Name: COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 COS-7 세포에서 SNAP-태그 융합 단백질을 이용한 형광 라벨링 방법을. 실시간 단백질 역학 관찰과 세포 내 단백질 위치 분석에 활용할 수 있는 효과적인 기술입니다.

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카이 Johnsson 이반 코레아 안드레아스 브레히트 카트린 Müentener 크리스 노렌 루오 일 밍 쑤 테오도르 데이비스 살바토레 Russello Aihua 장 잉카 가쉬 엘리사 Maunus 니콜라스 라바흐뜨 제임스 맥팔랜드 존 버스웰 브렌다 데즈먼드 제임스 엘라드 돈 빗

CHO - K1 세포를 도금 : <ol><li> F - 12K 전체의 6ml 표준 프로토콜에 따라 trypsinized되었습니다 CHO - K1 세포의 50 100μl 추가합니다. </li><li> 여러 번 아래 pipetting과에 의해 세포 현탁액을 혼합, # 1.5 borosilicate coverglass 실 (과 살균 8 실 랩 - 테크 II Chambered Coverglass 각 잘하는 trypsinized 세포 현탁액의 다음 나누어지는 300 μl Nalgene Nunc의 INT;. 제품 # 155409; 롯 : 100808-8-0). </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 밤새에서 샘플을 품어. </li></ol> pSNAP - ADRB2 및 pSNAP - H2B와 CHO - K1 세포의 과도 Transfection : <ol><li> 세포 밀도와 건강을 찾기 위해 전날에 씨앗을 품고 세포 배양 챔버를 확인합니다. </li><li> microfuge 튜브의 해당 번호를 라벨. </li><li> 층류 후드에서 transfection 복잡한 혼합물은 0.3 μg pSNAP - ADBR2 제어 플라스미드 DNA 또는 pSNAP - H2B 제어 플라스미드 DNA, TransPass의 D2 1 μl와 TransPass V 1 μl의 0.3 μg 중 하나를 사용하여 다음 예제 차트에 따라 설정 반응 당. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 플라스미드 </td><td> 반응의 수를 </td><td> 혈청이없는 매체의 μl </td><td> TransPass의 D2의 μl </td><td> TransPass V의 μl </td><td> 플라스미드 DNA의 μl </td><td> TransPass의 D2/reaction의 μl </td><td> TransPass V / μl 반응 </td><td> DNA / 반응 NG </td><td> DNA CONC. (μl / NG) </td><td> 플라스미드 DNA / μl 반응 </td></tr><tr><td> SNAP - ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472.34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B - SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515.89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 조롱하다 </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> 첫째, 적절한 플라스미드 DNA와 F - 12K 혈청 무료 후 TransPass V의 Transfection 시약을 추가 후, TransPass D2 Transfection 시약을 추가 섞는다. 각 시약의 추가 후 부드럽게 여러 번하고 아래로 pipetting으로 잘 구성 요소를 섞는다. </li><li> 30 분 실온에서 반응을 품어. </li><li> 부화하는 동안, 전체 DMEM 600 μl로 한 세포를 씻어 각 샘플을 완료 DMEM의 450 μl를 추가합니다. </li><li> 천천히, 그리고 드롭 현명한 방식으로, 각 샘플에 transfection 복잡한 혼합물의 50 μl를 추가합니다. </li><li> ° C 5 % CO 2 37 밤새 샘플을 품어. </li></ol> Transiently pSNAP - ADRB2 및 pSNAP - H2B와 Transfected CHO - K1 세포의 SNAP - 셀 TMR 스타 라벨링 : <ol><li> 조심스럽게 진공 흡입하여 각 샘플에서 transfection 복잡한 미디어를 제거합니다. F - 12K 전체 600 μl로 두 번 세포를 씻고 F - 12K 전체 600 μl와 함께 각 잘 미디어를 교체하십시오. </li><li> 전체 F - 12K 51 μl 0.6 MM SNAP 세포 TMR - 스타 기판의 995 μl를 추가하여 염료 라벨 미디어를 섞는다. SNAP - 셀 TMR - 스타의 최종 농도는 3mM해야합니다. 기판의 추가 후 혼합을 여러 번 위아래로 피펫. </li><li> 조심스럽게 샘플에서 성장 미디어를 제거하고 각 잘하는 염료 라벨 용지 200 μl를 추가합니다. 37 샘플을 품어 ° C 5 % CO 30 분 2. </li><li> 전체 F - 12K 10 ML에, 샘플 잠복기 있지만, Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (Invitrogen 분자 프로브 물 10 MG / ML 솔루션, 16.2 MM 솔루션) 1 μl를 혼합하여 시료의 핵 얼룩에 대한 Hoechst 33342 용액을 준비 . </li><li> 모든 샘플에서 미디어를 제거하고 각 샘플에 희석 Hoechst 솔루션 600 μl를 추가합니다. 37 샘플을 품어 ° C, 5 % 5 분 동안 CO 2. </li><li> F - 12K 전체 600 μl와 샘플을 세 번 씻으십시오. </li><li> 37 샘플을 품어 ° C 5 % 비법인 형광단이 세포 밖으로 확산 수 있도록 추가 30 분 CO 2. </li><li> 30 분 후에, SNAP 세포 샘플을 마지막으로 한 시간에 미디어를 변경하고 이미지로 넘어갑니다. </li><li> 자이스 혈구 Apotome Axiovert 200M 형광 현미경을 사용하여 이미지 세포. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 왔지SNAP - 태그 fusions을 표현 아르 라이브 COS - 7 세포의 형광 현미경 표준을 사용하는 형광 이미징의 일부 대표적인 결과입니다. 첫 번째 이미지는 SNAP 세포 TMR - 등급으로 표시 pSNAP - H2B을 (히스톤 핵) 표현 라이브 COS - 7 세포를 보여줍니다. pSNAP - H2B 건설은 pSNAP 태그 (M) 벡터를 사용하여 생성되었습니다. 세포는 30 분 SNAP - 셀 TMR - 스타로 표시하고 핵에 대한 Hoechst 33342 (파란색)과 counterstained되었습니다. 핑크 형광는 히스톤 단백질이 핵을 나타내는 파란색의 형광 이외에 존재하는 적색 형광의 오버레이를 보여줍니다. H2B 단백질의 표현이 명확하고 쉽게 식별됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 2와 3.이 다음 두 이미지는 transiently pSNAP - ADRβ2와 transfected 라이브 COS - 7 세포를 보여줍니다. 전지는 SNAP 세포 TMR - 스타 (적색)으로 표시하고 Hoechst 33342 (파란색)과 counterstained되었습니다. pSNAP - ADRβ2 건설은 pSNAP 태그 (M) 벡터를 사용하여 생성되었습니다. 세포는 30 분 SNAP - 셀 TMR - 스타로 표시하고 핵에 대한 Hoechst 33342 (파란색)과 counterstained되었습니다. 파란 형광이 핵을 식별하는 동안 빨간색 형광은 세포 표면 수용체 단백질 ADRB2의 존재를 나타냅니다.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산하는 뉴 잉글랜드 Biolabs 고용하고 있습니다.

형광단의 photostability은 퇴색하기 전에 캡처해야합니다 얼마나 빨리 형광 결정 등 초점, 레이저 강도, 장비 기능, 렌즈 사용 등 관찰 결과에 영향을 미치는 여러 변수가 있습니다. 단백질 라벨의이 방법은 다양한 여러 애플 리케이션에 적합합니다. 합성 프로브와 함께 융합 단백질의 특정 상표에 대한 SNAP - 태그와 클립 태그 기술은 라이브 세포에서 세포 lysates의 역동적인 프로세스를 포함하여 다양한 단백질 기능의 다양한 측면을 활성화하십시오. SNAP -, 클립, MCP 및 ACP 태그 기술이 생활하고 고정된 세포에 단백질의 이미지와 체외에서 단백질 연구에 단순하고 특별한 다기능을 제공합니다. 하나의 유전자 구조의 생성은 fluorophores, 비오틴, 또는 구슬을 포함하여 기능 그룹의 다양한 공유 결합 결합을 형성 수있는 태그 융합 단백질을 산출. 관심의 단백질은 복제 및 표현 한 번만 후 융합이 같은 라이브 셀 내부에 동시 단백질 라벨, 단백질 현지화 및 translocation, 펄스 - 체이스 실험, 수용체의 국제화 연구 등 다양한 스트림 애플 리케이션을위한 형광 기판의 다양한 사용할 수 있어야합니다 , 선택적 세포 표면 라벨, 단백질은 assays, SDS - PAGE, 유동세포계측법, microtiter 접시, 바이오 센서 상호 작용 실험에서 높은 처리량 바인딩 assays의 단백질 감지, 그리고 걱정 기반 바인딩 assays를 가져옵니다.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>무혈청 F-12K 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 붕규산 커버글라스 챔버가 포함된 Lab-Tek II 챔버 커버글라스</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lot: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (증류수 내 10 mg/ml 용액, 16.2 mM 용액)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome Axiovert 200M 형광 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-ADBR2 대조군 플라스미드</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-H2B 대조군 플라스미드</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

cos - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 snap - 태그 퓨전 단백질 표현

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 이러한 시스템은 이미징 장비의 범위에 최적화된 형광 기판의 넓은 선택을 제공합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하는 두 가지 단계가 있습니다 : SNAP - 태그 융합, 그리고 선택의 SNAP 태그 기판과 융합의 상표로 관심의 단백질의 복제, 그리고 표현. SNAP 태그 인간 O를 기반으로 작은 단백질이다<sup&gt; 6</sup(hAGT)&gt; - alkylguanine - DNA - alkyltransferase DNA 수리 단백질. SNAP 태그 레이블은 벤질 링커를 통해 구아닌에 복합 염료 또는 chloropyrimidine 떠나는 그룹입니다. 라벨 반응에서 기판의 치환 벤질 그룹은 covalently SNAP 태그에 첨부되어 있습니다. CLIP - 태그 benzylcytosine보다는 benzylguanine 파생 상품과 함께 반응하도록 설계 SNAP 태그의 수정된 버전입니다. SNAP 태그와 함께 사용할 경우, 클립 - 태그는 동일한 셀에 동시에 두 단백질의 직교 및 보완 라벨 수 있습니다.

SNAP - 태그와 클립 태그 단백질 라벨링 시스템은 라이브 세포에 대한 관심의 단백질, 형광 염료를 포함하여 분자의 특정 공유 결합 첨부 파일을 활성화합니다. 일단 복제된과 표현, 태그 단백질 다시 복제하지 않고도 수많은 스트림 애플 리케이션을위한 기판의 다양한 사용할 수 있습니다.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag 및 CLIP-tag 단백질 표지 시스템은 형광 염료를 포함한 분자들을 표적 단백질에 특이적이고 공유 결합적으로 부착할 수 있게 합니다...

SNAP 및 clip 태그. 단백질 라벨링 시스템을 통해 거의 모든 분자를 표적 단백질에 특이적으로 공유 결합시킬 수 있습니다. 표적 유전자를 태그 발현 벡터의 어느 한쪽에 클로닝하면, 클로닝된 유전자가 발현되어 SNAP 태그 융합 단백질이 생성됩니다.SNAP-tag 기질은 SNAP-tag에 의해 인식되는 benzo guanine과 기능성 그룹의 두 부분으로 구성됩니다. 기능성 그룹은 biotin, 비드 또는 다양한 색상으로 제공되는 형광 그룹일 수 있습니다. 표지 반응 중에 치환된 benzo 그룹이 SNAP-tag에 공유 결합하면서 guanine이 방출되며, 만약 Fluora 4가 표적 단백질에 결합되어 있다면 표지체가 형광을 발하여 살아있는 세포 또는 고정된 세포 내에서 단백질을 시각화할 수 있게 합니다.안녕하세요, New England Bile Labs의 Chris Provost입니다. 오늘은 snap tag 융합 단백질을 발현하는 살아있는 COS seven 세포의 형광 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 단백질이 세포 내 어디에 위치하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작해 보겠습니다. transfection을 위해 cos seven 세포를 준비하려면, 표준 프로토콜에 따라 trypsin 처리하고, 6 mL의 complete DMEM 배지에 50~100 µL의 세포를 첨가하십시오. 피펫팅으로 여러 번 위아래로 섞어 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음, 멸균된 8-chamber lab tech 2-chambered cover glass의 각 well에 trypsin 처리된 세포 현탁액 300 µL씩을 분주하십시오. 샘플을 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날에 진행합니다.세포 배양 챔버의 세포 밀도와 상태를 확인합니다. transfection complex 혼합물을 담을 적절한 수의 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 부착합니다. 층류 정화 작업대(laminar flow hood) 내에서 진행합니다.각 반응을 위한 transfection 복합체 혼합물을 준비합니다. 무혈청 배지에 희석한 0.3 µg의 snap fusion 플라스미드 DNA와 1 µL의 transfection 시약을 사용하십시오. transfection 시약의 효율을 평가하기 위해 TPAs D two 및 TPAs v transfection 시약 대조군 플라스미드를 사용할 수 있습니다.또한 각 복합 혼합물에 대한 음성 대조군으로 모의 형질전환(mock transfected) 샘플 및/또는 절제되지 않은 샘플을 포함할 것을 권장합니다. 먼저, 무혈청 DMEM을 적절한 플라스미드 DNA와 혼합하십시오. 그다음 TPAs D 두 형질전환 시약을 첨가하고, 이어서 TPAs v 형질전환 시약을 첨가하십시오.각 시약을 첨가한 후 피펫팅을 통해 부드럽게 여러 번 섞어주고, 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하십시오. 배양하는 동안 600 µL의 complete DMEM으로 세포를 한 번 세척하고, 각 샘플에 450 µL의 complete DMEM을 추가하십시오. 배양이 완료되면, 각 샘플에 50 µL의 transfection complex 혼합물을 천천히 한 방울씩 첨가하십시오. 샘플을 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 형질전환된 cost seven 세포를 snap cell TMR star 기질로 표지합니다. 이 절차를 시작하기 위해 snap cell TMR star 기질에 50 µL의 DMSO를 가하고 파이펫팅하거나 1분간 볼텍싱하여 혼합합니다. 다음으로, 진공 흡입을 통해 각 시료에서 형질전환 복합체 배지를 조심스럽게 제거하고, 600 µL의 완전 DMEM으로 세포를 두 번 세척합니다.그런 다음 각 웰의 배지를 600 µL의 완전 DMEM으로 교체합니다. 샘플을 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 완전 DMEM 995 µL와 0.6 mM 용액 5 µL를 첨가하여 D 표지 배지를 혼합합니다.기질을 첨가한 후, Snap cell TMR star 기질을 피펫으로 여러 번 상하로 섞어줍니다. Snap cell TMR STAR의 최종 농도는 3 µM이어야 합니다. 샘플에서 배양액을 조심스럽게 제거하고 각 웰에 200 µL의 DIA 라벨링 배지를 첨가합니다. 샘플을 37 °C, 5% CO2 조건에서 30분 동안 배양합니다. 샘플이 배양되는 동안 TMR 기질의 Benzel 그룹이 snap tag에 공유 결합하여 quain을 방출하게 됩니다.시료의 핵 염색을 위한 HX 용액을 준비합니다. 10 mL의 완전 DMEM에 1 µL의 HSED 3 33 42 Tri Hydrochloride TRI를 혼합합니다. 배양이 완료되면, 모든 시료에서 d 라벨링 배지를 제거하고 각 시료에 희석된 hooked 용액 600 µL를 첨가합니다.시료를 37 °C, 5% CO2 조건에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 각 시료에서 희석된 hooked solution을 제거하고 600 µL의 complete DMEM으로 시료를 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 각 시료에 600 µL의 complete DMEM을 첨가합니다.세포 내 라벨링에 필요한 결합되지 않은 Fluor의 세포 외 확산을 유도하기 위해, 샘플을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 30분 동안 추가로 배양합니다. 30분 후, 스냅 셀 샘플의 배지를 마지막으로 600 µL의 complete DMEM으로 교체합니다. 이제 zeis AOME vert 200 M 형광 현미경을 사용하여 세포 이미징을 수행할 수 있습니다.태그 융합 단백질을 발현하는 살아있는 COS-7 세포를 표준 형광 현미경으로 관찰한 대표적인 형광 이미지 결과입니다. 첫 번째 이미지는 snap-cell TMR*로 표지된 PNAP-H2B를 발현하는 살아있는 COS-7 세포를 보여줍니다. PNAP-H2B 구성물은 PNAP-TAG-M 벡터를 사용하여 제작되었습니다.세포를 snap cell TMR star로 30분 동안 표지하고, 핵을 염색하기 위해 Hoechst 33342로 대조 염색하였습니다. 분홍색 형광은 히스톤 단백질이 존재하는 위치의 적색 형광 중첩을 나타냅니다. 핵을 나타내는 청색 형광과 더불어, H2B 단백질의 발현을 명확하고 쉽게 확인할 수 있습니다.다음 두 이미지는 pnap이 일시적으로 형질전환된 살아있는 cost seven 세포를 보여줍니다. A DR beta two 세포는 snap cell, tmr, star로 표지하고 HUX 3 33 42로 대조 염색하였습니다. pnap A DR beta two 컨스트럭트는 PNAP TAG M 벡터를 사용하여 제작되었습니다.세포를 snap cell TMR star로 30분 동안 표지하고, 핵을 염색하기 위해 hooks 3 33 42로 대조 염색하였습니다. 적색 형광은 세포 표면 수용체 단백질 A DR beta two의 존재를 나타내며, 청색 형광은 핵을 식별합니다. 지금까지 snap tag 융합 단백질을 발현하는 살아있는 cough seven 세포의 형광 이미징 수행 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, transfection complex를 천천히 한 방울씩 첨가해야 한다는 점과 snap tag substrate를 사용하지 않을 때는 -20 °C의 암소에 보관해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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