siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

유사분열 중에 발생하는 세포 조직 및 염색체 역학의 변화는 게놈 및 세포 함량의 정확한 유전을 보장하기 위해 긴밀하게 조정됩니다. 이 비디오 기사에서는 유사 분열의 특징적인 이벤트를 추적하는 방법을 보여줍니다. 염색체 이동은 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포주를 사용하여 개별 세포 단위로 모니터링됩니다.

irna를 사용한 transfection은 유사분열 단백질에 대한 것으로, 타임 랩스 이미징으로 시각화하고 이미지 분석으로 정량화할 수 있는 세포 주기 변화를 초래합니다. 안녕하세요, 저는 유타 대학교 헌츠맨 암 연구소(University of Utah's Huntsman Cancer Institute)의 케이티 오만(Katie Oman) 연구실의 더글라스 맥키(Douglas Mackey)입니다. 오늘은 SIA transfection 후 유사분열을 통해 진행되는 살아있는 세포를 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다.

우리는 연구실에서 이 절차를 사용하여 관심 단백질의 파괴가 유사분열 진행 시기에 미칠 수 있는 영향을 연구합니다. 시작하겠습니다. 각각에 0.5ml의 피브로넥틴을 첨가하여 4개의 벽 실험실 기술자 2개의 챔버 커버 유리를 준비합니다.

실온에서 10-15분 동안 잘 배양합니다. 그 동안, 역transfection을 위해 irna 및 lip RNAI max complex를 준비합니다. 각 챔버에 대한 제조업체의 지침에 따라 24 웰 접시 중 한 웰에 권장되는 양을 잘 사용하십시오.

15분 후, 챔버 커버 유리의 웰에서 피브로넥틴을 제거합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 irna 복합체를 각 웰 분취 20, 500 마이크로 리터에 각각 추가합니다. 세포를 24시간 동안 인큐베이터에 잘 넣습니다.

다음 날, transfection 혼합물을 1ml의 일반 세포 배양 배지로 교체한 다음, 이미지 획득 24시간 전에 추가로 세포를 배양합니다. 이미지 획득 설정은 이미지 획득 소프트웨어로 제어되는 도립 현미경의 스테이지에 맞는 맞춤형 세포 인큐베이터로 구성됩니다. 이미지 획득을 준비하려면 인큐베이터가 사전 경고를 받고 평형을 이루는지 확인하십시오.

그런 다음 인큐베이터의 뚜껑을 열고 챔버 덮개가 있는 셀을 어댑터에 넣습니다. 소량의 모델링 점토를 사용하여 제자리에 고정합니다. 뚜껑을 닫고 전체 인큐베이터를 현미경 스테이지에 배치하여 인큐베이터가 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다.

다음으로, metamorph를 사용하여 소프트웨어의 메뉴 표시줄에서 앱 다차원 획득을 선택하여 실험을 설정합니다. 그러면 이미징 매개변수를 선택할 수 있는 창이 나타납니다. 데이터 파일을 저장할 위치를 지정합니다.

그런 다음 4개의 TX dry phase contrast objective를 사용하여 brightfield 및 m cherry 파장을 선택하고, 소프트웨어를 사용하여 세포 필드에 초점을 맞추고, Brightfield 채널에 대해서만 자동 초점 기능을 조정합니다. 이를 통해 소프트웨어는 각 획득 전에 각 단계 위치에서 자동 초점을 맞출 수 있습니다. 첫 번째 파장의 경우 이미지 캡처 50밀리초 노출을 사용하여 좋은 이미지를 보는 데 필요한 최소 노출 시간으로 조정합니다.

지속적인 세포 생존력을 보장하기 위해 빛 노출량을 제한하는 것이 중요합니다. 일반적으로 이는 중립 밀도 필터와 더 긴 카메라 노출 시간을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 조명 강도를 높이는 것보다는.

추가 파장에 대해 이 절차를 반복합니다. 그런 다음 각 채널의 노출 시간을 설정합니다. 다음으로, 15개의 스테이지 위치에서 8시간 동안 15분의 타임랩스 간격을 지정합니다.

더 나은 시간 해상도를 원하면 획득 사이의 시간 간격을 줄이십시오. 더 많은 스테이지 위치를 사용할수록 획득하는 데 더 오래 걸린다는 것을 기억하십시오. 각 시간 간격에서 세포 집단을 적절하게 샘플링할 수 있도록 적절한 수의 스테이지 위치를 선택하고 표시합니다.

Metamor는 포지션을 기록하고 각 인수에 대해 지정된 위치로 돌아갑니다. 타임 랩스 파장 노출 후 시간 및 스테이지 위치 정보가 지정되었습니다. 화면에서 미리보기 버튼을 선택하여 소프트웨어가 장비를 적절하게 제어하고 있는지 확인합니다.

시스템이 작동하는지 확인한 후 화면에서 획득 버튼을 선택하여 수집을 시작합니다. 모든 것이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 최소 한 번의 전체 획득을 통해 자동화를 관찰합니다. 그런 다음 편안히 앉아서 컴퓨터와 현미경이 작업을 수행하도록 합니다.

데이터를 검토하려면 앱을 선택하고, 메뉴 막대에서 다차원 데이터를 검토하고, 파일 위치 보기를 선택한 다음, 스테이지 위치를 선택합니다. 이미지 로드를 클릭하여 해당 위치에서 이미지 스택을 검토합니다. 이미지가 로드되면 마우스를 사용하여 데이터를 프레임 단위로 이동합니다.

여기서 영화는 변성 (metamorph)을 사용하여 유사 분열 세포로 생성됩니다. Metamorph에서 동영상을 만들려면 스택 동영상 만들기를 선택합니다. 메뉴 막대에서 동영상의 속도와 파일 형식을 사용할 프레임을 선택합니다.

그런 다음 저장을 선택하여 몽타주를 만듭니다. 먼저 메타모프에서 데이터를 도트 STK 파일로 저장합니다. 그런 다음 이미지 J를 엽니다: 이미지 J에서 점 s stk 파일을 열고 영역을 표시하고 메뉴 모음에서 이미지 자르기를 선택하여 관심 영역을 자릅니다.

그런 다음 이미지 스택을 선택합니다. 몽타주가 몽타주의 크기와 형태를 포함할 프레임을 지정하도록 합니다. 그리고 프레임 테두리 사이가 필요한지 여부.

그런 다음 확인을 누르십시오. 몽타주를 dot tiff 파일로 저장합니다. 마지막으로, 유사분열의 각 단계에서 시간을 계산하고, T가 0 prophase와 같기 때문에 DNA 응축 또는 세포 반올림의 첫 번째 징후가 분명한 프레임을 지정합니다.

염색체가 적도에서 정렬될 때 전중기가 끝나고, 중기는 DNA가 아나페이즈 텔로페이즈를 분리하기 시작할 때까지 진행됩니다. 그리고 마지막으로, 사이토키네시스(cytokinesis)가 이어지고 세포가 평평해지기 시작합니다. 그의 돌을 발현하는 문턱 세포의 타임 랩스 이미징.

H, 2개의 BCFP가 도시되어 있습니다. 이들 세포는 control irna로 형질주입되었고 세포주기를 통해 정상적으로 진행되었다. 이에 비해 핵 기공에 대항하는 siRNA로 transfection된 세포 NUP 1 53은 MIT 진행에서 심각한 변화를 대체합니다.

세포의 유사분열 진행 타이밍을 결정하기 위해 타임 랩스 이미징 실험을 설정, 실행 및 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 적절한 온도와 CO2 농도를 유지하고 세포가 노출되는 빛의 양을 제한하여 가능한 한 세포에 부드럽게 하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.