Name: 플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 태아의 플라스틱 섹션 제작 방법을 통해 고해상도 면역형광 및 형태학 연구를 수행하는 기술입니다. 이 방법은 조직 구조를 보존하며 다양한 실험에 적용 가능합니다.

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정치 <ol><li> (피셔 고양이 # 03-339 - 25B) 작은 유리 섬광 병에 MEMFA 또는 3.7 % FA + PBS로 전체 배아 또는 해부 explants을 전송합니다. 그것보다 더뿐만 아니라, 2 시간, RT에서 nutator에 병을 부화합니다. 2 시간 이상 FA에서 배아를 두지 마십시오. FA의 긴 배양은 배아 조직 어렵게하고 검색 과정에서 항체의 가난한 침투가 발생합니다. </li><li> FA의 대부분을 기음과 유리병 (~ 4.5ml)의 상단에 덴트의 정착액을 추가합니다. 부드럽게 신선한 덴트의 다른 4.5ml과 덴트의에 교류를 배아를 씻어 몇 번 병을 반전하고, 적어도 48 시간 동안 -20 º C에서 알을 품다. 숙박 충분하지 않습니다. 이 단계는 항체에 대한 배아가 더 투과합니다. 배아는 몇 주 동안이 조건에 보관하실 수 있습니다. </li></ol> Immunofluorescence <ol><li> 표본을 Rehydrate. 다음과 같이 메탄올의 등급 시리즈를 품어 : <table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3"><tbody><tr><td> 75% MeOH / H 2 O </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 50% MeOH / PBS </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 25% MeOH / PBS </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10 분 </td></tr></tbody></table> </li><li> 60mm 플라스틱 요리와 1.5 % 아가로 오스 / PBS 번호판을 확인합니다. 그것이 고체 된 후 아가로 오스 위에 PBS 하거라. </li><li> 배아의 헤미 - sectioning : 1.5 % 아가로 오스 / PBS 판에서 배아를 넣어. 포셉 한 쌍의있는 배아를 잡고 얇은 면도날을 사용하여 배아의 중심을 반으로 잘라. 당신이 성공적으로 직선 절단 평면과 반으로 가지고있는 사람을 선택합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="그림 1" width="591" height="193" /> </li><li> PBT와 유리 섬광 약병에 bisected 배아를 전송합니다. 20 % 염소 혈청 + PBT의 4.5ml와 교류. nutator (차단) 2 시간 RT에서 알을 품다. </li><li> PBT의 기본 항체의 적절한 희석을 준비합니다. 이 당 샘플 0.5ml이 필요합니다. 예를 들어, 나는 5mm 플라스틱 부분에서 C - cadherin의 subcellular 지방화를 연구하기 위해 토끼 안티 - C - cadherin PAB의 2백분의 1 희석를 사용합니다. </li><li> 차단 솔루션을 기음과 희석 주 항체의 0.5ml를 추가합니다. 스티로폼 튜브 홀더에 서있는 위치에 튜브를 넣어. nutator 4 º C에서 밤새 품어. </li><li> 희석 기본 항체 (이 희석 차 항체가 저장하고 다음 1~2주에 활용할 수 있습니다)를 제거합니다. RT 4 회 (40~60분 각)의 PBT의 4.5ml로 씻으십시오. </li><li> PBT에서 비오틴 - 복합 이차 항체의 100분의 1 희석의 0.5ml와 교류. nutator 4 º C에서 밤새 품어. 빛과 비오틴을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 커버. </li><li> 이 시점에서, 치료는 어떤 표지 또는 알루미늄 호일에서 튜브를 유지, 빛, 즉로부터 시료를 보호하기 위해 이동해야합니다. </li><li> 비오틴 - 보조 항체 (이 또한 다음 1-2주에 활용할 수 있습니다)를 제거합니다. RT에서 (각 40-60분) 또는 4 회 대한 PBT의 4.5ml 씻으십시오. </li><li> PBT에서 Streptavidin (FITC, 텍사스 - 빨강, 등) 찬란 - 라벨의 200분의 1 희석의 0.5ml와 교류. nutator 4 º C에서 밤새 품어. </li><li> streptavidin을 (이것도 활용할 수 있습니다)를 제거합니다. RT에서 - (30 분 각 15) 3 회 대한 PBT의 4.5ml로 씻으십시오. </li><li> RT 30 분 3.7 % FA + PBS의 4.5ml의 배아를 수정. </li><li> 두 번 PBS의 4.5ml로 씻으십시오. </li><li> 표본을 탈수. 다음과 같이 에탄올의 등급 시리즈를 품어 : <table style="width: 172px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> 30% EtOH / H 2 O </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 50% EtOH / H 2 O </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 75% EtOH / H 2 O </td><td> 10 분 </td></tr><tr><td> 백퍼센트 EtOH </td><td> 10 분 </td></tr></tbody></table> </li><li> 표본은 빛으로부터 그것을 보호하기 위해 커버 4 개 º C 100 % EtOH에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 침투 <ol><li> Technovit 7,100 침투 믹스를 확인하십시오. 나는 보통 50ml 원뿔 튜브 기본 액체 15ml 받아를 경화제의 150mg 추가하고 15 분 동안 nutator에 락을하여 섞는다. 이 침투 믹스는 최대 1 개월 4 ° C에 보관하실 수 있습니다. </li><li> Technovit의 침투 믹스 / EtOH 콤보의 등급 일련의 교환에 의해 침투 믹스로 표본을 침투로 다음과 : <ol><li> 50% Technovit / EtOH - 1시간 </li><li> 100 % Technovit - 1시간 </li><li> 100 % Technovit - 하룻밤 </li></ol></li><li> specimeN 4 º C.에 1 개월에 대한 100 % 침투 믹스에 저장할 수 있습니다 빛을에서 그들을 보호하기 위해 샘플에 덮개를 넣어. </li></ol> 퍼가기 <ol><li> Technovit 7100 포함 믹스를 만들기 : 1.5ml 튜브에 침투 믹스의 0.75ml을 가지고 경화제 II의 50ml를 추가합니다. 반전 튜브를 여러 번하여 섞는다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 하나의 표본이 0.5ml 얇은 벽 PCR 튜브에 하룻밤에 침투 가져가라. 뜨는의 대부분을 제거합니다. </li><li> 표본이 섹션의 단계 # 1, &quot;퍼가기&quot;에서 만든 포함 믹스의 0.25ml를 추가합니다. 동양 부드럽게 재미 - 팁 해부 니들 (해부 바늘 나무 - 핸들)을 이끌어하여 튜브의 바닥에 마주 절개의 비행기를 만들기 위해 bisected 배아. </li><li> 뚜껑을 닫고 비닐은 중합 수 있도록 약 4 시간 동안 어두운 장소에서 튜브를 품어. </li><li> Technovit 3,040 믹스를 확인하십시오. 계량 접시에 분말 1g을 가지고, 액체 0.5ml를 추가합니다. 즉시 bluetip를 사용하여 분말 및 액체를 섞는다. 강화된 spacimen 위에 부어. 이 노란색 Technovit 3040은 튜브에서 나오는에서 전체 플라스틱 블록을 방지할 수 있습니다. </li></ol> Sectioning <ol><li> 크실렌과 Histoknife H 닦아 (EtOH 자주 충분하지 않습니다) 및 마이크로톰에 설정합니다. 약 45 °의 칼날을 각도. 이 지역의 청결은 sectioned 조각의 품질에 중요하기 때문에, 너무, 크실렌과 블레이드의 전면에 무대 영역을 닦아주십시오. </li><li> 튜브의 측면을 잘라 골판지 나이프를 사용하여 해제 팁 껍질. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="그림 2" width="818" height="243" /> </li><li> 마이크로톰의 척 홀더로 표본을 설정합니다. </li><li> 섹션 슬라이스에 마운트 챔버를 만들기 위해 슬라이드 유리에 &quot;언론 - 투 - 인감&quot;실리콘 절연체를 부착합니다. 단단히 깨끗한 benchtop에있는 슬라이드에 절연체를 눌러 절연체가 완전히 다른 공기 방울없이 연결되었는지 확인하기 위해 반대편에서보세요. 최대가 물의 표면, 평면 오목되지 않거나 모양으로 볼록이된다고 볼 수있는 수준으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에있는 수영장에 깨끗하고 따뜻한 DH 2 O를 (~ 40 ° C) 하거라. </li><li> 섹션 조각 만들기 시작합니다. immunofluorescence 연구, 나는 5mm 섹션 조각합니다. 목적과 신호의 농도에 따라 8mm - 현장 하이브리드화 샘플의 경우, 슬라이스의 두께는 ~ 3의 범위에서 조정할 수 있습니다. </li><li> 작은 페인트 브러쉬를 사용하여, 블레이드의 앞 단계에서 물을 장착 챔버에 섹션 조각 운반. 워터 풀 위에 슬라이스로 페인트 잡고 재미 - 팁 해부 바늘로 두드리는하여 물을 슬라이스 드롭 다운. 그것은 물의 표면을 안타로 슬라이스는 곧 둥근 모양으로 확장됩니다. </li><li> 대부분의 장착 챔버의 수면 면적이 섹션 슬라이스가 가득하면, 파스퇴르 피펫을 사용하여 물을 거의 절반까지 빨아. 샘플 완전히 건조하기 위해 슬라이드 따뜻한 하룻밤에 슬라이드를 품어. </li><li> 5 분 동안 DAPI (TE에 0.1mg/ml)의 1ml와 카운터 얼룩. 기음 DAPI는 예제를 건조. </li><li> 슬라이드에서 실리콘 고무 절연체를 제거합니다. 이제 사진은 샘플 촬영하실 수 있습니다. 4 샘플을 보관 ° 빛으로부터 보호 C를. </li></ol>

귀하의 항원이나 에피토프 태그에 대한 기본 항체 : PBT에 적절한 희석하십시오. 비오틴 - 복합 보조 항체 : 여러 업체 비오틴 - 복합 항체를 판매하고 있습니다.

플라스틱 삽입 및 xenopus laevis의 태아의 sectioning

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

플라스틱 부분은 조직의 여러 유형의 파라핀 - 임베디드 또는 냉동 부분보다이 방법이 더 유용하고, 형광 항체와 보조 immunostained 수있는 조직의 얇은 부분에서 진정한 조직 형태를 유지합니다. 얼룩, 플라스틱 포함하고, sectioning에 대한 방법은이 동영상에서 보여주입니다.

플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

안녕하세요, 제 이름은 Sochi ota입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 발생 및 세포 생물학과의 Ken Cho 박사님 연구실에서 박사후 연구원으로 재직 중입니다. 오늘은 Xenopus 배아의 단순 절편 제작 방법을 보여드리겠습니다.본 절차는 후기 가스 단계의 개구리 배아를 이분하고, 관심 분자에 대한 항체로 염색한 후, 플라스틱에 침투시켜 5 µm 두께의 동일한 플라스틱 절편을 제작하는 과정을 포함합니다. 이 절차는 매우 높은 해상도의 이미지를 통해 면역형광 면역조직화학 또는 인시츄 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 좋습니다, 여기 있는 작은 도구들은 제가 10개 이상의 배아를 플라스틱 절편 제작할 때 사용하는 편리한 도구들입니다.이것은 델타 팁이 달린 금속 핀셋이며, 첫 번째 핀셋은 플라스틱 내 배아의 방향을 잡는 데 사용할 수 있습니다. 그리고 두 번째 핀셋은 이 페인트 브러시와 함께 사용하여 배아를 마이크로톰에서 마운팅 표면으로 옮기는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 실리콘 고무 절연체로, 슬라이드 표면에 올려놓으면 플라스틱 절편으로 제작된 배아 슬라이스를 마운팅할 수 있는 워터 풀(water pull)이 형성됩니다.지금부터 인시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)이나 면역형광 검출과 같은 분석을 위해 고정된 배아를 이분하는 방법을 보여드리겠습니다. 배아를 절반으로 자르기 위해 식료품점에서 구매할 수 있는 매우 얇은 디저트 그리드를 사용합니다. 배아는 3.7% 포르말린에서 하룻밤 동안 고정된 상태입니다.고정 방법은 목적에 따라 달라집니다. 여기서는 하룻밤 동안 고정을 진행했습니다. 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 목적으로 하는 경우에는 하룻밤 동안 고정해도 괜찮지만, 배아 내부의 단백질을 검출하는 면역형광법(immunofluorescence) 검출의 경우에는 너무 오래 고정하는 것을 권장하지 않습니다.단백질의 세포 내 국소화에 미치는 영향을 최소화하고, 또한 검출 단계에서 항체가 잘 침투할 수 있도록 과고정을 방지하기 위해 3.7% 포름알데히드 고정은 2시간 동안만 진행하는 편입니다. 이제 배아의 배반벽 왼쪽과 오른쪽을 절개하여 배아를 적출하겠습니다. 확인 결과, 이는 배아의 등쪽부터 배쪽까지 PO가 전체적으로 형성된 stage 11 배아임을 알 수 있습니다.이제 이 오른

plastic-embedding-and-sectioning-of-xenopus-laevis-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

이 프로토콜은는 Xenopus laevis의의 neurulas에서 premigratory 두개골 신경 능선 (NC)를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 외식은 피브로넥틴 및 체외 배양에 도금, 또는 다시 호스트 배아에 이식 할 수 있습니다. 이 기술은 NC 상피 - 투 - 중간 엽 이행, 이주 및 분화의 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

우리는 Xenopus laevis 1세포 배아로부터 미니 배아를 만드는 물리적 수축 방법을 설명합니다.

Xenopus mini 배아를 생성하기 위한 신체 조작

배우세요 Xenopus laevis 태아의 플라스틱 섹션 제작 방법을 통해 고해상도 면역형광 및 형태학 연구를 수행하는 기술입니다. 이 방법은 조직 구조를 보존하며 다양한 실험에 적용 가능합니다.

플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

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