Name: siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 siRNA 전염 후 유사분열 시간을 측정하는 시간 저속 영상 기법을 활용한 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 역학과 유사분열 단계 정량 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 미국 암 협회 (PF - 07-103 - 01 - CSM), 국립 보건원 (R01 GM61275 및 P30 CA042014), 백혈병과 림프종 사회, 헌츠먼 암 재단에 의해 지원되었다.

siRNA의 transfection과 셀 준비 <ol><li> 사용 각 잘하는 fibronectin (10μg/mL)의 0.5mL를 추가하여 4 잘 LabTek II chambered의 coverglass를 준비합니다. 상온에서 10~15분에 대한 부화. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 반대로 transfection에 대한 siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 단지를 준비합니다. (100μL 총) 사용할 수 챔버 당 24 잘 요리를 잘 하나 권장 금액을 사용합니다. siRNA의 transfection에 대한 유사 제품 / 프로토콜은 대체 수 있습니다. </li><li> chambered의 coverglass의 우물에서 fibronectin을 제거합니다. 사용 각 잘하는 siRNA / Lipofectamine RNAiMAX 단지의 100μL를 추가합니다. </li><li> 나누어지는 20,000 히스톤 H2B - mCherry - 표현 잘 transfection 혼합물을 포함하는 당 세포를 (500μL)입니다. </li><li> 세포가 정상 세포 배양 매체 1mL와 함께 transfection 혼합물을 교체하기 전에 ~ 24 시간 동안 부화 수 있습니다. </li><li> 이미지 수집하기 전에 부화는 세포 추가 24 시간 (48시간 포스트 transfection). </li></ol> 현미경 설정 및 이미지 수집 <ol start="7"><li> 이미지 수집 설정을 세 가지 주요 부분이 있습니다 : 1) 현미경의 무대에서 맞는 37의 지속적인 습기가 환경을 유지하고 세포 배양기 ° C, 5 %의 CO 2, 2) 자동 스테이지를 갖춘 바뀌 현미경, 자동 형광 및 브라이트 셔터 및 자동 필터 바퀴, 그리고 3) 소프트웨어 무대를 통합하고 제어 패키지, 셔터, 및 필터 바퀴. 우리 이미지 설정에서, 우리는 LabTek II chambered coverglass와 함께 사용할 수 있습니다 오코 연구소에서 사용자 정의 셀 인큐베이터를 사용합니다. 무대, 셔터, 및 필터 바퀴는 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어되는 힌트는 :. 오코 랩 무대 위로 보육 시스템은 다른 접시, 접시, 또는 coverslip 크기의 다양한 어댑터를 포함하고 있습니다. </li><li> , 미리 예열 및 equilibrated 인큐베이터의 뚜껑을 열고 어댑터에 chambered의 coverglass을 배치하고, 모델링 점토와 장소에서 개최하여 인큐베이터에서 LabTek II chambered의 coverglass 위치. 세포 배양 매체가 건조하지 않도록 chambered의 coverglass에 덮개를 둡니다. 뚜껑을 닫고 인큐베이터가 자리에 단단히 개최 있도록, 현미경 단계에있는 전체 배양기를 위치. </li><li> Metamorph를 사용하여 소프트웨어의 메뉴 막대에서 &quot;애플 리케이션 / 다차원 취득&quot;을 선택하여 실험을 설정합니다. 이것은 timelapse의 빈도와 길이를 선택할 수있는 창이 나타납니다, 각 색상에 대한 노출 시간 (경우 여러 설정하고), 번호와 무대 위치의 위치, 그리고 Z - 섹션의 수를 (경우 원하는). . 데이터 파일을 저장할 위치를 선택 힌트 : Metamorph 이외의 소프트웨어를 사용하는 경우, 기능이 약간 다를 수 있습니다하지만 전반적인 개념은 동일합니다. 마이크로, 대부분의 하드웨어 설정과 호환되는 오픈 소스 기반의 ImageJ 수집 소프트웨어는 훌륭한 대안입니다. </li><li> .이 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 두 가지 파장 (브라이트 및 mCherry) 15 단계 위치 힌트 8 시간 동안 매 15 분 영상을 얻은 것입니다 더 나은 시간 해상도가 원하는 경우, 다음이 인수 사이의 시간 간격을 단축할 수 있으나 , 적은 무대 위치를 사용할 수 있으며, 따라서 적은 mitotic 세포는 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 시간 간격이 계정에 필터 설정 사이를 전환할 수있는 필터 휠을에 필요한 시간을 위해 고려할 때 그것은 중요하다. </li><li> 첫째 브라이트 조명을 사용하여 전지의 분야에 초점을하여 각 파장에 대한 최적의 노출 시간을 확인합니다. . 소프트웨어에만 브라이트 채널 (이것은 각각의 인수하기 전에 각 단계의 위치에 오토포커스 소프트웨어를 수)두기에 대한 자동 초점 기능을 조정 : 우리는 석유없이도 뛰어난 해상도를 제공하는 40x 드라이 위상 대비 목표를 사용하여 . 다른 목표는 원하는 광학 해상도에 따라 사용할 수 있습니다. </li><li> mCherry 파장로 전환하여 50 밀리초 노출을 사용하여 이미지를 스냅. 좋은 이미지를 볼하는 데 필요한 최소 노출 시간을 조정합니다. 그것은 지속적인 세포 생존을 보장하기 위해 빛의 노출의 양을 제한하는 것이 필수적입니다. 일반적으로, 이것은 가장 조명 강도를 높임으로써보다 중립적인 밀도 필터 (여기 빛의 유량을 줄이기 위해)와 더 이상 카메라 노출 시간을 사용하여 얻을 수 있습니다. 사용할 수있는 추가적인 파장에 대해이 절차를 반복 힌트 :. 실험을 위해 주어진 노출에 장기 세포 생존을 확인하려면, 당신은 일시적으로 timepoint 간격을 조정하여 원하는 timelapse 이상의 세포가 살아남을 수 이미지의 총 수를 미리 볼 수 있습니다 초 분 (즉, 10 분. 10초됩니다.) 당신의 세포가 100-200 노출 (또는 살아남을 수있다면적절한 숫자) 후 노출이 괜찮습니다. 그렇지 않다면, 당신 여기 조명, 노출 시간, 또는 전체 실험을 시뮬레이션하는 이미지의 총 수를 줄일 수 있습니다. </li><li> 다음을 선택하고 셀 인구의 충분한 샘플링을 달성할 수 있도록 무대 위치의 적절한 숫자를 표시합니다. Metamorph의 위치를 기록하고 각 인수에 대해이 반환됩니다 힌트를 :. 나는 일반적으로 그들이 너무 밀도 수 있도록 많은 많은 세포의 이미지에가있는 위치를 찾으려고하지만,하지 않습니다. 또한 유사 분열을 통해 진행 세포의 대량 관찰의 좋은 기회를 얻게 될 수 있도록 충분한 위치를 선택하는 것이 중요합니다. </li><li> 모든 timelapse, 파장 노출 시간, 무대의 위치 정보가 기록된 후에는 소프트웨어가 적절하게 장비를 제어인지 확인 화면에 &quot;미리보기&quot;버튼을 선택합니다. </li><li> 당신이 만족되면, 수집을 시작하려면 화면에서 &quot;가져오기&quot;버튼을 선택합니다. 그런 다음 다시 앉아 컴퓨터와 작업을 수행하는 현미경을 허용 힌트 :. 모든 것이 제대로 작동하기 위해 인수 중 적어도 하나 둥근 통해 자동화를 관찰. </li></ol> 이미지 프로세싱 및 분석 <ol start="16"><li> 인수가 완료되면 다음 단계는 처리하기가 쉽습니다 형식으로 이미지 데이터를 전송하는 것입니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 나는 ImageJ 프로그램을 사용하여 이미지 montages를 생성하는 방법을 다음 Metamorph를 사용하여 동영상을 생성하는 방법을 보여 첫번째 것입니다. 어느 형식 부량 목적에 유용합니다. </li><li> 첫 번째 단계는 데이터를 검토하는 것입니다. 이렇게하려면, 메뉴 표시줄에서 &quot;애플 리케이션 / 검토 다차원 데이터&quot;를 선택하십시오. 파일의 위치를​​ 선택한 다음, &quot;보기&quot;를 선택하십시오. 이것은 개별적으로 각 단계의 위치에서 이미지의 스택을 검토하실 수 있습니다. 원하는 무대 위치를 선택한 다음 &quot;이미지로드&quot;. 당신은 데이터 프레임별로 프레임을 통해 사전하실 수 있습니다. </li><li> 세포가 유사 분열 (같은 DNA와 세포의 형태 모두에 의해 결정)을 통과하는 그 무대 위치 들어, Metamorph를 사용하여 영화와 montages를, 또는 ImageJ (NIH를 통해 무료로 가능)와 같은 다른 프로그램과 수 있습니다. </li><li> Metamorph에서 영화를 만들려고, &quot;프로세스 / 동영상 저장&quot;을 선택합니다 메뉴 표시줄 인치 당신은 어떤 사용하는 프레임의 속도와 동영상의 파일 유형을 선택하실 수 있습니다. 그런 다음 &quot;저장 무비&quot;를 선택하십시오. </li><li> 몽타주를 만들기 위해선, 그런 ImageJ 같은 다른 프로그램에서 사용할 수있는,. stk 파일로 이미지 스택을 저장합니다. </li><li> ImageJ에서 파일을 열고 당신은 유사 분열을 통해가는 세포를 찾을 때까지 프레임을 사전. . 세포 주변의 영역을 자르기와 &quot;이미지 / 복사&quot;를 선택 힌트 : 모든 프레임을 복제해야합니다. </li><li> 몽타주를하려면, &quot;이미지 / 스택 / 몬티지 만들기&quot;를 선택합니다 메뉴 표시줄 인치 여기 당신이 몽타주의 크기와 모양을 포함하고자하는 프레임 지정할 수 있으며 프레임 사이의 경계선을할지 여부. 다음을 선택하고 &quot;좋아&quot;누르십시오. .. TIF 파일로 몽타주를 저장하고 ImageJ 또는 Adobe 포토샵 하나에서 더 이상 처리를 할 힌트 : 쉽게 이미지 프로세싱을위한 8 비트 형식으로 Metamorph 사용하는 16 비트 형식의 몽타주 파일을 변경합니다. </li><li> 유사 분열의 다른 단계에서 시간을 계산하려면, 염색체가 적도 (prophase / prometaphase 시간), 프레임에 정렬되기 전까지는 염색체가 분리 시작할 때까지 t = 0 (DNA의 응축 또는 셀 라운딩의 첫 징후), 프레임의 수를 계산 결정 (metaphase 시간), 그리고 프레임 전지 (anaphase / telophase / cytokinesis) 평평하게 시작할 때까지. 각 mitotic 단계의 계산 시간은 각 프레임 사이의 시간 간격에 따라 달라집니다. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> 그림 1은 히스톤 H2B - mCherry을 표현 헬라 세포 라인을 사용하여 일반적인 컨트롤 siRNA의 transfection 실험에서 결과를 보여줍니다. 이러한 방법은 후반 유사 분열 1의 타이밍에 nucleoporin Nup153에 대한 예기치 않은 역할을 노출, mitotic 타이밍을 수치 효과적으로 사용되고 있습니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
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<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

이미징 및 형광 단백질 기술의 최근 발전과 함께, 라이브 영상은 세포 분석 2 일상적인 부분이되었다. GFP의 다양한 (그리고 다른 색상 변종 3) - 태그 단백질은 광범위하게 사용할 수 없거나 구성 상대적으로 쉽고 DNA / 염색체 역학 4, 5, centrosome 중복 6, cyclin B 역학을 포함하여 세포 분열의 특징의 수를 추적하는 데 사용할 수 있습니다 7, 핵 봉투 분해와 reassembly 8, 9, mitotic 스핀들 형성 10, cytokinesis 11 여러 단계. 형광 태그의 여기 / 발광 스펙트럼 호환 때 태그 단백질은 특정 사건 사이의 협력이 평가 수 있도록, 혼자 또는 조합에서 사용할 수 있습니다. 큰 공간 및 / 또는 시간적 해상도가 / 원하는 경우, 공촛점 레이저 스캐닝, 스피닝 디스크 또는 공명 검사를 사용할 수 있는지 여부를 현미경, 그리고 계속 증가 해상도 정교한 현미경 옵션의 목록은 성장을 계속하고 있습니다. 포유 동물 세포의 유사 분열의 라이브 영상도 높은 처리량 RNAi과 작은 분자 화면 12-14에 사용하기 위해 적응되었습니다. 따라서이 기술을 사용하여 하나의 초기 실험 비교적 간단 수 있지만,이 전략을 구축하기위한 가능성은 방대합니다.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>추가적인 챔버 크기 사용 가능</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top cell incubator</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>적절한 모든 챔버 사용 가능</td></tr><tr><td>Automated inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>적절한 모든 현미경 사용 가능</td></tr><tr><td>Software package</td><td>Metamorph</td><td></td><td>적절한 모든 소프트웨어 사용 가능</td></tr></tbody></table>

sirna transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

세포 조직과 유사 분열하는 동안 발생하는 염색체 역학의 변화가 밀접하게 게놈 및 세포 내용의 정확한 상속을 보장하기 위해 조정됩니다. 이러한 염색체의 움직임과 같은 유사 분열의 전형적인 이벤트가, 쉽게 특정 GFP - 태그 단백질을 표현하는 포유 동물 세포 라인의 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 개별 셀 단위로 추적할 수 있습니다. RNAi 기반의 고갈와 함께, 이것은 특정 단백질의 수준을 낮춘 후에 결함이 발생할 유사 분열의 무대 (들)을 pinpointing위한 강력한 방법으로하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 유사 분열의 타이밍에 대한 잠재적인 mitotic 규제 단백질을 파괴의 효과를 평가하기위한 기본적인 방법을 제시한다. 세포는 siRNA와 transfected 무대 위로 배양 챔버에 배치하고, 자동화된 형광 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 우리는 어떻게 아직도 이미지 montages이나 영화 중 하나를 만들기 위해 이미지 시퀀스를 처리하는 데 시간이 경과 실험을 설정하는 소프트웨어를 사용하는 방법에 대해 설명하고, 계량 및 표현 세포 라인을 사용하여 mitotic 단계의 타이밍 분석하는 방법을 mCh​​erry을 히스톤 H2B 태그. 마지막으로, 우리는 시간 경과 실험을 설계에 대한 중요한 고려 사항을 토론합니다. 이 전략은 다른 접근법을 보완하고 약물 치료를 사용하여 세포주기를 동기화 할 필요가없이 유사 분열의 인구 2) 분석과 같은 세포에서 볼 때 관찰되지 않는 운동의 변화에​​) 감도를 1의 장점을 제공합니다. 이러한 이미징 실험에서 시각 정보뿐만 아니라 유사 분열의 하위 단계가 평가 수 있습니다뿐만 아니라 외과의 세포주기 분석에서 나타나지 않을 예상치 못한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

체세포 분열 동안 발생하는 세포 조직 및 염색체 역학의 변화는 게놈과 ...의 정확한 유전을 보장하기 위해 정밀하게 조정됩니다.

체세포 분열 과정 중 발생하는 세포 구조의 변화와 염색체 역동성은 유전 정보 및 세포 구성 요소의 정확한 상속을 보장하기 위해 정밀하게 조정됩니다. 본 비디오 논문에서는 체세포 분열의 주요 사건들을 추적하는 방법이 제시됩니다. 형광 표지 단백질을 발현하는 세포주를 사용하여 개별 세포 수준에서 염색체 이동을 모니터링합니다.분열 단백질을 표적으로 하는 siRNA 전이후에는 세포 주기 변화가 나타나며, 이는 타임랩스 이미징을 통해 시각화하고 이미지 분석을 통해 정량화할 수 있습니다. 안녕하세요, 유타 대학교 헌츠맨 암 연구소의 Katie Oman 교수님 연구실 소속 Douglas Mackey입니다. 오늘은 siRNA 전이 후 세포가 유사분열을 진행하는 과정을 라이브 셀 이미징으로 관찰하는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 관심 단백질의 교란이 유사분열 진행 타이밍에 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. Four wall lab tech 2챔버 커버글라스의 각 챔버에 fibronectin 0.5 mL를 첨가하여 준비합니다.실온에서 10분에서 15분 동안 배양합니다. 그동안 역전 transfection을 위한 irna 및 lip RNAI max 복합체를 준비합니다. 각 챔버에 대한 제조사의 지침에 따라, 24-well 플레이트의 well 하나에 권장되는 양을 사용합니다.15분 후, 챔버형 커버글라스의 웰에서 피브로넥틴을 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 100 µL의 irna 복합체를 첨가하고, 500 µL에 부유시킨 20,000개의 세포를 각각의 웰에 분주합니다. 세포를 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다.다음 날 transfection 혼합물을 1 mL의 일반 세포 배양 배지로 교체한 후, 이미지 획득 전 24시간 동안 추가로 배양합니다. 이미지 획득 설정은 도립 현미경의 스테이지에 장착되며 이미지 획득 소프트웨어로 제어되는 맞춤형 세포 배양기로 구성됩니다. 이미지 획득을 준비하기 위해 배양기가 미리 가온되고 평형 상태에 도달했는지 확인하십시오.다음으로, 인큐베이터 덮개를 열고 챔버 덮개가 닫힌 상태의 세포를 어댑터에 배치합니다. 소량의 모델링 클레이를 사용하여 이를 고정합니다. 덮개를 닫고 인큐베이터가 단단히 고정되었는지 확인하며 인큐베이터 전체를 현미경 스테이지 위에 배치합니다.다음으로, MetaMorph를 사용하여 소프트웨어 메뉴 바에서 앱의 다차원 획득(multidimensional acquisition)을 선택하여 실험을 설정합니다. 이렇게 하면 이미징 파라미터를 선택할 수 있는 창이 나타납니다. 데이터 파일을 저장할 위치를 지정하십시오.그런 다음 4배 TX 건식 위상차 대물렌즈를 사용하여 명시야(brightfield) 및 m cherry 파장을 선택하고, 소프트웨어를 사용하여 세포 영역에 초점을 맞춘 뒤 명시야 채널에 대해서만 자동 초점 기능을 조정합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 매 획득 전 각 스테이지 위치에서 자동으로 초점을 맞출 수 있습니다. 첫 번째 파장의 경우, 50 millisecond 노출로 이미지를 캡처하며, 양질의 이미지를 얻기 위해 필요한 최소값으로 노출 시간을 조정합니다.세포 생존력을 지속적으로 유지하기 위해 빛 노출량을 제한하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 이는 조명 강도를 높이는 대신, 중성 밀도 필터를 사용하고 카메라 노출 시간을 늘림으로써 가장 효과적으로 달성할 수 있습니다.추가적인 파장에 대해 이 절차를 반복하십시오. 그런 다음 각 채널의 노출 시간을 설정하십시오. 다음으로, 15개 스테이지 위치에서 8시간 동안 15분 간격의 타임랩스를 지정하십시오.더 높은 시간 해상도가 필요한 경우, 획득 간의 시간 간격을 단축하십시오. 스테이지 위치를 더 많이 사용할수록 획득 시간이 더 오래 걸린다는 점에 유의하십시오. 각 시간 간격마다 세포 집단을 충분히 샘플링할 수 있도록 적절한 수의 스테이지 위치를 선택하여 표시하십시오.Metamor은 각 획득 단계마다 위치를 기록하고 지정된 위치로 복귀합니다. 타임랩스 파장 노출 후, 시간 및 스테이지 위치 정보가 지정되었습니다. 화면의 프리뷰 버튼을 선택하여 소프트웨어가 장비를 적절하게 제어하고 있는지 확인하십시오.시스템이 정상적으로 작동하는지 확인한 후, 화면의 acquire 버튼을 선택하여 획득을 시작합니다. 모든 과정이 적절하게 진행되는지 확인하기 위해 최소 한 번의 전체 획득 라운드 동안 자동화 과정을 관찰하십시오. 그 후 컴퓨터와 현미경이 작업을 수행하도록 둡니다.데이터를 검토하려면 앱에서 multidimensional data 검토를 선택하고, 메뉴 바에서 파일 위치 뷰를 선택한 다음, 스테이지 위치를 선택하십시오. 이미지 불러오기를 클릭하여 해당 위치의 이미지 스택을 검토하십시오. 이미지가 로드되면 마우스를 사용하여 프레임별로 데이터를 탐색하십시오.여기서는 Metamorph를 사용하여 유사분열 세포의 동영상을 생성합니다. Metamorph에서 동영상을 만들려면 'stack'에서 'make movie'를 선택하십시오. 메뉴 바에서 사용할 프레임, 속도 및 동영상의 파일 형식을 선택하십시오.그 다음, 몽타주를 만들기 위해 저장(save)을 선택합니다. 우선, Metamorph에서 데이터를 .stk 파일로 저장하십시오. 그런 다음 ImageJ를 실행하여 .stk 파일을 열고, 영역을 지정한 후 메뉴 바에서 이미지 자르기(image crop)를 선택하여 관심 영역(ROI)을 잘라냅니다.그다음 이미지 스택을 선택하십시오. 몽타주 만들기(Make montage)에서 포함할 프레임, 몽타주의 크기와 모양, 그리고 프레임 간 테두리 적용 여부를 지정하십시오.그런 다음 확인을 누릅니다. 몽타주를 .tiff 파일로 저장하십시오. 마지막으로, DNA 응축 또는 세포 원형화의 첫 징후가 나타나는 프레임을 T=0의 전기(prophase)로 지정하여 유사분열의 각 단계별 시간을 계산합니다.염색체가 적도면에 정렬되면 전중기(prometaphase)가 종료되며, 이후 DNA가 분리되기 시작하는 후기(anaphase)와 말기(telophase)까지 중기(metaphase)가 진행됩니다. 마지막으로 세포질 분열(cytokinesis)이 일어나며 세포들이 납작해지기 시작합니다. 히스톤(histone)을 발현하는 hilar 세포의 타임랩스 이미지입니다.H 두 BCFP가 제시되어 있습니다. 이 세포들은 대조군 siRNA가 형질전환되었으며 세포 주기를 정상적으로 진행합니다. 이와 대조적으로, 핵공 단백질 NUP 1 53을 표적으로 하는 siRNA가 형질전환된 세포들은 MIT 진행 과정에서 심각한 변화를 나타냅니다.지금까지 siRNA transfection 후 세포의 유사분열 진행 타이밍을 결정하기 위한 타임랩스 이미징 실험의 설정, 실행 및 분석 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 적절한 온도와 CO2 농도를 유지하고 세포가 노출되는 빛의 양을 제한함으로써 세포에 가해지는 자극을 최대한 최소화하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015). 이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

여기, TIP60 소진 MCF10A 유 방 상피 세포를 사용 하 여 상처 치유 분석 결과에서 셀 이동의 실시간 모니터링 하는 것이 선물이. 라이브 세포 이미징 기술 우리의 프로토콜의 구현 분석 하 고 실시간으로 단일 셀 운동 시간을 시각화 수 있습니다.

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

이 프로토콜은 크로마틴에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이질화를 보여줍니다.  화학 이량제와 텔로미어에 대미원식 백혈병 (PML) 핵 체의 형성이 입증된다. 물방울 성장, 용해, 국소화 및 조성물은 살아있는 세포 이미징, 면역 형광 (IF) 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광으로 모니터링됩니다.

텔로미어의 화학적 이산화 유발 단백질 응축수

이 프로토콜은 단일 분자 감도를 가진 DNA 이중 가닥 브레이크에서 전사를 검출하기 위하여 새로운 기자 유전자 시스템 및 실험적인 설치를 제시합니다.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

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이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

배우세요 포유류 세포에서 siRNA 전염 후 유사분열 시간을 측정하는 시간 저속 영상 기법을 활용한 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 역학과 유사분열 단계 정량 분석에 활용됩니다.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

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