플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

플라스틱 부분은 조직의 여러 유형의 파라핀 - 임베디드 또는 냉동 부분보다이 방법이 더 유용하고, 형광 항체와 보조 immunostained 수있는 조직의 얇은 부분에서 진정한 조직 형태를 유지합니다. 얼룩, 플라스틱 포함하고, sectioning에 대한 방법은이 동영상에서 보여주입니다.

안녕하세요, 제 이름은 소치 오타입니다. 저는 캘리포니아 대학교 발달 및 세포 생물학과의 Ken Cho 박사 연구실에서 박사 후 연구원으로 근무하고 있습니다. Irv I 오늘, 나는 당신에게 xenopus 배아의 단순 단면의 준비를 보여줄 것입니다.

이 절차에는 관심 분자에 대한 항체로 염색된 후기 가스 단계 개구리 배아의 이등분이 포함되며, 플라스틱에 침투하여 5미크론의 동일한 플라스틱 단면을 만듭니다. 이 절차는 면역형광 면역조직화학을 연구하거나 매우 높은 해상도의 이미지로 현장 혼성화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 좋아요, 그것들은 제가 10개 이상의 배아의 배아 플라스틱 절편에 사용하는 작고 편리한 도구입니다.

이것은 델타 팁이 있는 금속 핀셋이며 이것은 첫 번째로, 배아를 플라스틱의 방향을 잡는 데 사용할 수 있습니다. 둘째, 이것은 이 페인트 브러시와 함께 사용하여 배아를 마이크로톰에서 장착 표면으로 옮길 수 있습니다. 이것은 실리콘 고무 절연체로, 슬라이드 표면에 놓고 플라스틱 단면 배아 조각을 장착할 수 있는 물을 당깁니다.

이제 nstitute hybridization 또는 immunofluorescence detection과 같은 분석을 위해 배아를 이등분하는 방법을 보여드리겠습니다. 그리고 배아의 절반을 자르기 위해, 저는 식료품점에서 살 수 있는 이 매우 얇은 사막 격자를 사용합니다. 나는 예, 하룻밤 사이에 세포 3.7 % 공식 최고치를 고정하는 고정 배아가 있다고 생각합니다.

그리고 그것이 바로 당신이 그것을 고치는 방법은, 당신이 그것을 고치는 것은 목적에 달려 있습니다. 이것은 하룻밤 사이에 수정됩니다. 절개 교잡을 목적으로 하룻밤 고정을 할 수 있지만 배아 내부의 단백질을 감지하는 면역 형광 검출의 경우 너무 긴 고정을 권장하지 않았습니다.

그리고 저는 단백질의 세포 내 국소화에 대한 영향을 최소화하고 검출 단계에서 항체가 잘 침투할 수 있도록 과도한 고정을 피하기 위해 3.7% 형태의 높이 고정을 2시간 동안만 수행합니다. 자, 이제 저는 왼쪽과 오른쪽을 절단하는 폭발벽을 통해 이 배아를 해부하고 있습니다. 그래서 이제 저는 이것이 PO가 등쪽에서 복부 쪽까지 줄곧 있는 11기 배아를 가지고 있다는 것을 알았습니다.

이 오른손 조각을 살펴 보겠습니다. 여러분은 배측과 배쪽 모두에서 폭발 포를 볼 수 있지만, 이 침습은 분명히 배쪽 쪽에 비해 배아의 가장 깊숙한 곳, 안쪽 깊숙한 곳까지 도달하기 때문에 등쪽 쪽은 명백합니다. 그래서 이것은 등쪽과 복부 쪽을 모두 연구하기에 좋은 이등분된 조각입니다.

배아 내부, 이 절개된 배아 내부에서, 저는 배아 내부에서 발현된 단백질에 대한 면역형광 검출을 사용할 것입니다. 그리고 면역형광 또는 면역조직화학의 경우 항체 특이적 항체를 사용하여 검출합니다. 그러나 문제는 항체가 배아 내부로 잘 침투하지 못한다는 것입니다.

그래서 만약 여러분이 전체 산, 전체 산 배아를 사용한다면, 여러분은 알 수 없습니다. 배아에서 단백질의 발현 패턴을 연구할 수 없습니다. 그러나 이 사전 이등분된 배아를 사용하면 배아 내부 깊숙한 곳에 있는 세포의 발현 패턴이 무엇인지 연구할 수 있습니다.

아, 염색된 배아는 이미 3.7%의 포름알데히드에 고정되어 에탄올에서 탈수되어 테크노 7, 100이라고 하는 플라스틱에 침투했습니다. 그리고 이 키트는 이 주요 부분인 액체와 경화제 하나라고 하는 이 분말의 세 부분으로 구성되어 있습니다. 그리고 이 액체는 경화제 2라고 불렀습니다.

먼저 이 주요 부분과 경화제를 100:1 reio와 혼합하면 이 침투 혼합물이 됩니다. 그리고 그것이 바로 액체이며, 저는 이 액체에 침투합니다. 그리고 이것은 여전히 액체이므로 아직 굳지 않을 것입니다.

그리고 이것은 배아 샘플이 이 플라스틱에 완전히 요약되어 있는지 확인하기 위해 밤새 이 침투 혼합물에 남아 있는 배아 샘플입니다. 이제 저는 전사 피펫으로 이 샘플 배아 중 하나를 가져와서 임베딩 몰드로 사용하는 얇은 벽 0.5 MPCL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 이 배아에서 과도한 액체를 제거합니다.

그리고 이제 이 배아, 이 배아는 이미 경화 플라스틱에 내장될 준비가 되었습니다. 경화 플라스틱을 만들려면 이 침투 혼합물을 이 경화 튜브와 15:1로 혼합합니다. 예를 들어, 이 침투 혼합물 750마이크로리터를 튜브를 지지하기 위해 복용하면 이 경화제도 50마이크로리터를 추가하여 플라스틱을 추가한 후 플라스틱의 중합을 시작해야 합니다. 이런, 캡을 닫고 이렇게 부드럽게 섞습니다.

그리고 산소는 중합 반응의 억제제이기 때문에 와류를 해서는 안 됩니다. 이 혼합물을 약 250마이크로리터를 배아에 첨가합니다. 그리고 이 중합 단계는 거의 4시간이 걸리므로 전혀 서두를 필요가 없습니다.

이 중합 플라스틱을 먼저 첨가한 후 위아래로 파이프를 연결하여 배아가 플라스틱에 떠 있게 만들 수 있습니다. 그리고 이제 저는 이 금속 핀셋을 사용하여 배아 주위를 밀어 배아의 절단면이 이 임베딩 주형의 바닥에 오도록 배아의 방향을 잡습니다. 그런 다음 산소는 경화 반응의 억제제이므로 캡을 닫고 4시간 동안 그대로 두어 화 반응을 허용합니다.

그 후, 이것은 이미 샘플에 무리를 지은 HUD입니다. 이 플라스틱의 단단한 부분이 이 금형에서 나오지 않도록 이 샘플에 일종의 접착제를 바르십시오. 이것은 테크노 30 40이라고 하는 이 목적을 위한 접착제 역할을 하는 또 다른 플라스틱입니다.

그리고 저는 이 분말과 액체를 2, 2, 1과 섞고 있는데 여기 이 가루 0.6g이 있습니다. 그래서 저는 이 액체를 300마이크로리터 넣고, 재빨리 섞으면 이 플라스틱이 꽤 빨리 단단해집니다. 그래서 이것은 부분이며, 조금 세게 한 다음 이미 들은 이 샘플에 이것을 부어야 합니다.

이것으로 충분합니다. 캡을 닫습니다. 나는 이렇게 생겼다.

그리고 이것은 어려워지는 데 약 30-60분이 걸립니다. 그리고 이것은 행동할 준비가 된 것입니다. 먼저 판지 칼로 금형의 끝을 자르고이 금형에서이 팁 부분을 떼어냅니다.

이제 이 내장된 배아가 노출되었습니다. 그리고 또한 나는 그것이 필요하지 않기 때문에이 캡을 잘라 냈습니다. 이제 나는이 tain Roy 바늘을 가져갑니다, 나는 파린 절편에 사용되는 일반 얼룩 칼날보다 단단한 바늘 tain Roy 블레이드가 아닙니다.

나는 이것을 Xin에 잠깐 담그어 깨끗하게 만듭니다. 이것을 로 설정하고 블레이드 홀더에 이것을 설정하고 여분의 제인을 닦아냅니다. 그리고 언젠가는 이 지역의 청결이 절대적으로 중요하기 때문에 저도 제인으로 이 지역을 청소합니다.

이제 단면화할 준비가 되었습니다. 단면화를 시작하기 전에 마운팅 챔버를 설정했습니다. 이것이 슬라이드 유리입니다.

그리고 이 위에 이 실리콘 고무를 넣고 파머 푸시를 끝까지 밀어 누출이 발생하지 않도록 합니다. 그리고 이것을 슬라이드 워머에 올려 놓고 이 깨끗한 약수를 부어 수영장을 만드십시오. 그리고 홍수 표면의 물 표면을 얻을 때까지 물을 최대한 넣으십시오.

그리고 이것은 이 홍수 물 표면이 물의 표면 장력을 균등하게 분포시키기 때문에 중요하며, 이는 단면을 동일하게 확장하는 데 중요합니다. 지금 저는 절편을 하고 있지만, 그 전에 이 마스크를 쓰는데, 그 이유는 각 절편이 너무 가볍고, 너무 가볍고, 제 가슴이 무대에서 날아갈 수 있기 때문입니다. 그래서 저는 이 마스크를 씁니다.

이제 단면화를 시작합니다. 무대에서 몇 개의 섹션 조각을 얻은 후, 페인트 브러시로 이것을 가져 가고이 산 챔버 위로 천천히 이동하여이 페인트 브러시를 두드려 그 조각이 중력에 의해 물에 들어가도록합니다. 그리고 그들이 물 위에 내려 앉 자마자 그들은 물 표면에 원형 조각을 형성하기 위해 확장됩니다.

밤새 건조된 후 조명은 어떻습니까? 이제 이것과 저렇게 보입니다. 이제 샘플이 핵 DNA용 DPI와 접촉할 준비가 되었습니다.

그런 다음 현미경으로 공부할 수 있습니다. 오늘은 후기 가스 단계 개구리 배아를 사용한 플라스틱 섹션 준비를 보여 드렸습니다. 이 절차는 파렌 임베딩 기술을 사용하여 연구 할 수없는 단백질의 하위 세포 또는 국소화를 연구하는 데 매우 유용하며 일반적으로 잔류 혼성화에 대해서도 유용합니다.

이 플라스틱 단면은 또한 잔류 혼성화에 대해서도 제공하며, 이 절차는 파렌 또는 동결 단면 샘플보다 훨씬 더 높은 수준의 이미지를 제공할 수 있습니다.