu2 - 3, 112 trp1 - 1 can1 - 100 ura3 - 1 ade2 - 1 his3 - 11, 15)은 통제하에 관심을 우리의 유전자 (ENTH2)이 포함되어 높은 사본 (2μ) 플라스미드 DNA로 변환됩니다 메티오닌 - repressible 발기인 (MET25)의. 메티오닌 부족한 미디어 최대한의 표현을 허용하면서 메티오닌 2mM는 모터의 활동을 억제하기 위해 충분하다. 따라서, 메티오닌 농도의 범위가 원하는 수준에서 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. W303 세포에 플라스미드 DNA의 1 변환은 표준 절차에 따라 LiAc - TE 방법을 사용하여 이루어집니다 2. 참고 :이 실험에만 배경 수준의 단백질 발현을 위해 메티오닌 2mM 앞에서 밤새 세포를 성장에 의해 수행되어야합니다. 다음 날 아침은 단백질 표현식은 메티오닌 즉시 다음과 같은 세포주기 동기화 (약 4h) 부족 미디어 세포를 resuspending에 의해 유도해야합니다. 그러나, 우리는 모든 발현의 분석을위한 시간 코스를 만드는 ENTH2 의존 세포 분열의 표현형가 (일반적으로 단백질 유도 3 4 - 6h 후) ENTH2 상당한 농도가 세포에 지어진 후에야 유도 것으로 나타났습니다 매우 긴 표현형 (적어도 16h). 우리는 메티오닌 0.2mM 앞에서 밤새 세포를 성장하면 형태학의 표현형을 represses하지만 부족한 메티오닌 미디어로 전송하면 빠르게 표현형 - 유도 수준을 증가시킬 수있는 임계 단백질 농도를 허용 것으로 나타났습니다. 이것은 시간의 비교적 짧은 기간 동안 세포 분열의 심각한 결함의 발현의 상세한 분석을 수 있습니다. 우리는 그러므로 실험자가 건별로 표현형 유도를위한 하위 임계값있는 메티오닌 농도를 결정하는 것이 좋습니다. </li><li> 표준 무균 기술을 사용하여 소독 원뿔형 플라스크에 메티오닌 0.2mM과 선택적 미디어 50 ML 최근 변형 세포와 예방을 포함하는 접시 6 식민지를 선택하십시오. 30 밤새 품어 ° 200 rpm으로 흔들어로 C. (표준 효모 문화 조건에 대한 자세한 내용은 심판을 참조하십시오. 4) </li><li> 600nm에서 문화의 광학 밀도를 측정하여 다음 날 아침, 견적 세포 밀도. 상온에서 5 분을 위해 2200 RPM의 회전에 의해 멸균 원심 분리기 튜브 및 수확에 세포의 20 OD 600nm에 동등한를 전송합니다. </li><li> 에 Resuspend 세포는 0.4 OD 600nm / ML의 농도에 YPD과 DMSO의 1mg/ml의 혈통의 15μg/ml의 최종 농도 Nocodazole를 추가합니다. 200rpm에서 잡고 30 ° C에서 4h을위한 부화. 참고 : 알파 팩터를 사용하여 G0 단계 또는 hydroxyurea를 사용하여 G1 - S 단계에서 체포를 포함한 대체 체포 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 Nocodazole를 사용하여 유사 분열에 체포 단순하고 우리의 목적을 위해 충분한 효과적인 것으로 나타났습니다. </li><li> 4h 후, 현미경으로 확인하여 동일한 크기의 꽃봉오리와 함께 세포의 수를 계산하여 유사 분열에 체포 세포의 비율을 확인합니다. 체포 이상 90 %면, 다음 단계로 진행합니다. mitotic 연금의 원하는 비율이 달성될 때까지 그렇지 않으면, Nocodazole의 세포를 유지합니다. </li><li> 2,200 RPM에 대한 5 분 얼음 냉수로 세 번 씻어에서 원심 분리하여 세포를 수확. 최종 세척 후 ~ 0.5 OD 600nm / ML의 세포 밀도에서 메티오닌을 선택 부족한 매체의 펠렛을 resuspend. 새로운 멸균 튜브에 세포의 절반 볼륨을 전송하고 최종 0.2mM 농도 메티오닌 추가할 수 있습니다. 이것은 단백질 표현의 기초 단계에 따라 효과를 제어하는​​ 역할을합니다. 이것은 (시간 = 오) 실험 시간 포인트를 먼저 표시합니다. 6h에 대한 세포 매 시간마다를 분석합니다. </li></ol> 표현형 개발 B. 분석 참고 : 아래에서 설명하는 모든 분석 방법이 동시에 수행될 필요가 없습니다. 서쪽은 모래 바닥으로 단백질 표현 수준의 결정 <ol><li> 모든 시간 시점에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 문화와 수확 세포 2 OD 600nm 등가물의 OD 600nm를 측정합니다. </li><li> 1ml 멸균 물의 펠렛을 Resuspend하고 1.5ml eppendorf 튜브에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 펠렛을 얻기 위해 원심 분리를 반복합니다. 뜨는을 대기음. </li><li> 50μl SDS - PAGE laemmli 샘플 버퍼 (50mM 트리스 산도 6.8, 2퍼센트 SDS, 10 % 글리세롤, 2퍼센트 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.006 % bromophenol 파란색)의 펠렛을 Resuspend. 산성 - 세탁 유리 비즈 (0.2-0.4 미크론의 직경) 1 분 소용돌이 50μl를 추가합니다. </li><li> 95 ° C 열 blo에 보일 튜브2 분에 대한 CK 30 초에 다시 소용돌이로 5 분 위해 끓는 이력서. -20 ° C.에서 단백질 샘플을 프리즈 </li><li> nitrocellulose 막에 12% SDS - PAGE 젤, 전송에 대한 단백질 샘플을 실행하고 서양 관심의 단백질을 감지하기 위해 적절한 항체와 모래 바닥 수행합니다. 이 예제에서, 우리는 블로토 영화사 - 트윈에서 1:2000 희석 (1XPBS 5 %가 아닌 지방 건조 우유에서 마우스 반대 HA 항체 (Covance, 프린스턴, 뉴저지)과 잠복기에 의해 ENTH 도메인 태그 haemagglutinin (HA)의 존재를 프로브 , 0.1 % 트윈). HRP는 또한 블로토 영화사 - 트윈에서 1:2500의 희석에 염소 방지 마우스 차 항체 (피어스)를 태그로 실온에서 1 시간을위한 멤브레인에 기본 항체를 바인딩할 수 있습니다. Supersignal 웨스트 피코 Chemiluminescent 기판은 HRP 태그 방지 마우스 항체를 감지하는 데 사용됩니다. </li><li> densitometry로 단백질 발현 수준을 계량. </li></ol> 이 섹션에서는 증가 단백질 농도의 함수로 추적 표현형 개발의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 셀 인구, 기반하는 동안 단일 세포 수준에서 두 번째 연구 해. 셀 - 분할 표현형 및 세포 사망의 부량 <ol><li> 각 시간 시점에서 5 분 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 기술과 수확 세포를 사용하여 살균 eppendorf 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전송할 수 있습니다. </li><li> 뜨는을 기음과 멸균 물 속에 1mg/ml의 주식에서 파란색 30μl 메틸렌 다음 70μl 미디어 펠렛을 resuspend. 메틸렌 블루가 그걸 싫어해요, 그래서 죽은 세포 their 파란색으로 식별 수 cytosol of the 줄이는 환경에서 무색이되는 파란색 중요한 염색이지. </li><li> 피펫 ~ 깨끗한 유리 슬라이드에이 중지 6μl하고 드롭을 통해 coverslip을 넣으십시오. 유리 인터페이스 사이 세포의 얇은, 균일한 층을 형성 부드럽게 coverslip을 누르십시오. </li><li> 9 quadrants로 coverslip을 분할하여 같은 그림에 표시된 사분 당 3 이미지를 가져가라. 2. 세포 / 필드의 숫자는 정확 부량 수 있도록 30 세포보다 더 클 수 없습니다. 공기 방울이 준비를 손상하기 전에 각 coverslip 약 15 분에 대한 몇 군데 있습니다. </li><li> 연구에서 표현형을 보여주는 세포의 수를 계산합니다. ENTH2 overexpression에 유도된 세포 분열 결함은 세포 사망에 이르게하며 따라서, 우리는 또한 파란색으로 식별 죽은 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> phenotypic 세포의 비율을 계산합니다. </li><li> 로 그림에 표시된 데이터를 플롯. 3. </li></ol> 형광 현미경을 사용하여 표현형 특정 결함의 시각화 로 ENTH2 overexpression시 본 세포 분열에 결함이 세포는, 종종 세포 벽에 결함 septin mislocalization3 (GFP - 퓨전 단백질로서 시각)에 의해 특징입니다. 신진 효모의 세포 벽 쉽게 효모 세포 벽에 키틴을 irreversibly 바인딩 Calcofluor 화이트 (CfW)와 얼룩에 의해 시각하실 수 있습니다. <ol><li> 상온에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 eppendorf 튜브 및 수확 세포의 문화 때마다 포인트, 나누어지는의 1ml에. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 5 분에 대한 살균 물, 부화에 1mg/ml CfW 솔루션 100μl의 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 원심 분리 및 1X PBS로 3 번 세척하여 수확 세포. </li><li> 100X 확대에 100μl 1X PBS의 펠렛 및 자외선 광을 사용하여 현미경 이미지 (세포 벽)와 FITC 필터 (GFP - septin)를 Resuspend. </li><li> 섹션 B.2.1에서 다음 단계를 4-6으로 세포 벽의 결함과 septin mislocalization와 함께 세포의 비율을 계량 </li></ol> B.3. 단일 세포 수준에서 표현형 개발의 결정 : 시간 ​​저속 비디오 현미경. <ol><li> 70 % 알코올로 오목 우울증이있는 유리 슬라이드를 깨끗하고 건조한 공기 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 해소 때까지 전자 레인지에 살균 유리관에서 메티오닌이 부족 5ml 선택 미디어 0.06g 아가로 오스를 끓여. </li><li> 아가로 오스의 신속 피펫 200μl의 슬라이드 우울증 미디어가 포함된 기포가가 아래 갇힌되지 않도록해야 할, 그 위에 또 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 반전. </li><li> 젤 굳은 때, 항상 평행들의 표면을 유지, 부드럽게 멀리 우울증 슬라이드의 상단에 슬라이드를 이동합니다. 이것은 아가로 오스 침대의 표면은 우울증 슬라이드의 표면을 잔뜩 것을 보장합니다. 섬세한 조직으로 아가로 오스 침대를 둘러싼 슬라이드 지역을 청소하십시오. 슬라이드는 이제 사용할 수 있습니다. </li><li> 당시 = 4 시간, 상온에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 eppendorf 튜브와 수확의 문화 세포의 전송 1ml. 참고 :이 나중에이 시간 연결되는 표현형 개발이 보장되도록 단백질 표현의 높은 수준을 보장하기 위해 선택할 수 권장합니다. 파일럿 실험 determin하는 데 필요한건별로 전자 유도 시간을. </li><li> 메티오닌 부족한 신선한 선택적 매체의 100μl에 뜨는 및 resuspend 세포를 대기음. </li><li> coverslip의 가장자리에 바셀린을 적용합니다. 다음 아가로 오스 침대의 중앙에 세포 현탁액의 드롭을 배치하고 부드럽게 그들을 통해 coverslip을 눌러 균일하게 확산. </li><li> 석유 젤리로 coverslip의 가장자리를 밀봉하고 매니큐어로 가장자리를 안감하여 위치를 수정. 매니큐어 증발 때까지 기다리십시오. </li><li> 현미경의 열띤 무대에서 슬라이드를 삽입하고 적절하게 간격 10 개 이상 세포를 포함하는 필드를 선택합니다. 세포 분열 때, 필드는 시간이 지남에 붐비는 얻을 것이다. </li><li> 필드의 이미지 ~ 5 시간 동안 5 분마다 가져가라. 표현형의 진행은 ImageJ 소프트웨어 (사용하는 동영상으로 이미지를 조립하여 연구 수 <a name="cite">Rasband, WAS, ImageJ, 건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 년 미국 국립 연구소를 -2005</a> ) </li></ol> 참고 : 우리는 자이스 혈구 Axiovert 200M 현미경을 사용하여 자이스 혈구 Axiocam MRM 디지털 카메라와 라이브 셀 이미징에 대한 칼 자이스 혈구 Axiovision 이미지 수집 소프트웨어 (버전 4.4) 단색. 온도 제어는 PeCon Tempcontrol 37 장치에 의해 30 ° C로 유지 열띤 무대에서 슬라이드를 삽입하여 이루어진다. 방지하기 위해 반복적으로 초점을 다시 조정, 자동으로 모든 시간 지점에서 몇 Z - 스택 이미지를 획득하고 영화를 조립하면 나중에 최고의 중점을두고 이미지를 선택할 수있는 이미지 수집 소프트웨어를 프로그램에 편리합니다. 일부 이미지 수집 소프트웨어는 시간 코스 실험 오토포커스의 옵션이 있습니다. 그것은 가능한 경우에 옵션을 사용하시면 편리합니다. 와일드 타입 효모 세포는 30에서 최고의 성장 ° C 따라서 온도 제어가 중요합니다. 적절한 열을 보장하기 위해서는 가열 단계 이외에 열을 외부 소스를 제공하는 도움이됩니다. 예를 들어, 우리는 이미지의 전체 기간 동안에 현미경의 전송 하얀 빛을 두십시오. 또한 아가로 오스의 침대와 세포 샌드위치를 ​​준비할 때 공기 방울을 피하기 위해 중요합니다. 거품 안에 갇힌 공기는 시간이 지남에 따라 가열하면 팽창 필드가 몇 군데되지 않도록 멀리 세포를 밀어 경향이 있습니다. 필드 내의 각 세포 위치를 확인하는 것도 중요 것은 특히 다시 초점을 시도하는 동안, 이미징 프로세스의 기간 동안 appreciably 변경하지 마십시오. 영화가 조립 후 ImageJ는 셀 위치에 작은 교대를 해결할 수 있도록 이미지 안정화 플러그인을 사용할 수 있습니다. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / 코드 / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol><li>Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22High+efficiency+transformation+with+lithium+acetate+in+Molecular+Genetics+of+Yeast%3A+A+Practical+Approach%22">High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).</li>
<li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Getting+started+with+yeast+in+Guide+to+Yeats+genetics+and+Molecular+Biology%22">Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</a>. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).</li>
</ol>

이 프로토콜은 단백질 overexpression시 형태학의 표현형 (적절한 세포 분열을 거쳐 수없는 효모 세포)의 개발을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 빠른 속도 전지하고, 모호한 결과를 손상 수 있으므로 권장 원심 분리 속도 pelleting하여 효모 세포를 수확하기 위해 기억하는 것이 중요합니다. 메틸렌 블루와 Calcofluor 흰색들은 독성으로 직전 이미징에 세포를 사는에 추가되어 있어야합니다. 이 절차는 또한 쉽게 대상이 제어 모터의 표현 제공, 단백질 탄압 조건 하에서 관찰 phenotypes에 대해 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Nocodazole</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue 1% (w/v)</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor White</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. 이 프로토콜은 단백질의 overexpression를 기반으로하지만, 그것은 쉽게 단백질 표현의 억제에 따라 형태학의 phenotypes에 대해 적용할 수 있습니다. 우리 연구실은 endocytic 어댑터 단백질 epsin의 신호 특성을 공부에 관심을 가지고있다. 그 목적은 우리가 우리가 보존 - 이리 표현하는 지배적인 부정적인 접근 방식을 사용<u&gt; E</u&gt; psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; erminal<u&gt; H</u내생 epsin - 2 (Ent2 또는 YLR206W)의 기능을 방해하기 위해&gt; omology (ENTH) 도메인. 우리는 비계 단백질, septins의 가족의 mislocalization에 따라 달라집니다 세포 분열의 결함에 LED 야생 유형 세포 Ent2 (ENTH2)의 ENTH 도메인의 overexpression을 관찰했다.

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

유전자 결손과 단백질 과발현은 단백질의 기능을 연구하기 위해 흔히 사용되는 방법입니다. 본 논문에서는 ... 분석을 위한 프로토콜을 기술합니다.

본 프로토콜은 단백질 발현을 조절할 수 있는 조절 가능 프로토콜 촉진제(regulatable promoter)를 활용합니다. 본 실험에서는 메티오닌 억제성 촉진제(methionine repressible promoter)로부터 N two 도메인을 발현하는 고복제(high copy) 2마이크론 플라스미드를 사용합니다. 야생형 효모 세포에 이를 형질전환합니다.플라스미드와 형질전환체는 uol이 결핍된 플레이트에서 선택합니다. 선택 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 코르티솔 매개 성장 정지를 통해 세포를 동기화합니다.마지막으로, 시계열 실험 동안 메티오닌이 결핍된 배지로 세포를 옮겨 발현을 유도합니다. 단백질 농도는 웨스턴 블로팅으로 모니터링하고, 형태학적 표현형의 발현은 현미경으로 관찰합니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 생물과학과의 Claudia입니다.저는 AL 연구소의 Bari Muji입니다. 오늘은 단백질 농도에 따른 형태학적 표현형 발달 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 세포 내 섭취 어댑터 단백질인 absent two의 N2 도메인이 과발현되었을 때 관찰되는 세포 분열 표현형의 형태학적 및 분자적 측면을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 이 프로토콜은 관심 단백질을 발현할 효모 균주를 구축하는 것으로 시작합니다. 본 실험에서는 메티오닌 억제성 프로모터인 MET25의 제어를 받는 Nth2를 포함하는 고복제 플라스미드 DNA를 야생형 효모 균주 W303에 형질전환하였습니다. 2 mM 메티오닌은 MET25 프로모터 활성을 억제합니다.메티오닌이 없는 배지가 최대 발현을 가능하게 하지만, 최근 형질전환된 세포가 포함된 플레이트에서 6개의 콜로니를 선택하여 0.2 millimolar 메티오닌이 포함된 50 milliliters의 선택 배지가 담긴 삼각 플라스크에 접종하고, 다음 날 아침까지 30 degrees Celsius에서 200 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하십시오. 600 nanometers에서 배양액의 광학 밀도를 측정하여 세포 밀도를 추정하십시오. 20 OD 600 nanometers per milliliter에 해당하는 세포를 멸균된 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 수확하십시오.세포 주기를 동기화하기 위해 YPD 배지에서 세포를 볼텍싱하여 재부유시키고, DMSO에 녹인 1 mg/mL 스톡 용액을 사용하여 최종 농도가 15 µg/mL가 되도록 조절합니다. 30 °C에서 200 RPM으로 흔들어주며 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 유사분열 단계에서 정지된 세포의 비율을 확인합니다.현미경으로 관찰하여 크기가 동일한 출아 세포의 수를 측정함으로써 다음 단계로 진행합니다. 세포 주기 정지 비율이 90% 이상인 경우에만, 2200 RPM에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 얼음처럼 차가운 물로 세 번 세척한 후, 메티오닌이 결핍된 선택 배지에서 세포 밀도가 약 0.5 OD 600 nanometers/mL가 되도록 펠릿을 재현탁합니다.세포 부피의 절반을 새로운 멸균 튜브로 옮기고, methionine의 최종 농도가 0.2 millimolar가 되도록 첨가합니다. 이는 단백질 발현의 기저 수준으로 인한 효과를 확인하기 위한 대조군으로 사용됩니다. 두 배양액을 모두 30 degree Celsius 인큐베이터에 다시 넣습니다.각 시간대별로 6시간 동안 매시간 세포의 표현형 발달을 분석합니다. 각 배양액에서 1 mL의 세포 현탁액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 70 µL의 배지에 재현탁합니다. 그다음 멸균수에 1 mg/mL 농도로 조제된 메틸렌 블루 스톡 용액 30 µL를 첨가합니다.다음으로, 이 현탁액 약 6 µL를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 피펫으로 분주하고 그 위에 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립을 살짝 눌러 유리 계면 사이에 세포가 얇고 균일한 층을 형성하도록 합니다. 커버슬립 영역을 9개의 구역으로 나누고 구역당 3장의 이미지를 촬영합니다.정확한 정량을 위해 시야당 세포 수는 30개 이하여야 합니다. 연구 대상인 표현형을 보이는 세포의 수를 측정하십시오. 본 예시에서는 서로 분리되지 않고 신장되었거나 연결된 출아를 가진 출아 효모 세포가 이에 해당합니다. 또한 nth에 의해 유도된 세포 분열 결함으로 인해 파란색으로 식별되는 사멸 세포의 수도 함께 측정합니다.두 가지 과발현은 매 시간마다 표현형 특이적 결함을 시각화하기 위해 세포 사멸을 유도합니다. 멸균된 마이크로 원심분리관에 배양액 1 mL를 취하고, 원심분리를 통해 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 멸균수에 녹인 1 mg/mL의 Crystal Violet 용액 100 µL에 현탁하고, 상온의 암소에서 5분 동안 배양합니다.Calcior white 염색을 통해 e 세포벽을 시각화할 수 있습니다. 펠릿을 1x PBS로 3회 세척합니다. 최종 펠릿을 100 µL의 PBS에 현탁합니다.현미경으로 세포를 관찰하고, UV 광학계를 사용하여 세포벽을 시각화하며 100 x 배율로 이미지를 획득합니다. GFP가 태그된 septin을 시각화하려면 FS E 필터를 사용하여 이미지를 획득하십시오. 커버슬립을 9개의 구역으로 나누고 구역당 3장의 이미지를 촬영하여 세포 수를 세는 앞서 설명한 방법을 통해, 세포벽 결함 및 septin 오배치(mis localization)가 나타난 세포의 백분율을 정량화하고 타임랩스(TimeLapse) 비디오를 촬영합니다. 단일 효모 세포의 현미경 관찰에는 배지가 포함된 agar bed가 필요하므로, agar bed를 제작합니다.먼저 오목한 홈이 있는 유리 슬라이드를 70% alcohol로 세척하고 자연 건조시킵니다. 슬라이드가 건조되는 동안, methionine이 결핍된 선택 배지 5 mL에 agros 0.06 g을 넣고 agros가 빠르게 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열합니다. agros가 포함된 배지 200 µL를 피펫으로 취해 슬라이드에 분주합니다.오목 슬라이드 위에 깨끗한 다른 유리 슬라이드를 뒤집어 덮고, 아래쪽에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 겔이 응고되면, 두 슬라이드의 표면이 항상 평행을 유지하도록 하면서 상단 슬라이드를 오목 슬라이드로부터 부드럽게 밀어 이동시킵니다. 이렇게 하면 아가로스 층의 표면이 오목 슬라이드의 표면과 동일한 평면이 됩니다.부드러운 티슈를 사용하여 agros bed 주변의 슬라이드 영역을 닦아냅니다. 이제 슬라이드는 4시간 후에 사용할 준비가 되었습니다. 배양액에서 1 mL의 세포를 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 회수합니다.상층액을 흡입하여 제거하고 메티오닌이 포함되지 않은 신선한 선택 배지 100 µL에 세포를 재부유시킵니다. 커버 슬립의 가장자리에 바세린을 바릅니다. 그다음 세포 현탁액 한 방울을 agros bed 중앙에 떨어뜨리고, 그 위에 커버 슬립을 살짝 눌러 균일하게 펴줍니다.커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 매니큐어를 발라 위치를 고정합니다. 매니큐어가 마르면 슬라이드를 현미경의 가열 스테이지 위에 놓습니다. 시간이 지남에 따라 시야가 붐비게 되므로, Zeiss Axio camm, MRM 단색 디지털 카메라가 장착된 Zeiss Axio 200 M 현미경을 사용하여 적절한 간격으로 10개 이하의 세포가 포함된 시야를 선택합니다.세포가 분열하는 동안, 약 5시간 동안 5분마다 시야의 이미지를 촬영합니다. 초점을 반복적으로 재조정하는 것을 피하기 위해, 이미지 획득 소프트웨어를 프로그래밍하여 각 시점마다 몇 장의 Z-stack 이미지를 자동으로 획득하도록 설정합니다.나중에 초점이 가장 잘 맞은 이미지를 선택하여 동영상을 제작합니다. 세포에 충분한 열을 공급하기 위해, 가열 스테이지 외에도 이미징이 진행되는 전체 시간 동안 현미경의 투과 백색광을 켜두어 외부 열원을 추가로 제공합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지들을 동영상으로 합성함으로써 표현형 퇴행을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 관심 단백질을 과발현시킨 대표적인 결과를 보여줍니다. Nth two.먼저, nth two의 단백질 발현을 확인하였습니다. 실험 시간 경과에 따라 HA nth two를 발현하는 세포의 용해물을 단일클론 anti HA 항체를 이용한 western blotting으로 분석하였으며, 면역 블롯 결과에서 보는 바와 같이 0.2 mM methionine 존재 하에 배양된 세포는 단백질 발현이 최소 수준이었습니다. 그러나 methionine이 결핍된 배지에서 배양된 세포는 실험 시간 경과에 따라 S two의 농도가 지속적으로 증가함을 보여주었습니다.낮은 nth 두 농도는 세포 분열 표현형을 유도하거나 세포 사멸만을 일으키기에 불충분하므로, 메티오닌 존재 하 또는 부재 하에서 6시간 동안 배양한 세포를 분석하였습니다. 메틸렌 블루로 염색한 후 파란색으로 나타나는 세포의 비율이 낮아, 사멸한 세포가 적음을 확인할 수 있었습니다. 마찬가지로, 세포당 핵의 수, 세포벽 및 septin 조직은 예상대로 정상적이었습니다.이와 대조적으로, M2의 과발현은 심각한 세포 분열 결함과 세포 사멸을 유발하며, 이는 메틸렌 블루로 염색했을 때 푸른색을 유지하는 길게 연결된 신장된 출아들의 긴 사슬로 입증됩니다. DPI 염색 결과에서 나타나듯이, 대부분의 표현형 세포는 다핵성입니다. Calcofluor white 염색은 비정상적인 세포벽 패치의 축적을 보여줍니다.또한, septin이 심하게 잘못 배치되고 무질서하게 나타납니다. 시간에 따른 표현형 정량화 결과가 이 그래프에 표시되어 있으며, 빈 원은 0 mM methionine을, 채워진 원은 0.2 mM methionine을 나타냅니다. 이를 통해 시간이 지남에 따라 세포 내에 nth two 농도가 축적되면서, 세포 분열 표현형을 보이는 세포의 비율 또한 증가하는 것을 확인할 수 있습니다.0.2 mM methionine에서 배양된 대조군 세포는 표현형 발현이 세포 배양 조건 때문이 아니라 단백질 농도의 증가에 따른 결과임을 보여줍니다. 마지막으로, nth two 과발현에 따른 표현형 발현 과정이 타임랩스 비디오 현미경으로 촬영되었습니다.nth 처리 4시간 후, 두 개의 과발현 세포에서 가벼운 형태학적 세포 분열 표현형이 나타납니다. 영상이 진행됨에 따라, 정단아(apical bud) 성장이 비정상적으로 연장되어 매우 길쭉한 아(bud)가 형성되는 것을 확인할 수 있습니다. 또한, 세포 분리 이벤트가 일어나기 전에 새로운 아가 출현하는 현상도 관찰됩니다.또한, 모세포의 여러 영역에서 출아(bud)가 발생하는 것이 관찰되며, 이는 가지가 뻗어 나오는 모양으로 나타납니다. 지금까지 출아 효모에서 단백질 농도에 따른 형태학적 표현형의 발달을 특성화하고 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 더 빠른 속도는 세포에 손상을 줄 수 있으므로 권장되는 원심분리 속도로 세포를 처리하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.methylene blue와 chloride는 light east 세포에 독성이 있으므로, 이미징 직전에 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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