성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된

본 프로토콜을 시작하려면, 원하는 박테리아 이펙터(effector)의 발현을 위한 벡터를 선택하십시오. 사용 중인 효모 및 효모 균주에서, 해당 벡터를 효모 세포 내로 형질전환시킵니다. 그다음, 이펙터의 발현을 유도합니다.

유도된 세포를 용해하여 이후 웨스턴 블롯 분석을 통해 이펙터(effector)의 발현을 확인합니다. 이펙터의 발현이 확인되면 세포를 배양하고 10배 단계 희석하여 억제 배지와 유도 배지에 점적(spotting)합니다. 마지막으로 2~3일 후, 효모의 성장을 분석합니다.

안녕하세요, 텔아비브 대학교 식물과학과의 Guido Cesa 박사 연구실 소속 Do Solomon입니다. 오늘은 효모에서 세균 type three effector의 발현으로 인해 유도되는 성장 억제 표현형을 식별하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 그람 음성 병원성 세균의 type three effector 기능을 연구하기 위해 이 절차를 사용하며, 이는 effector TIC 표적을 식별하는 데 도움이 되는 도구입니다.

이제 시작하겠습니다. 관심 있는 3형 이펙터의 발현에 적합한 효모 시스템을 설계할 때는 몇 가지 중요한 요소를 고려하고 최적화해야 합니다. 첫 번째는 이펙터의 발현을 유도하는 프로모터입니다.

박테리아 3형 분비 시스템 이펙터(type three effectors)는 효모 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로, 이들의 발현을 제어하기 위해 유도성 프로모터를 사용해야 합니다. 본 실험에서는 GAL1 프로모터를 사용하겠습니다. 두 번째 고려 사항은 이펙터 유전자의 복제수(copy number)입니다.

이펙터 유전자가 2µm 플라스미드에 의해 운반될 때 높은 발현 수준이 달성됩니다. 센트로미어를 포함하는 플라스미드를 사용하면 중간 정도의 발현을 얻을 수 있으며, 이펙터 유전자가 상동 재조합에 의해 효모 게놈에 통합되면 낮은 발현이 달성됩니다. 고려해야 할 세 번째 요인은 관심 있는 이펙터에 대한 항체를 사용할 수 없는 경우, 단백질 발현을 확인하기 위해 사용되는 에피토프 태그입니다.

일반적으로 사용되는 태그는 신뢰할 수 있는 상업용 항체가 시판되고 있는 M hemagglutinin HA 또는 flag입니다. 이펙터 단백질의 구조와 활성에 미칠 수 있는 원치 않는 유해한 영향을 최소화하기 위해 태그를 하나만 사용하는 것을 권장합니다. 마지막으로, 발현에 사용할 효모 균주는 발현 벡터의 선택 마커에 대해 영양 요구성이 있어야 합니다.

형질전환을 위한 효모 세포를 배양하려면, 신선한 플레이트에서 효모 콜로니를 채취하여 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 담긴 3 mL의 YPD에 접종한 후 볼텍싱합니다. 배양 튜브를 롤러에 짧게 넣고 30 °C에서 지속적으로 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 롤러에서 배양액을 꺼내어 상온에서 800 Gs로 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 완전히 제거하고, 세포를 1 mL의 Resus 현탁 완충액에 재현탁한 다음 최대 속도로 약 10초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 형질전환할 각 플라스미드와 추가 대조군 형질전환을 위해, 세포 현탁액 100 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 대조군 튜브를 제외한 각 튜브에 단일 가닥 연어 정자 DNA 5 µL와 플라스미드 DNA 250~500 ng을 첨가합니다.

다음으로, 각 튜브에 변형 용액 650 µL를 조심스럽게 첨가하고 볼텍싱합니다. 롤러 위에서 30 °C로 30분 동안 튜브를 배양합니다. 배양이 완료되면, 각 튜브에 DMSO 70 µL를 첨가하고 세포 파괴를 방지하기 위해 튜브를 10~15회 반전시켜 혼합합니다.

튜브를 볼텍싱하지 마십시오. 42 °C로 예열된 항온수조에 튜브를 넣고 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 튜브를 항온수조에서 꺼내 즉시 얼음에 2분 동안 둡니다.

튜브가 식으면 원심분리를 통해 세포를 회수한 다음, 피펫을 사용하여 점성이 있는 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 각 펠릿을 150 µL의 멸균 2중 증류수에 재부유시키고, 적절한 선택 배지가 도포된 플레이트에 세포 현탁액을 도말합니다. 플레이트를 2분 동안 열어두어 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 건조시킵니다.

그 후, 플레이트를 30 °C 인큐베이터에 2~3일 동안 넣어 효모 세포를 배양합니다. 단백질 추출물을 준비하려면, 신선한 플레이트의 효모 콜로니를 적절한 억제 배지 3 mL에 접종하고 볼텍싱합니다. 다음 날, 배양 튜브를 30 °C 롤러에 잠시 둡니다.

롤러에서 배양액을 꺼내 실온에서 800 Gs로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 볼텍싱으로 혼합한 3 mL의 멸균 DDW에 넣고 다시 원심분리하여 상층액을 버린 뒤, 세포를 3 mL의 멸균 DDW에 재현탁합니다. 이제 세포 현탁액 200 µL를 볼텍싱으로 혼합한 적절한 유도 배지 3 mL가 들어 있는 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다.

튜브를 롤러에 넣고 30 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 아침에 배양액 1 mL(저밀도 배양의 경우 그 이상)를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상온에서 800 ×g로 5분간 원심분리하여 세포를 수확하며, 이후 단계부터는 독성 Beamer capto 에탄올 증기를 흡입하지 않도록 흄 후드 내에서 작업하십시오.

피펫터를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠릿을 100 µL의 ice cold lysis solution에 다시 현탁합니다. 볼텍싱으로 격렬하게 혼합한 후 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 30분의 배양 시간 동안, 100 µL의 lysis buffer를 pH 9에서 10까지 적정하는 데 필요한 normal hydrochloric acid의 부피를 결정합니다.

이를 위해, 10개의 서로 다른 튜브에 들어있는 100 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)에 다양한 부피의 염산을 첨가하고, 적절한 부피의 염산을 용해물에 첨가하여 볼텍싱으로 혼합한 후 배양 종료 시점에 pH 지시지를 사용하여 용액의 pH를 확인합니다. 그런 다음 용해물에 50 µL의 3x 샘플 버퍼(sample buffer)를 첨가하고 볼텍싱으로 혼합한 뒤, 바늘로 마이크로 튜브 덮개에 구멍을 뚫고 가열 블록에서 5분 동안 용해물 용액을 끓입니다. 가열 후, 실온에서 2분 동안 용액을 식힙니다.

그 다음 용해물 용액을 볼텍싱하고 10초 동안 원심 분리합니다. 이제 용해물은 스포팅 분석을 위한 세포 준비를 위한 면역 혈액 분석에 사용할 수 있습니다. 다음 날, 이전에 설명한 대로 각 균주의 배양액 3 mL를 배양합니다.

류신이 포함되지 않은 합성 완전 배지가 담긴 플레이트 2개를 준비합니다. 한 쪽 플레이트의 배지에는 2% glucose를 첨가하고, 다른 쪽 플레이트의 배지에는 2% lactose와 1% raffinose를 첨가합니다. 멸균된 라미나 플로우 후드 내에서 실온으로 20분 동안 플레이트를 건조시킵니다.

세포를 수확하고 각 세포 펠렛을 3 mL의 멸균 DDW에 재부유합니다. 원심분리 단계를 반복하고 세포를 멸균 DDW 3 mL에 다시 재부유합니다. 각 배양액의 광학 밀도(OD)를 측정한 후, 멸균 마이크로피펫 튜브에 OD 600이 1이 되도록 1 mL의 세포 현탁액을 준비합니다.

다음으로, 900 µL의 멸균 DDW가 채워진 멸균 마이크로 튜브 3개를 사용하여 각 세포 현탁액으로부터 10배 단계 희석액 3개를 준비합니다. 건조된 플레이트를 그리드 위에 놓고, 각 배양 지점에 네 가지 희석액을 순서대로 10 µL씩 점적합니다. 점적 후, 플레이트를 후드 내에 몇 분 동안 열어둡니다.

스팟이 마르면 플레이트를 덮고 30 °C 인큐베이터에서 2~3일 동안 배양합니다. 이제 성장 억제 검출을 위한 효모 스포팅 분석 결과를 보여드리겠습니다. 여기서는 박테리아의 3형 이펙터인 AvrPto, HopAA1 및 AvrRe1의 발현에 의해 유도된 표현형을 확인합니다.

토마토의 Pseudomonas Riner 경로 유전자들은 억제 배지에서 센트로미어 함유 플라스미드가 도입된 효모 균주로부터 발현되었습니다. A-V-R-P-T-O 및 HOP AA one one의 발현을 위한 플라스미드를 가진 효모 균주들은 공벡터를 포함하는 대조군 균주와 유사한 성장을 보였습니다. AAV RE one을 가진 효모는 GAL one 프로모터의 누출과 AV RE one의 높은 세포 독성으로 인해 성장이 약간 감소한 모습을 보인 반면, 유도 조건 하에서 AV E one 또는 HOP AA one one의 발현은 모든 희석 배수에서 콜로니가 형성되지 않는 급격한 성장 억제 표현형을 유발했습니다. 이와 대조적으로 A-V-R-P-T-O의 발현은 어떠한 성장 억제 효과도 나타내지 않았습니다.

지금까지 효모에서 박테리아 3형 이펙터의 발현으로 인해 발생하는 성장 억제 표현형을 식별하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 발현 벡터와 균주 모두 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로, 이를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 또한, 절차의 모든 단계에서 갓 형질전환된 콜로니를 사용해야 함을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.