Name: β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42와 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 학습하세요 해마 조각에서 시냅틱 가소성 장애를 유도하는 Aβ 1-42 올리고머 준비 방법을. HFIP와 DMSO를 사용한 이 프로토콜은 알츠하이머병 병리 연구 및 약물 스크리닝에 활용됩니다.

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이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중 NIH 국립 연구소 (NINDS) (NS049442)에 의해 지원되었다.&gt;

Resuspending β - 아밀로이드 펩타이드 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> Aβ 1-42 (동결 건조된 분말) </li><li> 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP) </li><li> 낮은 결합 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브 (1.5 ML) </li><li> 테플론 동작 정류장 (250 μl)와 GasTight 해밀턴 주사기 </li><li> Dimethylsulfoxide (DMSO) </li></ul><ol><li> 동결 건조된 Aβ 1-42은 펩타이드 병을 열 때 응축을 피하기 위해 30 분 실온에서 평형 수 있습니다. </li><li> 펌 후드 아래, 1 MM 솔루션과 몇 초 동안 와동 솔루션을 얻기 위해 추운 얼음 HFIP에서 Aβ 1-42 펩타이드를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 테플론 플러그와 유리 GasTight 해밀턴 주사기를 사용하여 신속하게 동일하게 세 폴리 프로필렌의 튜브에 Aβ 1-42 / HFIP 솔루션을 분할하고 튜브를 밀봉. </li><li> 튜브는 다음 Aβ monomerization 수 있도록 2 시간 incubated 수 있습니다. 다음 튜브를 열고 맑은 펩타이드 영화는 유리병의 하단에 관찰된 때까지 SpeedVac 원심 분리기 (800g, 실온)을 사용하여 진공에서 Aβ 1-42 / HFIP 솔루션을 집중. (최대 25 ° C) 펩타이드 저하를 피하기 위해 Speed​​Vac 원심 내부 신중하게 온도를 확인합니다. </li><li> 튜브를 밀봉하고 -80에서 aliquots를 저장 ° C. Aβ 영화는 6 개월 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 5 MM Aβ 1-42까지 농도를 얻을 DMSO를 추가하여 한 영화를 다시 일시 중지합니다. 다시 정지 완성하기 위해 10 분 동안 물 목욕으로 Sonicate. </li><li> 폴리 프로필렌의 튜브로 나누어지는이 5mM Aβ 1-42 솔루션입니다. 모든 튜브를 밀봉하고 -20 ° C.에 그들을 저장 Aliquots는 한 번만 해동해야합니다. 냉동실 내부에 물이 응축주의. 솔루션에서 펩티드 아주 쉽게 저하. </li></ol> Oligomerization 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> Aβ 1-42 / DMSO (5mM) </li><li> 멸균 인산 버퍼 </li><li> 낮은 결합 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브 (1.5 ML) </li><li> 낮은 결합 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 (50 ML) </li></ul><ol><li> 얻은 5mM Aβ 1-42 / 멸균 인산 버퍼 (최대 100 μl)와 DMSO의 나누어지는을 희석. </li><li> 30 초 동안 소용돌이 그리고 4에서 12 시간 동안 품어 ° C </li></ol> Hippocampal 슬라이스 처리 hippocampal 조각 치료 때, 비커, 재관류 튜빙 표면 및 녹음 챔버에 비 특정 펩타이드의 부착을 방지하는 것이 중요합니다. 낮은 결합 폴리 프로필렌 튜빙과 용기 우선적으로 사용합니다. 유리 또는 플라스틱 - 도자기 일반의 사용을 피하십시오. 재관류 미디어는 혈청 또는 알부민 무료되어야합니다. Aβ 재관류 시작하기 전에 준비했습니다 : <ul><li> Oligomerized의 Aβ 1-42 </li><li> 레코딩 버퍼 (㎜의 : 124 NaCl, 4.4 KCl, 1 나 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 포도당) </li><li> 인터페이스 챔버로 설정 Electrophysiological 기록 </li><li> 최소 90 분간 사후 해부를위한 산소 기록 버퍼에 incubated 트랜스 hippocampal 조각 (T = 29 ° C, 지속적인 재관류 율은 = 2 ML / 분) </li></ul><ol><li> 바로 전에 실험, 사전 산소 기록 버퍼와 폴리 프로필렌 튜브에서 해당 작업 농도 (200 NM 이상)에 oligomerized의 Aβ 1-42 나누어지는을 희석. </li><li> 시냅스 소성의 유도 전에 조각 20 분 동안 Aβ 1-42 솔루션을 Perfuse. </li></ol> 소성의 유도 및 후속 <ol><li> 일반적으로 시냅스 소성의 가장 널리 사용되는 모델은 LTP입니다. 이것은 해마에 주어진 버렸네의 파상풍의 자극을 통해 유도하실 수 있습니다. 우리는 샤퍼의 부수적인 전망과 지층의 radiatum의 CA1 피라미드 뉴런 사이의 시냅스에서 현장 응답을 기록합니다. 우리 파상풍의 자극을 15 초 간격으로 구분된 세 열차를 포함하는 세타 버스트 자극으로 구성되어 있습니다. 각 열차는 각 버스트은 100 Hz에서에서 5 펄스를 수반 5 Hz에서 10 파열로 구성되어 있습니다. oligomerized Aβ의 재관류가 완료되어 즉시 파상풍의 자극을 적용합니다. </li><li> 파상풍의 자극은 정상적인 녹음 버퍼와 재관류로 다시 전환 직후. 실험 기간에 걸쳐 지속적인 관류 속도, 기록 챔버 온도와 적절한 산소를 유지합니다. </li></ol> 대표 결과 및 가능한 문제 스타인 동부 표준시 콜의 전통적인 프로토콜입니다. 1에 따라 oligomerized Aβ는 Aβ 단량체 및 다양한 다른 크기의 oligomers를 생성S (이량체, trimer, 등) oligomerized의 재관류 제어 조각에 비해 Aβ - 취급 조각 감소 LTP에 Aβ 1-42 연결됩니다. 제어 조각에 LTP 가치가있는 동안 3~5개월 된 C57BL/6J 남성 마우스가 사용하는 우리의 실험 조건에서 LTP 200 NM에서 Aβ - 처리 슬라이스는 파상풍 자극 이후 두 시간에 기준 값을 평균 1백50%에 baseline2의 평균 200~250%에. 어떤 경우에는 Aβ와 치료 hippocampal LTP을 줄이기 위해 실패할 수 있습니다. 발생할 수있는 몇 가지 중요한 오류가 Aβ 농도와 불완전 oligomerization 동안 건조 과도한 필름을 포함합니다. hippocampal 조각의 Aβ 재관류는 우려 때문에 플라스틱이 아닌 특정 부착하는 경향이있다 솔루션 Aβ 펩타이드의 물리 특성의 또 다른 원천이 될 수 있습니다. 이러한 문제의 해결은 아래 설명되어 있습니다.

<ol><li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li>
<li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA%2FCREB+pathway+and+long-term+potentiation%3A+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li>
<li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li>
<li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li>
<li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li>
<li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li>
<li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li>
<li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li>
<li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li>
<li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li>
</ol>

동물 실험은 컬럼비아 대학 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

위에서 설명한 바와 같이, oligomeric Aβ의 준비에 몇 가지 문제가 손상되지 않은 LTP가 발생할 수 있습니다. Aβ 열화 또는 Aβ oligomerization의 부족이 발생했을 수 있는지 여부를 평가하는 한 가지 방법은 트리스 - Tricine 페이지 웨스턴 / 모래 바닥 분석 및 분석 ultracentrifugation (이 프로토콜에서 설명하지 않은)를 사용하여 Aβ 준비를 평가하는 것입니다. 서양 모래 바닥 샘플 non-denaturing/non-reducing 조건 하에서 준비가되면, 성공적인 준비 단량체와 다른 oligomers 3에 해당하는 대역을 갖춘 서양 모래 바닥 서명을 생성한다. 자주 발생하는 문제는 Speed​​Vac 농축기에서 건조 단계에서 펩타이드 불안정성이다. 사실, 고온 건조는 갈색으로 표시 펩타이드의 착색에 의해 눈에 띄게, 단백질 저하로 연결됩니다. HFIP 솔루션의 농도는 신중하게 상온에서 실시하고 모니터링할 수 있습니다. 프로토콜에서 발생 몇 가지 절차적 단계를...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946; 1-42 (동결건조) </td><td>American Peptide</td><td>62-0-80</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>52517</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Biotium, Inc.</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>50mL 폴리프로필렌 원심분리관</td><td>Corning</td><td>05-538-67</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml MaxyClear 마이크로튜브 Maximum recovery</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (Phosphate-Buffered Saline) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>GASTIGHT 주사기 250 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>1725</td><td></td></tr><tr><td>배스 초음파 세척기 (Bath sonicator)</td><td>Branson</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 농축 시스템</td><td>Various</td><td>SC 110A</td><td></td></tr></tbody></table>

β - 아밀로이드 oligomeric의 준비 1-42</subhippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

시냅스 연결의 장애가 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 발생하는 미묘한 amnesic 변경 사항을 기초로 가능성이 높습니다. β - 아밀로이드 (Aβ), AD 높은 금액에서 생산되는 펩티드는 세포가 학습과 기억의 상관 관계를 장기 Potentiation (LTP)을 감소시키는 것으로 알려져 있습니다. 사실, Aβ에 의한 LTP 장애는 AD 모델과 같은 신경 손상을 완화하거나 되돌리는 능력 심사 약물에 대한 신경 장애를 공부에 유용한 실험 패러다임이다. 연구 Aβ는 oligomeric 양식을 통해 우선적으로 LTP 장애를 생산하는 것으로 나타났습니다. 여기 oligomerized 합성의 재관류에 의해 급성 hippocampal 조각에 Aβ1 - 42 펩타이드를 혼란 LTP에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 oligomeric Aβ의 준비를위한 단계별 절차를 설명합니다<sub&gt; 1-42</sub&gt;. 그렇다면, 우리는 LTP가 oligomerized Aβ에 노출 hippocampal 조각 축소되는 개별 실험을 수행<sub&gt; 1-42</sub&gt; 노 Aβ 제어 실험에서 조각에 비해<sub&gt; 1-42</sub&gt; 노출이 발생했다.

알츠하이머병 중 하나는 기능은 Aβ의 상승입니다<sub&gt; 1-42</sub&gt; 펩타이드. 여기 합성 Aβ를 준비를위한 프로토콜을 제공합니다<sub&gt; 1-42</subhippocampal 장기 Potentiation을 impairs&gt; oligomers는, 세포의 메모리 상관 관계. 이 절차는 Aβ 유발 병리학 및 약물 검사의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

시냅스 연결의 손상은 알츠하이머병(AD) 초기 단계에서 발생하는 미세한 기억 상실 변화의 근본 원인일 가능성이 높습니다. ...

합성 beta amyloid 1 42를 HFIP에 재현탁하여 먼저 펩타이드를 단량체화한 후, 나중에 막 형태로 농축하여 리그먼트화를 진행합니다. 이 막을 DMSO에 재현탁하고 인산염 완충액으로 희석하여 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 올리고머 펩타이드를 기록 완충액으로 희석하여 급성 해마 슬라이스에 관류시키고, 시냅스 가소성에 미치는 beta amyloid 노출의 효과를 평가합니다.뉴욕시 컬럼비아 대학교의 Avio Orio 연구실에 오신 것을 환영합니다. 안녕하세요, 오늘은 Stein과 동료들이 2003년에 처음 제안한 프로토콜을 바탕으로 저희가 최적화한 올리고머화된 beta amyloid 제조 절차를 보여드리겠습니다. 본 연구실에서는 amyloid beta로 유도된 시냅스 기능 장애를 연구하기 위해 이 절차를 사용하였습니다.그럼 시작해 보겠습니다. 흄 후드 내에서 바이알을 열 때 결로 현상이 발생하는 것을 방지하기 위해, 동결 건조된 beta amyloid 분말 바이알을 실온에서 30분 동안 방치하십시오. 바이알을 열고 차가운 HFIP를 첨가하여 beta amyloid의 최종 농도가 1 mM이 되도록 조절하십시오.바이알을 닫고 볼텍싱하여 혼합한 후, Hamilton 시린지를 사용하여 용액을 세 개의 저결합 폴리프로필렌 마이크로 원심분리 튜브에 빠르게 균등하게 분배합니다. 튜브를 닫고 상온에서 2시간 동안 배양하여 펩타이드가 혼합되도록 합니다. 튜브를 열어 speed vac에 넣고 용액을 농축합니다. 진공 상태에서 800 Gs로 약 15분 동안 원심분리합니다.단백질 분해를 방지하기 위해 온도가 25 °C를 넘지 않도록 주의하십시오. 튜브 바닥에 투명하고 건조한 펩타이드 막이 보이면 원심분리가 완료된 것입니다. 막이 잘 보이지 않을 수 있으므로 튜브를 밀봉하고, 사용하지 않은 분주액은 후드 내 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 펩타이드 막을 최종 농도 5 mM이 되도록 DMSO로 재현탁한 후, 워터 배스에서 10분 동안 초음파 처리하십시오.펩타이드의 완전한 재현탁을 보장하기 위해 5 mM $\beta$-amyloid 용액을 1.6 $\mu$L씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 각 분주액은 단 한 번만 해동해야 합니다. 실험 전날 5 mM $\beta$-amyloid 용액 분주액 하나를 해동하고, 멸균 인산 완충액 98.4 $\mu$L를 추가하여 최종 부피를 100 $\mu$L로 맞춥니다

preparation-oligomeric-amyloid1-42-induction-synaptic-plasticity

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신경과학

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