β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 _{1-42와 유도}

합성 beta amyloid 1 42를 HFIP에 재현탁하여 먼저 펩타이드를 단량체화한 후, 나중에 막 형태로 농축하여 리그먼트화를 진행합니다. 이 막을 DMSO에 재현탁하고 인산염 완충액으로 희석하여 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 올리고머 펩타이드를 기록 완충액으로 희석하여 급성 해마 슬라이스에 관류시키고, 시냅스 가소성에 미치는 beta amyloid 노출의 효과를 평가합니다.

뉴욕시 컬럼비아 대학교의 Avio Orio 연구실에 오신 것을 환영합니다. 안녕하세요, 오늘은 Stein과 동료들이 2003년에 처음 제안한 프로토콜을 바탕으로 저희가 최적화한 올리고머화된 beta amyloid 제조 절차를 보여드리겠습니다. 본 연구실에서는 amyloid beta로 유도된 시냅스 기능 장애를 연구하기 위해 이 절차를 사용하였습니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 흄 후드 내에서 바이알을 열 때 결로 현상이 발생하는 것을 방지하기 위해, 동결 건조된 beta amyloid 분말 바이알을 실온에서 30분 동안 방치하십시오. 바이알을 열고 차가운 HFIP를 첨가하여 beta amyloid의 최종 농도가 1 mM이 되도록 조절하십시오.

바이알을 닫고 볼텍싱하여 혼합한 후, Hamilton 시린지를 사용하여 용액을 세 개의 저결합 폴리프로필렌 마이크로 원심분리 튜브에 빠르게 균등하게 분배합니다. 튜브를 닫고 상온에서 2시간 동안 배양하여 펩타이드가 혼합되도록 합니다. 튜브를 열어 speed vac에 넣고 용액을 농축합니다. 진공 상태에서 800 Gs로 약 15분 동안 원심분리합니다.

단백질 분해를 방지하기 위해 온도가 25 °C를 넘지 않도록 주의하십시오. 튜브 바닥에 투명하고 건조한 펩타이드 막이 보이면 원심분리가 완료된 것입니다. 막이 잘 보이지 않을 수 있으므로 튜브를 밀봉하고, 사용하지 않은 분주액은 후드 내 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 펩타이드 막을 최종 농도 5 mM이 되도록 DMSO로 재현탁한 후, 워터 배스에서 10분 동안 초음파 처리하십시오.

펩타이드의 완전한 재현탁을 보장하기 위해 5 mM $\beta$-amyloid 용액을 1.6 $\mu$L씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 각 분주액은 단 한 번만 해동해야 합니다. 실험 전날 5 mM $\beta$-amyloid 용액 분주액 하나를 해동하고, 멸균 인산 완충액 98.4 $\mu$L를 추가하여 최종 부피를 100 $\mu$L로 맞춥니다. 30초 동안 볼텍싱하고 4 °C에서 12시간 동안 배양하십시오. 응집이 시작되도록 실험 전 신선한 해마 용해물을 90분 동안 배양하십시오.

표준 기록 버퍼에서, 자극 전극은 shafer's collaterals에 배치하고 기록 전극은 stratum radium에 배치합니다. 반응이 확인되고 베이스라인이 10분 동안 안정되면, all liga beta amyloid를 200 nM로 희석합니다. 기록 버퍼 내에서 beta amyloid는 유리에 비특이적으로 결합하므로, 가능한 한 플라스틱을 사용하십시오.

베타 아밀로이드 용액을 슬라이스에 20분 동안 관류합니다. 선호하는 tone X 자극을 가합니다. 예를 들어, 테타 버스트 자극을 준 직후 테타누스 자극을 가한 후 일반 기록 버퍼로 관류를 전환합니다.

파지진(tetanus) 후 최소 2시간 동안 기록을 모니터링하여 LTP 유도를 확인하고 베타 아밀로이드 처리의 효과를 관찰하십시오. 지금까지 해마 슬라이스에서 시냅스 가소성 손상을 유도하기 위한 올리고머형 베타 아밀로이드 1-42 준비 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 펩타이드 필름을 과도하게 건조시키면 응집(aggregation)이 불완전해질 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

비특이적 펩타이드 결합을 방지하기 위해 베타 아밀로이드 용액에는 플라스틱 용기를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.