Name: 단일 유닛 생체내에서 레코딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 쥐의 시각교에서 망막 신경절세포 활동전위를 생체내 기록하는 방법을. 텅스텐 도금 유리전극을 사용하여 얇은 축삭에서 고신호대잡음비 기록을 수행합니다.

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우리는이 실험 기술의 발전 중에 기술 입력을 제공하는 박사 댄 그린 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH 그랜트 R01 - EY016849A와 스미스 패밀리 새로운 탐정 수상에 의해 지원되었다.

부품 I : 텅스텐 - 인 - 유리 전극 제작 <ol><li> 흑연 반지 나트륨 질산 (0.71g/mL)와 물 1 녹아 수산화 칼륨 (0.34g/mL)의 집중 솔루션으로 가득한 비커에 배치되며, 비커는 수정된 재봉틀의 바느질 겨드랑이 위치 . </li><li> 텅스텐 와이어 (0.5mm 직경 6cm 길이)가 부분적으로 솔루션 (1-2cm) 잠겨 있도록 바느질 팔이 테이프로 붙여져 있습니다. </li><li> 2V은 흑연 반지에 바느질 팔과 부정적인 리드에 긍정적인 리드를 부착하여 텅스텐 와이어에 걸쳐 적용됩니다. </li><li> 재봉틀이 켜져 있고 텅스텐 와이어는 electrolytically 샵 포인트로 금속을 파 놓았 2 분에 대해 ~ 4Hz의 속도로 솔루션에 반복적으로 감소합니다. </li><li> 에칭 와이어는 수동 micromanipulator과 유리 피펫 (0.25mm OD, 0.175mm ID) 유리 풀러와 1mm 팁로 뽑았의 샤프트와 미세한지도 (40x 배율)에서 정렬 지점에 배치됩니다. 와이어 삽입하는 동안 움직임을 방지하기 위해 유리가 일시적으로 퍼티로 현미경 단계로 보안이됩니다. </li><li> 와이어는 조심스럽게 축 아래, 유리의 unpulled 끝에 고급이며, 1μm 개방을 통해 유리의 작은 조각은 유리에 텅스텐의 꽉 맞는를 나타내는, 비디오 팁을를 끊다을 볼 수 있습니다. 와이어 쥐 광섬유 레코딩을위한 팁 이외 5-10밀리미터 주변 연장해야합니다. </li><li> Cyanoacrylate는 유리의 unpulled 끝에 적용되고 1MΩ 전극은 일반적으로 최고의 작품 어디 경화 후 전기 임피던스가 측정됩니다. </li></ol> 부 II : Stereotaxic 설치 및 스파이크 기차 레코딩 <ol><li> 자극 디스플레이 시스템은 위치와 두뇌에 전극을 낮추는위한 stereotaxic기구 및 microdrive와 함께 비디오에 그림입니다. </li><li> 망막 스파이크 열차 레코딩을 수행하려면 생쥐가 anesthetized 나중에 마비입니다. 표준 절차 (삽화가되지 않음) 약물 전달 및 마비 동안 기계적 환기를위한 tracheal (Y - 튜브) 정맥의 대퇴 정맥의 정맥의 삽입 수술을 위해 사용됩니다. 실험 동물 터미널입니다. </li><li> 준비 절차 후, 동물은 난방 담요에 위치하고 있으며 머리는 귀 및 치아 바와 같은 쥐의 뇌 아틀라스 2 정의 stereotaxic 위치에 고정됩니다. </li><li> 직장 프로브가 삽입됩니다, 이것은 37 체온을 유지 homeothermic 제어 장치 ° C. 통해 난방 담요를 제어 </li><li> 심전도 및 모니터 심장 박동수를 측정하는 리드와 같은 금속 바늘이 사용됩니다. </li><li> 피부는 두개골 위에 개설하고 두개골 플레이트의 교차로는 (bregma) 노출됩니다. 맞춤 디자인 크로스바 프레임이 위치에 설정, 원형이 크로스바에 구멍 begma 주변 두개골에 표시된이며, 크로스바가 일시적으로 제거됩니다. </li><li> stereotaxic 시스템은 bregma 통해 안내 바늘을 위치하여 보정합니다. 5 mm 구멍이 표시된 위치에 두개골에 몰락하고 뼈가 두뇌를 노출, 제거됩니다. 퍼티 얇은 반지는 장소로 재설정됩니다 크로스바에 구멍 주위에 도장을 형성하기 위해 두개골에 구멍 주위에 배치됩니다. </li><li> 동물이 잠시 마취의 안정적인 비행기에있다면, 그것은 데이터 수집 중에 눈동자의 움직임을 방지하기 위해 중풍로 주입됩니다. 호흡 후 동물 기계적 통풍이 중지됩니다. 사용자 지정 프로그램은 실험을하는 동안 환기 및 생리 매개 변수를 추적하고 매개 변수가 정상 수준 밖에 나가서해야 보상 조치가 필요한 경우 실험자을 알려줍니다. </li><li> 가이드 바늘은 텅스텐 전극과 backloaded과 두뇌로 저하됩니다. 뇌 침투 후 크로스바 구멍은 한천 (표시되지 않음)으로 가득합니다, 그리고 microdrive 조립은 기계적 안정성에 대한 크로스바에 고정되어 있습니다. 팁는 광학 chiasm가있는 두개골 아래 8~9밀리미터에 대한 때까지 텅스텐 전극은 다음 가이드 바늘 아웃 (2μm/sec) 천천히 고급입니다. </li><li> 망막 신경절 세포에 속하는 스파이크 열차는 Visual 입력 자신의 반응에 의해 식별됩니다. 단일 광섬유의 분리시 기록된 세포의 수용 필드는 시각적 공간에서 매핑이며 응답 특성은 표류 통같이 또는 관심의 다른 시각적 패턴과 특징. 시스템의 안정성을 몇 시간 3의 단일 단위 레코딩을 허용합니다. </li></ol> 자료 성인 브라운 - 노르웨이 쥐 (250~400g)은 상업적인 공급 업체로부터 구입하여 규제 (12분의 12) 진한 / 라이트 사이클에 따라 보관되어 있었다. 마취는 마취제 하이드로 클로라이드와 xylazine (70과 2 MG / kg, 각각, 헨리 Schein 병원)의 intraperitoneal 주사로 유도하고 exper의 기간 동안 유지되었다카테터를 통해 정맥 호수 덱스 트로 오스와 혼합 마취제와 xylazine의 주입 (30 1 MG / ㎏ / HR) 및 gallamine의 triethiodide (40 MG / ㎏ / HR, 피셔 부동산) (0.13mm OD, 작은 부분 병원과 iment 오른쪽 대퇴 정맥에서). Gallamine는 눈동자의 움직임을 마비하는 혼합물에 포함되어 있습니다. 심장 박동과 혈압 변화에 의해 평가로 마취의 안정적인 비행기를 유지하는 데 필요한 같은 펌프 (WPI 병원)의 주입 속도가 조정되었습니다. 마비 후, 동물은 기계 최종 조류 CO 2 인 - 라인 측정 유지하기 위해 필요에 따라 조정 속도, 60-80 심호흡 / 분 (2cc 볼륨)에 tracheal 정맥을 통해 (하버드 장치, 모델 683) 통풍이되었습니다 capnometer (Novametrix 병원, 모델 710Sp) 30 %. 체온은 homeothermic 담요 제어 시스템 (하버드 장치 병원)​​을 통해 규제되었습니다. 체온, 최종 갯벌 CO 2, 심장 박동과 혈압이 지속적으로 LABVIEW 프로그램에 의해 실험을하는 동안 모니터링했다. 시각적 자극은 800x600 이상 픽셀의 해상도와 100 Hz에서에서 실행 소니 Multiscan 17e CRT 모니터 (30 CD / m 2의 휘도를 의미)에 발표했다. 데이터 수집 및 모니터 출력은 비디오 이미지 프로세서 (캠브리지 연구 시스템 병원, 비트 + +)와 Psychophysics 도구 상자 4 함께 Matlab와 LabView로 작성된 사용자 정의 소프트웨어와 제어했습니다. 동물 콘택트 렌즈 (안구 인스 트루먼 트의 병원)을 통해 16.5cm의 거리에 자극 디스플레이 (40.4 X 30.2 cm) 조회하고, 안과 솔루션은 촉촉한 눈을 유지하기 위해 실험 기간 동안 주기적으로 적용되었다. 자극에 액세스할 수 시야는 (공동 스토엘팅) 부동 테이블 (TMC 병원)의 표면 위에 고가 14cm stereotaxic 장치에있는 동물을 장착하고 함께 테이블에 옮겨 맞춤 설계 썰매에서 모니터 설정을 반대하여 최대화했습니다 코가에 대한 ± 100 데그 아크. 이것은 60 - 데그 이상 및 35 데그 눈높이 아래와 ± 42 - 데그 옆으로 모니터의 중심에서 확장 repositionable 표시 필드를 제공합니다. 텅스텐 electodes은 유리 팁을 형성하는 데 사용된 작은 부분 부동산과 프리드리히와 딤막 주식 회사 표준 micropippete 풀러 (셔터 인 스트 루먼트, 모델 P - 97)에서 얻은 사용자 borosilicate 유리에서 얻은 철사로 조작했다. 전극 임피던스 시험기는 박 - 전자에서 구입한했다. 전극은 전동 microdrive 시스템 (뉴 포트 병원, StepperMike)와 고급되었습니다. 심전도 및 시신경 신호는 높은 입력 임피던스 multielectrode 증폭기 (FHC 병원, X - 셀 3x4)으로 증폭하고 필터링되었습니다. 심장 박동은 윈도우 discriminator (WPI 병원, 모델 121)을 발견했다. 신경 행동 잠재력은 디지털 대못 discriminator (FHC 병원, APM)에 의해 0.1ms 해상도 감지와 시간 스탬프를했다. 스파이크 스파이크 discriminator은 시간이 자극에 잠겨 있었 있도록 비디오 이미지 프로세서에서 트리거 신호에 의해 문이되었다.

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

모든 실험 절차는 보스턴 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

광섬유 레코딩이 그대로 눈에 필요한 망막 정보 인코딩 및 전송에 관한 실험적 질문을 해결하기위한 매력적인 접근 방식입니다. 전극은 광학 chiasm이나 교차 및 교차되지 않은 시신경 섬유의 활동이 하나의 전극 침투로 기록될 수 트랙트의 위치에있는 경우 또한, 두 눈의 신호 특성이 거의 같은 생리적 상태에서 공부하실 수 있습니다. 광섬유 레코딩은 그들의 작은 크기에 아마도 때문에 설치류 같은 비전 연구에 사용되는 다른 인기있는 동물 모델에서 고양이의 공통점지만 없습니다. 우리는 쥐를의 단일 섬유 움직임에 성공할 수 있었던 없음 중 유사한 임피던스와 소재의 상업 전극의 다양한 시도가, 우리의 전극 수와 같은 몇 시간을 위해 녹음을 혼자하자. 이것은 전형적인 상업 자들의 넓은 무딘 팁 반대로 긴 날카로운 팁을 가지고 우리의 전극,의 특정 기하학이 신경절 세포 축삭 스파이크 열차의 신뢰성과 안정 절연을 위해 중요하다는 것을 의미합니다. 이 전극을 조작하는 방법을 보여주는 이외에도, 우리는 생체내 영상 neurophys...

단일 유닛 생체내에서</em암흑의 광학 chiasm에서> 레코딩

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

시각 세계에 대한 정보가 시신경을 만들어 망막 신경절 세포 axons의 행동 잠재력의 시퀀스에있는 두뇌에 전송됩니다.<em&gt; 생체내에서</em여러 동물 모델에서 신경절 세포 스파이크 열차&gt; 녹음 방법은 초기 시각 시스템 프로세스에 대한 알려진 무엇의 많은 발표와 시각 정보를 인코딩합니다. 그러나, 녹음 작은 직경 axons에 의해 해고 스파이크를 감지에 어려움을 가능성 때문에 가장 일반적인 동물 모델 중 하나 쥐에서 희귀되었습니다. 쥐를 포함한 여러 망막 질환 모델은 intraocular 또는, 시선을 방해하지 않고 신경절 세포의 기능 특성을 특성화를위한 필요 동기를 부여<em&gt; 체외에서</em&gt; 녹음. 여기, 우리는 anesthetized 암흑의 광학 chiasm에서 기록 신경절 세포 스파이크 열차에 대한 방법을 보여줍니다. 우리가 먼저 쥐의 단일 신경절 세포 axons에서 전기 활동을 선택할 수 있습니다 텅스텐 - 인 - 유리 전극을 조작하는 방법을 보여줍니다. 전극은 우리가 시도해야하는 모든 상업 사람 들보다 뛰어난 실력을 보이고. 그러면 우리의 맞춤 설계 stereotaxic 시스템을 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; 비주얼 neurophysiology 실험 및 동물 준비 및 광학 chiasm의 신뢰성과 안정적인 전극 배치를위한 절차.

망막 신경절 세포는 눈의 작업 잠재력의 시퀀스와 뇌로 영상 정보를 전송. 여기, 우리는 하나의 신경절 세포의 활동 잠재력을 기록하는 방법을 보여줍니다<em&gt; 생체내에</em&gt; anesthetized 쥐에서.

단일 유닛 생체내에서</em암흑의 광학 Chiasm에서> 레코딩

시각 세계에 대한 정보는 시신경을 구성하는 망막 신경절 세포 축삭 내의 활동 전위 시퀀스 형태로 뇌에 전달됩니다.

오늘은 저희가 개발한 쥐의 시신경 교차부(optic chiasm) 내 생체 내(in vivo) 기록 시스템을 시연하겠습니다. 시신경을 구성하는 망막 신경절 세포의 축삭은 매우 가늘어 개별 세포로부터 기록하는 것이 어렵기 때문에, 쥐를 이용한 이러한 유형의 기록은 매우 드물었습니다. 하지만 쥐는 망막 변성의 일반적인 동물 모델이므로, 이러한 기록 방식은 매우 유용한 정보를 제공할 잠재력이 큽니다. 이러한 기록을 가능하게 한 핵심은 저희가 설계한 텅스텐 염색 유리 전극으로, 길고 날카로운 팁을 통해 얇은 직경의 축삭으로부터 높은 신호 대 잡음비로 활동 전위를 기록할 수 있습니다.전극의 제작 과정과 함께 동물을 정위 고정 장치에 세팅하는 방법을 안내하고, 단일 신경절 세포로부터 스파이크 트레인을 기록하는 예시를 보여드리겠습니다. 전극 제작에는 세 가지 주요 장비가 필요합니다. 마이크로 피펫 제작을 위한 표준 유리 블로워, 텅스텐을 날카롭게 다듬기 위한 재봉틀, 그리고 40 x 대물렌즈가 장착된 표준 현미경이 필요합니다.또한, 극이 부착된 흑연 링이 필요하며, 이를 수산화칼륨과 질산나트륨의 농축 용액에 배치합니다. 이를 재봉기 암(sewing arm) 아래에 놓고, 텅스텐 와이어의 얇은 조각을 재봉기 암에 테이프로 고정하여 용액에 부분적으로 담급니다. 그런 다음, 한쪽 끝의 흑연 극에서 재봉기 암으로 연결되는 리드선을 연결합니다.나머지 두 단자에 전압을 인가하고 재봉틀을 작동시킵니다. 이렇게 하면 텅스텐이 용액에 담기며 2분 동안 전자기적으로 연마됩니다. 텅스텐 연마가 완료되면 재봉틀 암(arm)에서 조심스럽게 제거한 다음, 물에 담가 과잉 용액을 씻어내고 40 x 대물렌즈의 현미경 아래에 놓습니다.유리 마이크로 피펫은 직경이 약 1~2µm인 작은 구멍이 있습니다. 그 다음, 끝을 뾰족하게 만든 텅스텐을 마이크로 피펫의 뒷부분에 조심스럽게 삽입하고 기계식 마이크로 매니퓰레이터로 밀어 넣습니다. 텅스텐이 유리의 끝부분을 통과하도록 매우 주의 깊게 밀어줍니다.텅스텐과 유리 사이의 밀착 상태를 유지하는 것이 중요하며, 일반적으로 약간의 유리가 실제로 깨질 정도로 충분히 밀어 넣습니다. 마이크로 피펫의 뒷부분에 소량의 순간접착제를 도포하여 텅스텐을 유리에 고정할 수 있습니다. 전극 제작이 완료되면, 금속 전극 임피던스 테스트를 사용하여 임피던스를 측정합니다.일반적으로 1 MΩ에 가까운 임피던스를 확인합니다. 전극은 매우 취약

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

이 비디오는 망막 건강과 시력 경로 무결성을 연구하기 위한 쥐 모델의 준비를 보여줍니다. 시각적 유발 전위 및 전기 망막검사 참조 및 활성 전극을 쥐에 연결한 다음, 고르게 망막 조명을 위해 플랫폼을 Ganzfeld 그릇 앞의 쥐와 정렬하고 외부 간섭을 피하기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.

전기생리학 설정을 사용하여 시각적 경로 무결성을 평가하기 위한 RAT 모델 준비

이 비디오는 여러 부위의 뇌 활동에 대한 전기 생리학적 기록을 위해 마취된 쥐를 준비하는 자세한 절차를 보여줍니다. 두개골에 접근하기 위해 두피를 절개하고, 정확한 위치에 구멍을 뚫어 전극을 설치하고 고정합니다. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상 위치에 삽입하여 데이터를 기록합니다.

쥐의 여러 부위에서 뇌 활동에 대한 생체 내 전기생리학적 기록

이 비디오는 빛 자극에 대한 반응으로 뇌의 시각 피질에서 나오는 전기 신호를 기록하는 미리 이식된 두개골 전극으로 어둡게 적응하고 마취된 쥐에서 시각적 유발 전위 또는 VEP를 측정하는 과정을 보여줍니다.

쥐 모델의 두개골 전극을 통한 시각적 유발 전위 기록

이 비디오는 의식이 있는 쥐의 망막전도(ERG)와 시각 유발 전위(VEP)를 기록하는 방법을 보여줍니다. 외과적으로 전극을 이식한 쥐는 먼저 어둠에 적응한다. 확장 점안액을 적용한 후, 동물을 구속기에 넣고 Ganzfeld 그릇에 넣습니다. 그런 다음 ERG 및 VEP 신호가 기록됩니다.

쥐의 망막전도 및 시각 유발 잠재력 기록

Ex vivo ERG는 동물 또는 인간의 분리된 온전한 망막에서 직접 망막 세포의 전기 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 망막 세포의 전기적 활동을 해부하기 위해 생체 외 ERG 기록에 일반적인 생체 내 ERG 시스템을 적용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

국소 탈수초화는 리솔레시틴 미세주입을 사용하여 시신경에서 유도됩니다. 시각 유발 전위는 생체 내에서 시각 경로를 따라 신호 전도를 검사하기 위해 시각 피질에 이식된 두개골 전극을 통해 기록됩니다. 이 프로토콜은 전극 이식 및 시신경 미세 주입의 기초가 되는 수술 절차를 자세히 설명합니다.

실험 시신경의 탈수 초화의 쥐 모델에서 시각 유발 전위 기록

이 프로토콜은 마취된 쥐에서 망막전도와 시각적 유발 전위를 동시에 측정하는 것을 설명합니다.

전위도의 동시 녹화 및 마취 된 흰쥐의 비주얼 사건 관련 전위

우리는 녹음이 마취 교란없이 실시하고 있습니다 인간의 조건에 더 유사하다 눈 (전위도) 및 의식 쥐의 뇌 (시각 잠재적 유발)에서 시각 전기 생리 신호를 측정하는 수술 주입 및 녹음 과정을 보여줍니다.

의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 Visual 사건 관련 전위

여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

이 프로토콜은 머리가 고정된 마우스의 뇌간에서 생체 내 고밀도 단일 뉴런 기록을 얻는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 전신 마취 전과 전신 마취 중에 REM(Rapid Eye Movement) 수면 중에 비활성화된 뇌간 영역인 복외측 수관 주위 회색에서 뉴런의 활동 전위 발화를 측정하기 위해 배포됩니다.

Head-Fixed Mice의 뇌간에서 발생한 급성 단일 단위 다중 전극 기록

학습하세요 쥐의 시각교에서 망막 신경절세포 활동전위를 생체내 기록하는 방법을. 텅스텐 도금 유리전극을 사용하여 얇은 축삭에서 고신호대잡음비 기록을 수행합니다.

단일 유닛 생체내에서 레코딩

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