Name: 라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 두 광자 현미경을 이용한 Danio rerio 태아의 단일 세포 수준 광활성화 기법입니다. 이 방법은 발달 생물학 연구에서 세포 운명 추적과 저광독성 심부 조직 이미징을 가능하게 합니다.

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친절 neurogenin1 기자 라인을 제공 UWE Strahle하고, Vyacheslav Kalchenko, 더글러스 루츠, 그리고 두 광자 uncaging와 함께 기술적 조언 및 지원 레오 Roitman,, Maayan Tahor 및 기술 지원 Suliman Elsadin 감사 그림 그래픽 Genia 브로드 스키에 의한 아르 이 원고에 대한 의견을 아모스 Gutnick. 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 928/08)와 해리엇 &amp; 마르셀 데커 재단, Levkowitz 실험실의 연구는 독일 - 이스라엘 재단 (부여 번호 2,007분의 183)에 의해 지원됩니다. GL은 바이오 메디컬 연구에 타우 경력 개발 위원장의 재직입니다.

우리는 갇힌 플루오레신를 사용하여 셀 라벨링의 프로토콜을 설명하지만, 다른 사진 activatable 염료와 단백질은 비슷하게 사용할 수 있습니다. 1. 갇힌 플루오레신의 분사 <ol><li> Dextran - 복합 4,5 - dimethoxy - 2 - nitrobenzyl (DMNB) 플루오레신를 (10,000 MW dextran, 음이온, Invitrogen, 분자 프로브, 칼스 배드, CA 갇힌의 5 % 주식 솔루션 (5mg 갇힌 - 플루오레신 / 100 μL 0.2M KCl) 준비 , 고양이. 아니. D - 3310). -20 ° C로 나누어지는 및 저장 DMNB - 갇힌 플루오레신은 빛에 민감하고 어둠에 보관해야합니다. </li><li> 로 "zebrafish 도서"1에서 설명한 1% 아가로 오스 (시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. A9539)로 만든 주사 트러프를 준비합니다. </li><li> 100 X E3 재고 솔루션을 diluting하여 E3 중간 2 리터를 준비합니다. </li><li> 주입 전에 저녁에 photoactivati​​on의 대상 세포를 집중하는 데 사용하는 가시 형광 랜드마크를 (GFP, RFP 등) 표현 원하는 유전자 변형 라인의 여성 (S)에서 남성 (들)을 분리 교배 새장을 준비합니다. </li><li> micropipette 풀러를 (서터 악기, 노바토, CA, P - 97)를 사용 모세관 주입 바늘을 (필라멘트와 얇은 벽 유리 모세 혈관, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 고양이. 아니. TW100F - 6) 준비. </li><li> 얼음에 갇힌 플루오레신을 5 % 나누어지는를 녹여. </li><li> 1 % 최종 농도 0.2M KCl에 5% 갇힌 플루오레신 재고 솔루션을 희석하고, 얼음 계속. 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 설치 짝짓기는 4 단계에서 준비 십자가. </li><li> 즉시 그들이 낳은 그대로 수정된 달걀을 수집합니다. 아가로 오스의 사출 성형에 동양 한 세포 단계의 배아는 E3 1 입혔다. </li><li> microloader 팁 (Eppendorf, 함부르크, 독일, 고양이. 아니. 5242 956.003) backfill 1% 갇힌 플루오레신 솔루션 ~ 1 μL와 주사 바늘을 사용합니다. </li><li> 장소에 가스 공급 microinjector (공압 picopump, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, PV820). 부착된 micromanipulator에 바늘로드 </li><li> 2 3nl로 사출 볼륨을 조절하고 세포의 세포질에 직접 갇힌 - 플루오레신을 주입. 실험 50 배아 최소 주사. </li><li> 28.5에서 어둠 속에 배아를 품어 ° 원하는 발달 단계에 E3에서 C. 24 시간 게시물 수정보다 오래된 배아를 분석하는 경우, 착색을 억제하는 (PTU, 시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이. 아니. 22290-9) 0.1 % phenylthiourea를 추가합니다. </li></ol> 2. 배아가 장착 <ol><li> (; 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다 솔루션 부분을 참조) 신선한 E2 솔루션을 준비합니다. </li><li> E2 매체에 녹아있는 1퍼센트 아가로 오스의 얇은 레이어 코팅 60mm 페트리 요리. </li><li> 2퍼센트 낮은 융점 아가로 오스 (.. 울트라 퓨어 LMP 아가로 오스, Invitrogen, 칼스 배드, CA, 고양이도없는 16,520,100)의 삽입을 준비 : 끓는까지 마이크 로파 가열에 의해 살균 이중 증류수의 아가로 오스를 해산. 가열하는 동안 튜브의 뚜껑을 열어 두세요. 나누어지는 1 microcentrifuge 튜브에 ML 72에서 가열 블록의 유지 ° C. </li><li> 부드럽게 날카로운 집게 (제 5)와 간격 chorion를 당기는하여 태아의 chorions를 제거합니다. (단계 2 참조) 한천 - 코팅 접시에 E2 솔루션 배아 보관하십시오. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 Dechorionated 배아는 화재 - 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 취급해야합니다. 이 배아는 액체 표면 장력에 의해 손상될 수 있습니다로 공기에 dechorionized 배아를 노출하지 마십시오. </li><li> E2의 작은 볼륨이 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 선택된 배아를 수집하고, 60mm 페트리 접시에 배아를 놓으십시오. 배아 옆에 2퍼센트 아가로 오스의 드롭 (~ 150 μL) (3 단계)을 탑재합니다. 신속하게 동질적인 최종 ~ 1 % 아가로 오스의 혼합물을 얻기 위해 두 방울을 섞어 배아는 객관적 렌즈를 직면하고 자사의 지느러미 측면과 해부 현미경의 방향을 사용합니다. </li><li> 아가로 오스가 확정 때까지 기다렸다가 포함된 배아가 액체에 빠져들 때까지 E2 매체를 추가합니다. 이것은 그것이 photoactivati​​on 과정 후 아가로 오스의 공개 수 있으므로 요리마다 하나의 배아를 얻는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. Photoactivati​​on <ol><li> 우리는 자이스 혈구 LSM 510 NLO META 두 광자 조정할 수있는 광대역 (700 - 1020nm) Spectraphysics에서 마이 타이 - HP - femtosecond 레이저가 장착된 현미경을 사용합니다. </li><li> 현미경 접시 홀더에 장착 배아를 놓습니다. 배아의 형광 획기은 40x/0.8W Achroplan 물을 사용하면 목표를 포장되어 시각이다. 우리가 500 550nm의 대역 통과 필터 (BP)과 비 descanned 감지기 (NDD)를 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> photoactivati​​on 과정에 대한 전제 조건으로 860nm의 2 광자 레이저 파장 (GFP 감지)와 함께 발견 형광 신호의 지느러미 부분에 가장 복부의 이미지 시리즈를 인수함으로써 관심 영역의 공간적 형광 정보를 얻습니다. 이를 위해 충분한 해상도는 각 인수 초점 평면 사이 6μm의 기간을 사용하여 얻을 수있다. </li><li> 대상을 선택photoactivati​​on에 대한 Z - 비행기와 초점에이 지역을 가​​지고. 실험의 목적에 따라 관심의 지역 내에서 또는 GFP 볼 수 밖에 랜드마크 중 하나가 될 수 있습니다. 이 Z - 평면에서 하나의 이미지를 가져가라. 이미지를 저장하고 별도의 창에서 열어 유지. </li><li> 720nm로 두 광자 레이저 파장을 설정하고 레이저는 '수정 표백제'메뉴를 열고 잠금 모드에있을 때. '정의 지역'메뉴를 사용하여 860nm (4 단계)에서 촬영한 이미지에 따라 photoactivati​​on에 대한 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 그것은 후자 작업은 X, 관찰 필드의 Y 위치를 변화 720nm에 레이저 파장을 이동 후이 이미지에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택하는 데있어 매우 중요합니다. </li><li> (9 단계 참조) '편집 표백제'메뉴에서 photoactivati​​on에 대해 다음 매개 변수를 조정 :) 상대 레이저의 파워, 반복 B) 번호, C) 스캔 속도. </li><li> 눌러 '수정 표백제'창에 '블리치'및 레이저 멈출 때까지 기다립니다. </li><li> 860nm로 다시 전환, 결과 photoactivated 재료와 활성화된 도메인의 Z - 폭 (두께) 평가하기 위해 이미지 수집의 두 번째 시리즈의 강도를 평가하는 하나의 평면 이미지를 획득. </li><li> photoactivati​​on에 대해 다음 매개 변수를 고려 : <ol class="lalpha"><li> 레이저 강도와 photoactivati​​on 기간 : 하나는 경험적으로 두 개의 매개 변수를 변화하여 photoactivati​​on을위한 최적의 조건을 결정한다. 상대 레이저의 파워는 음향 광학 변조기 (AOM) 전송에 의해 제어할 수 있습니다. photoactivati​​on의 기간은 반복 및 스캔 속도의 수를 기능입니다. </li><li> uncaged 형광의 포화를 피하기 위해 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다. </li><li> uncaged 분자의 형광 강도를 획득하고 photoactivated 복제 2 Z - 축 스팬 사이에 선형 상관 관계가있다. </li></ol></li></ol> 4. Uncaged 플루오레신의 감지 <ol><li> photoactivati​​on 후 28.5에서 어둠 속에서 배아를 인상 ° E2 매체에서 C는 피부 착색의 모양을 방지하기 위해 PTU 0.1 %를 포함. </li><li> 원하는 발달 단계에서, 해부 현미경 아가로 오스의 배아를 제거합니다. 지적 메스를 사용하여 "V"는 배아의 머리쪽으로 향하고있다 있도록 배아 근처 아가로 오스에 "V"모양의 절개를 만듭니다. 배아의 머리 근처에있는 "V"의 시점에서 닫힌 집게를 놓고 부드럽게 배아의 길이를 따라 아가로 오스를 분리하고 중간에 배아를 발표 포셉을 열고 밀고. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 배아를 수집하고 paraformaldehyde (PFA, 1 X PBS, PH 7.2의 4 %)로 수정 4 3 상온에서 시간 또는 하루 중 대한 ° C. </li><li> 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 적어도 5 분 PBST에 2-3 번 씻어. </li><li> 적어도 2 시간을 위해 -20 ° C에서 신선한 메탄올과 부화로 보충, 10 분 100 % 메탄올로 배아를 씻으십시오. </li><li> 80%, 60 %, 40 % 및 20 % PBSTr에 희석 메탄올의 일련의 연속 incubations (5 분 각각)에 의해 배아를 Rehydrate. PBSTr 2 X 10 분 씻으십시오. </li><li> 차단 솔루션을 500 μL에 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 솔루션을 차단으로 1:500 희석 방지 플루오레신 - 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP = 연합 뉴스) 팹의 조각을 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 안돼. 11,426,338,910) 추가 4 밤새 품어 ° C (그들 면이 장소 microcentrifuge 튜브) . </li><li> PBST 5 X 15 분 씻으십시오. </li><li> TNT에서 0.2M NaCl 5 분 씻으십시오. </li><li> TNT에서 0.4M NaCl 5 분 씻으십시오. </li><li> 신선한 Prestain 솔루션 3 X 5 분 평형. </li><li> 2 ML Prestain 솔루션에서 한 빠른 레드 타블렛 (로체, 팔로 알토, CA, 고양이. 아니. 11,496,549,001) 디졸브. 그것은 유엔 - 해산 입자를 생략 왓먼 제 2 종이를 사용하여 솔루션을 필터링하는 것이 좋습니다. 또는 솔루션을 스핀 다운하고 맑은 뜨는 액체를 사용합니다. </li><li> 500 μL 패스트 레드 상온에서 어둠 속에 품어 각 튜브에 솔루션, 그리고 모니터 색상 개발 원하는 신호 대 배경 비율이 (몇 시간 20 분)에 도달할 때까지 추가합니다. 배경이 개발하는 경우, 4로 전송 ° C. 부화 한 시간 후에, 새로운 패스트 레드 얼룩 솔루션을 보충. </li><li> 3 X 5 분 얼룩 반응을 중지 PBST로 씻는다. </li><li> 상온에서 4퍼센트 PFA에 20 분 수정. </li><li> PBST 2 X 5 분 씻으십시오. </li><li> 25 %의 일련의 50 %와 PBS의 75 % 글리세롤을 통해 지우기 배아가 배아 때까지 튜브의 아래쪽에 정착하고 있습니다. 배아는 몇 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. Uncaged 지역의 형광 시각화 <ol><li> 장착을위한 현미경의 슬라이드를 준비 : 1 ML의 주사기가 서로 ~ 15mm의 거리에서 배치 슬라이드 맑은 실리콘 그리스 네 가지 명소를 적용 사용합니다. cente에서 배아 마운트R의 75 % 글리세롤 장소 coverslip (제 0; 18x18mm)의 ~ 200 μL에서 상단과 글리세롤 솔루션 슬라이드 사이의 표면을 점유 때까지 부드럽게 실리콘에 대해 그것을 밀어. </li><li> 무대에 탑재된 배아를 놓고 40x 목표를 사용하여 초점에 그것을 가지고. 488nm 아르곤과 여기 소스로 543nm HeNe 레이저를 사용하여 이미지의 공촛점 Z - 시리즈를 취득. </li><li> photoactivatated 도메인의 Z 축 범위는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 uncaged 배아의 3D 재구성을 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 솔루션 <table border="1"><tbody><tr><td> 100 X E3 </td><td> 174mM NaCl, 21mM KCl, 장총 MgSO 4, 18mM 칼슘 (NO3), 15mM HEPES, pH를 = 7.4. 4 여과하고 저장하여 소독 ° C </td></tr><tr><td> 20 X E2 </td><td> 0.3M NaCl, 10mM KCl, 실온에서 20mM CaCl 2 * 2HOH, 20mM MgSO 4 * 7HOH, 3mM KH 2 PO 4, 0.8mM 나 2 HPO 4 * 2HOH, 여과물 및 저장 </td></tr><tr><td> 1 X E2 </td><td> 이중 증류수 20 X E2를 희석하고 신선한 NaHCO 3 (0.7mM의 최종 농도), 페니실린과 스트렙토 마이신 (페니실린 및 ML 당 100mg 스트렙토 마이신 (Invitrogen의 100U를 포함 한 X의 최종 농도로 희석 펜 strep 솔루션을 만들어 추가 , 칼스 배드, CA, 고양이. 아니. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0.1 % PBS에서 트윈 - 20 </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> PBS에 0.​​3 % 트리톤 </td></tr><tr><td> 차단 솔루션 </td><td> 10% BSA, 0.3 % 트리톤, PBS에 1퍼센트 DMSO </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 7.5, 150mM NaCl, 0.5 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 </td></tr><tr><td> Prestain 솔루션 </td><td> 100mM 트리스 - HCL의 산도 - 8.2, 0.4M NaCl, 0.1 %를 두 번 증류수에 트윈 - 20 </td></tr></tbody></table> 7. 대표 결과 생활 zebrafish 배아에서 요원을 photoactivate하는 두 광자 현미경의 사용 예제는 제공됩니다. 비슷한 접근법을 사용 우리는 이전에 zebrafish의 두뇌 2,3에 photoactivated 레이블 신경 progenitors의 혈통을 추적. : 살아있는 본질적인 랜드마크 역할을 GFP transgene 기자, : 그림 1은 neurog1를 들고 zebrafish 배아의 앞쪽에 신경 접시에 갇힌 플루오레신 복합 추적 염료의 photoactivation을 보여줍니다. 배아는 세포 하나의 단계에서 갇힌 플루오레신 주사와 버드 단계에서 아가로 오스에 포함되었습니다. 3 - 5 - 체절 단계 공간 좌표 neurog1로 측정되었습니다 : GFP 형질 전환 배아는 (그림 1A, A ') uncaging에 대한 관심의 영역 (ROI)을 확인합니다. 우리는 신경 플레이트 (그림 1B, B ')의 특정 도메인에서 플루오레신 혈통의 추적기 uncaged. 그 후,이 주어진 표시 신경 전구 하위 도메인의 운명은 uncaged 플루오레신 (그림 1C, C ')의 immunostaining으로 prim5 (24 시간 게시물 수정) 단계에서 결정되었다. 두 광자 레이저 uncaging의 범위는, uncaged 형광과 photoactivated 도메인 (Z - 스팬)의 두께의 강도 즉, 두 개의 매개 변수를 조정하여 제어할 수 : 레이저 강도와 기간. 후자는 (; 러섹 - 블럼 2009 년 제 3 단계 9 참조) 반복 번호와 스캔 속도의 조절에 의해 제어할 수 있습니다. 그림 1에 표시된 예제에서, 우리는 25.6 μsec / 픽셀의 상대적인 레이저 12 % AOM 전송 전력, 20 반복과 속도를 검사를 사용합니다. 이러한 설정을 사용하여 우리는 9-10 세포와 30μm의 photoactivated Z - 스팬 (~ 1-2 셀 행)이있는 투자 수익 (ROI)을 표시. <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 라이브 zebrafish 배아에 갇힌 플루오레신의 photoactivation의 대표 결과. 도식 일러스트 (AC)과 photoactivati​​on 프로세스의 대표 이미지 (A' - C '). 한 세포 단계에서 갇힌 플루오레신 추적 염료를 주사 맞은 (GFP : neurog1) zebrafish 배아를 (A, A ') neurogenin - 1 프로 모터의 제어하에 표현 GFP 살고 있습니다. 3-5에서 - 체절 단계, forebrain primordium (diencephalon)의 이산 지역은 photoactivated되었으며 uncaged 플루오레신 추적 염료 (B, B ') 감지 수 있습니다. photoactivati​​on 절차 이후에, 배아는 ° C와 uncaged 플루오레신을 포함한 뇌 세포가 24 시간 게시물 수정 (; C, C 'HPF)에서 안티 플루오레신 immunostaining에 의해 추적되었다 28.5에 incubated했다. 디엔, Diencephalon;. 전화, Telencephalon..

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</ol>

사진 activatable 화합물은 누구 함수들은 생물 학적 또는 화학적으로 활성화된 상태로 분자를 변환하는 광화학 반응을 유도하는 특정 파장 (보통 UV)와 조명까지 가면됩니다 분자 수 있습니다. 정품 인증이 정확하게 빛을 자신의 노출을 제한함으로써 temporally하고 공간 제어 수 있으므로 이러한 프로브는 세포 생물학 연구에 매우 강력한 도구를 제공합니다. 다중 광자 현미경의 큰 장점은 상대적으로 깊은 광학 침투 및 감소 특이 현상이 phototoxicity입니다. 활성화 프로세스, 낮은 에너지의 두 광자가 동시에 사진 activatable 복합에 의해 흡수해야합니다. 이러한 이벤트의 확률이 광자 밀도에 따라 달라집니다로서, 정품 인증 초점 비행기로 제한 남아 있습니다. 활성화 지역은 따라서 선택적으로 조직 내에서 정의된 볼륨에서 조작할 수 있습니다. 우리는 살아 zebrafish의 배아에서 두 광자 현미경을 사용하여...

<table><tbody><tr><td>Dextran-접합 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) 케이지드 플루오레세인 (10,000 MW dextran, 음이온성)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>분자 프로브</td></tr><tr><td>주입 트로프 및 코팅 플레이트용 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 포함된 박벽 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>공압식 피코펌프</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>배아 고정용 저융점 아가로스</td><td>Ultra Pure LMP agarose</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-알칼라인 포스파타아제 (AP) Fab 단편</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 zebrafish 태아에서 두 광자 기반 photoactivati​​on

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

살아있는 생물의 목표 화합물의 Photoactivati​​on는 배아 개발, 세포 신호 성인 생리학 등 다양한 생물 학적 프로세스를 연구하는 귀중한 접근을 입증했다. 이러한 측면에서, 다중 광자 현미경의 사용은 하나의 세포 해상도 깊은 조직에서 주어진 빛의 반응 요원의 양적 photoactivati​​on 수 있습니다. zebrafish 배아는 광학 투명으로, 그들의 발전은 생체내에서 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특성은 zebrafish 집중 조명하여 화학 약품과 단백질의 다양한 활동을 제어하기위한 완벽한 모델​​ 생물합니다. 여기 차례로 우리가 살고 zebrafish의 배아에서 세포의 운명을 따를 수 있습니다 화학적 갇힌 플루오레신의 활성화를 유도하는 두 광자 현미경의 사용을 설명합니다. 우리는 관심의 세포를 찾아 정확하게 대상으로 라이브 유전자 랜드마크 (GFP)을 표현 배아를 사용합니다. 이 절차는 마찬가지로 단백질, 호르몬, 작은 분자 및 기타 갇힌 화합물의 정확한 빛의 유도 활성을 위해 사용될 수 있습니다.

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

살아있는 생물체 내 표적 화합물의 광활성화는 배아 발달과 같은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 유용한 접근법임이 입증되었습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피쉬 배아의 단일 세포 해상도에서 화학적으로 케이지드(caged)된 형광 염료와 같은 특정 광 반응성 시약을 광활성화하는 것입니다. 이는 살아있는 유전적 랜드마크를 발현하는 단일 세포 단계의 배아에 광 반응성 시약을 주입하여 관심 세포를 찾아 정밀하게 타겟팅함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 배아를 성장시킨 후 살아있는 배아를 고정시키는 저융점 아가로스(low melting point agarose)에 마운팅합니다.다음으로, 가시광선 형광 전이 표지를 국소화하기 위해 이광자 현미경을 사용합니다. 그런 다음 원하는 초점 평면에서 광반응제를 활성화하고 광활성화 범위를 모니터링합니다. 이후 발생 단계에서 결과적으로 표지된 세포들의 운명을 추적할 수 있습니다.이 절차는 살아있는 표본에서 단일 세포 해상도로 다양한 화합물을 활성화하는 데 활용될 수 있습니다. 공초점 현미경이나 플래시 램프와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 낮은 광독성으로 수 마이크론의 축 방향 레벨에서 비교적 깊은 조직의 광활성화를 가능하게 한다는 점입니다. 하지만 여기서 제시된 방법은 셀라인 엣지 트레이싱(seline edge tracing)에 사용되며, 다양한 성분의 광활성화에 적용될 수 있어 발달 및 생리학적 과정에 대한 표적 제어가 가능합니다. 주입 전날 저녁에 교배 탱크를 준비하고, 가시적인 형광 랜드마크를 발현하는 형질전환 라인의 암수 제브라피시를 분리합니다.본 실험에서 형질전환 라인은 neurogenic N one 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현합니다. 0.2 M potassium chloride에 포함된 5% dextran 결합 caged fluorescein 분주액을 얼음 위에서 해동하십시오. caged fluorescein을 0.2 M potassium chloride로 희석하여 최종 농도를 1%로 맞추십시오. fluorescein은 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 차단하십시오. 제브라피쉬 교배 쌍이 짝짓기를 하도록 둡니다. 수정란이 산란되는 즉시 수집하여 본문에 설명된 대로 세척하십시오. 해부 현미경 하에서 플라스틱 피펫을 사용하여 1세포기 배아를 신선한 E3 배지가 덮인 1% agarose 주입 플레이트로 옮기십시오.피펫을 사용하여 주입 트러프 내의 배아 방향을 잡습니다. 길게 테이퍼진 모세관 주입 바늘의 팁을 부러뜨립니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 바늘에 약 1 µL의 1% caged fluorescein을 역충전합니다.시료가 충전된 바늘을 공압식 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 조작기에 장착합니다. 각 배아의 세포질에 2~3 nanoliters의 caged fluorescein을 직접 주입합니다. 실험당 최소 50개의 배아에 주입하십시오.주입된 배아를 신선한 E three 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮기고, 28.5 °C의 암소에서 원하는 발달 단계까지 배양합니다. 색소 침착을 억제하기 위해 배아 24시간째에 0.1% Phenyl threa를 처리하여 배아 마운팅을 준비합니다. 신선한 E two 배지에 용해된 1% Aros를 15~20개의 60 mm 페트리 접시에 얇게 코팅합니다. Aros가 응고되면 해부 현미경 하에서 접시에 E two 배지를 채웁니다.날카로운 핀셋을 사용하여 주입된 배아를 코팅된 플레이트로 옮깁니다. 배아가 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. 증류수에 희석한 2% low melting point agarose 분주액을 준비해 둡니다.72 °C의 히트 블록에서 수행합니다. 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 150 µL의 배지가 담긴 코팅된 배아 하나를 60 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 배아 옆에 비슷한 부피의 2% Agros를 떨어뜨리고, 두 방울을 빠르게 섞어 균질한 1% Agros 방울을 만듭니다.배아의 등쪽이 대물렌즈를 향하도록 배치합니다. agarose가 응고되도록 기다린 후, 매립된 배아를 E2 배지에 담급니다. 광대역 터너테이블 레이저가 장착된 이광자 현미경 아래의 플레이트 홀더에 갓 마운팅한 배아를 놓습니다.광활성화 과정을 시작하기 전, 발현 조직의 가장 복측(ventral) 가장자리부터 배측(dorsal) 가장자리까지 860 nanometers 간격으로 이미지 시리즈를 획득하십시오. Z 평면상에서 이미지 간격을 6 microns로 설정하십시오. 광활성화를 위한 대상 Z 평면을 선택하고 GFP를 기준점으로 사용하여 초점을 맞추십시오.관심 영역을 찾으십시오. 860 nanometers에서 단일 이미지를 촬영하고, 정확한 정렬을 위해 이를 별도의 창에 띄워 놓으십시오. edit bleach 메뉴를 열기 전에 720 nanometers 레이저가 모드 잠금 상태여야 하는 것이 매우 중요합니다.860 nanometer에서 촬영한 이미지를 사용하여 광활성화를 위한 관심 영역(ROI)을 설정하십시오. Bleach 편집 창에서 상대적 레이저 출력, 반복 횟수 및 스캔 속도를 조정하십시오. 광활성화를 위해 레이저가 멈췄을 때 bleach를 누르고, 다시 860 nanometer로 전환하여 단일 평면 이미지를 획득함으로써 광활성화된 물질의 강도를 평가하십시오.활성화된 도메인의 z-축 범위(zsan) 또는 두께를 평가하기 위해 이미지 스택을 수집하십시오. 이러한 방식으로 레이저 강도와 노출 시간을 경험적으로 결정할 수 있습니다. 각 클론 또는 교차 사진의 최적의 광활성화를 위해, 실험에 사용할 나머지 배아를 모두 활성화하십시오.이러한 조건 하에서, 0.1% Phenyl thio urea가 포함된 E2 배지 내 28.5 °C의 암소에서 고정된 광활성 배아가 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 실체 현미경 하에서, 끝이 뾰족한 메스를 사용하여 고정된 배아 근처의 융기 부위에 V자형 홈을 만들며, 홈의 바닥 부분이 배아의 머리 쪽을 향하도록 합니다. 닫힌 상태의 핀셋을 홈의 정점에 놓습니다.포셉을 조심스럽게 벌려 배아의 길이를 따라 아로스를 분리하고 배아를 배지로 방출합니다. 각 배아를 방출한 후, 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 마이크로 원심 분리 튜브에 수집합니다. 화학 흄 후드 내에서 4% formaldehyde로 배아를 3시간 동안 고정합니다.실온에서 동반된 텍스트에 기술된 대로 탈수, 재수화, 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase), 접합된(conjugated) 항-플루오레세인(anti fluorescein) 염색 및 모든 관련 세척 과정을 진행하십시오. 여과된 fast red 용액 500 µL를 배아에 첨가하십시오. 실온의 암소에서 배양하며, 원하는 신호 대 배경 비율(signal to background ratio)에 도달할 때까지 매 시간 새로운 fast red 염색 용액으로 교체해 주십시오.PBST로 5분씩 3회 세척하여 염색 반응을 중단시킵니다. 흄 후드 내에서 4% formaldehyde로 20분 동안 염색물을 고정합니다. PBST로 5분씩 2회 세척합니다.투명해진 배아를 PBS 내의 25%, 50%, 75% 글리세롤 농도 구배로 순차적으로 세척하여 각 배아가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 처리합니다. 현미경 관찰 준비가 될 때까지 배아를 4 °C에서 보관합니다. 관찰을 위해 배아를 고정하려면, 1 mL 주입기를 사용하여 현미경 슬라이드 위에 15 mm 정사각형 모양의 네 모서리에 투명 실리콘 그리스를 20 µL씩 네 군데에 도포합니다.그리스 방울 사이에 약 200 µL의 75% glycerol을 넣고 배아를 배치합니다. 배아 위에 커버슬립을 덮습니다. glycerol 용액이 가득 찰 때까지 커버슬립을 조심스럽게 수직으로 누릅니다.그리스에 고정된 배아 방울 사이의 공간은 공초점 현미경으로 시각화하기 전 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 이 이미지는 neurogenin1 프로모터 제어 하에 GFP를 발현하는 살아있는 제브라피시 배아를 보여줍니다. 이 배아는 앞서 설명한 방법을 사용하여 1세포기 단계에서 caged fluorescein 추적 염료가 주입되었으며, 현재 3~5 somite 단계입니다.두 광자 레이저를 통해 뇌 원기의 특정 영역을 광활성화하였으며, 이에 따라 케이지가 해제된 플루오레세인 추적 염료가 검출되었습니다. 광활성화 절차 이후 배아를 28.5 °C에서 배양하였으며, 수정 후 24시간째에 케이지가 해제된 플루오레세인을 포함하는 뇌 세포를 항-플루오레세인 면역 염색을 통해 적색으로 추적하였습니다. 라벨링된 세포 수가 적음에 유의하십시오. 광활성화 절차를 숙달하면 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 단일 세포 해상도로 정밀한 광활성화를 가능하게 하는 최적의 파라미터를 제어하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

본 연구에서는 살아있는 제브라피시 배아 내에서 광전환형 형광 단백질(PCFPs)의 광활성화 스위칭 방법과, 발달 과정 중 특정 시점에서 광전환된 단백질을 추적하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 통해 살아있는 척추동물 유기체 내에서 다양한 발달 과정의 근간이 되는 세포 생물학적 사건들을 모니터링할 수 있습니다.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

배우세요 두 광자 현미경을 이용한 Danio rerio 태아의 단일 세포 수준 광활성화 기법입니다. 이 방법은 발달 생물학 연구에서 세포 운명 추적과 저광독성 심부 조직 이미징을 가능하게 합니다.

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