라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 배아에서 화학적으로 케이지된 형광 염료와 같은 주어진 광 반응 물질을 단일 세포 해상도로 사진 활성화하는 것입니다. 이는 살아있는 유전적 랜드마크를 발현하는 한 세포기 배아에 광 반응 인자를 주입하여 관심 세포를 찾고 정확하게 표적으로 삼음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 배아를 성장시켜 저융점 에어로스(aeros)에 장착하여 살아있는 배아를 움직이지 못하게 합니다.

다음으로, 가시 형광 형질 전환 랜드마크를 국소화하기 위해 두 개의 광자 현미경 검사가 사용됩니다. 그런 다음 광 반응 물질이 원하는 초점면에서 활성화되고 광 활성화 정도가 모니터링됩니다. 그 결과로 표지된 세포의 운명은 이후 배아 단계에서 추적할 수 있습니다.

이 절차는 살아있는 표본에서 단일 세포 분해능으로 다양한 화합물을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 컨포칼 현미경 또는 플래시 램프와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 낮은 광독성으로 몇 미크론의 축 수준에서 비교적 깊은 조직의 광 활성화를 허용한다는 것입니다. 그러나 여기에 제시된 방법은 셀린 가장자리 추적에 사용되며 다양한 구성 요소의 광 활성화에 적용할 수 있으며, 이를 통해 발달 및 생리학적 과정에 대한 표적 제어를 가능하게 합니다: 주사 준비 전 저녁에 짝짓기 탱크는 눈에 보이는 형광 랜드마크를 표현하는 형질전환 계통의 수컷과 암컷 제브라피시를 분리합니다.

이 실험에서, 형질전환 라인은 신경인성 N 하나의 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하고, 5%덱스트란 공액 케이지 플루오레세인의 부분 표본을 얼음 위에서 0.2몰 염화몰로 케이지 플루오레세인을 0.2몰 염화칼륨으로 희석하고, 최종 농도 1%로 플루오레세인을 얼음 위에 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 얼룩말 물고기 십자가가 짝짓기를 할 수 있도록 하고, 수정란을 낳자마자 모으고, 본문에 설명된 대로 헹굽니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 하나의 세포기 배아를 해부 현미경으로 새로운 E 3 배지로 덮인 1%aros 주입판으로 옮깁니다.

피펫을 사용하여 주입 홈통에서 배아의 방향을 지정합니다. 긴 테이퍼로 당긴 모세관 주사 바늘의 끝을 부러뜨립니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 약 1마이크로리터의 1%케이지 플루오레세인으로 바늘을 다시 채웁니다.

장전된 바늘을 공압 마이크로 인젝터에 부착된 미크론 매니퓰레이터에 놓습니다. 각 배아에 2-3나노리터의 케이지에 갇힌 플루오레세인을 세포의 세포질에 직접 주입합니다. 실험당 최소 50개의 배아를 주입합니다.

주입된 배아를 신선한 E 3개의 배지가 포함된 페트리 접시에 옮기고, 섭씨 28.5도의 어둠 속에서 원하는 발달 단계까지 배아를 배양하여 0.1%페닐 트레아에서 색소 침착을 억제하고 24시간에 배아를 배아로 배아 장착을 준비합니다. 15-2060 밀리미터 페트리 접시를 코팅하십시오 1 % Aros의 얇은 층이 aros가 응고되었을 때 신선한 E 2 매체에 용해됩니다. 해부 현미경으로 접시에 E 두 배지를 채웁니다.

날카로운 집게를 사용하여 주입된 배아를 코팅된 플레이트에 코팅합니다. 배아를 공기에 노출시키지 마십시오. 물에 2%의 낮은 융점 aros의 부분 표본을 유지하십시오.

섭씨 72도의 열 블록에서. 파이어 폴리싱 처리된 과거 피펫을 사용하여 약 150마이크로리터의 배지에서 60mm 페트리 접시에 코팅된 배아 하나를 옮깁니다. 배아 옆에 비슷한 부피의 2%Aros를 놓고 두 방울을 빠르게 혼합하여 균일한 1%Agros 방울을 얻습니다.

배아의 등쪽이 대물렌즈를 향하도록 배아의 방향을 잡습니다. aros가 굳어지도록 하고 내장된 배아를 E 두 배지에 담그십시오. 갓 장착된 배아를 광대역 턴테이블 레이저가 장착된 이광자 현미경 아래의 플레이트 홀더에 놓습니다.

광 활성화 과정을 시작하기 전에 860나노미터와 공간에서 발현 조직의 가장 복부에서 등쪽 가장자리까지 이미지 시리즈를 획득합니다. 이미지는 Z 평면에서 6미크론 떨어져 있습니다. 사진 활성화를 위한 대상 Z 평면을 선택하고 GFP를 랜드마크로 사용하여 초점을 맞춥니다.

관심 영역을 찾습니다. 860나노미터에서 단일 이미지를 촬영하고 적절한 정렬을 위해 별도의 창에 열어 두십시오. 720나노미터의 레이저가 편집 표백제 메뉴를 열기 전에 모드 잠금 상태에 있어야 합니다.

860나노미터에서 촬영한 이미지를 사용하여 사진 활성화를 위한 관심 영역 또는 ROI를 정의할 수 있습니다. edit bleach 창에서 상대적 레이저 출력, 반복 횟수 및 스캔 속도를 조정합니다. 사진 활성화의 경우 레이저가 멈췄을 때 표백제를 누르고 860나노미터로 다시 전환한 다음 단일 평면 이미지를 획득하여 결과 사진 활성화 물질의 강도를 평가합니다.

이미지 스택을 수집하여 활성화된 영역의 zsan 또는 두께를 평가합니다. 이러한 방식으로, 레이저 강도 및 노출 지속 시간을 경험적으로 결정할 수 있습니다. 각 클론 또는 교차 사진의 최적 사진 활성화를 위해 실험을 위해 나머지 모든 배아를 활성화합니다.

이러한 조건을 사용하여 장착된 광 활성화 배아를 섭씨 28.5도의 어둠 속에서 0.1% 페닐 티오 요소를 포함하는 E 두 배지에서 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 들어 올립니다. 해부 현미경으로 뾰족한 메스를 사용하여 장착된 배아 근처의 아로스에 V자형 홈을 만들고 홈의 바닥이 배아의 머리를 향하도록 합니다. 노치 지점에 닫힌 집게 세트를 놓습니다.

겸자를 부드럽게 열어 배아의 길이를 따라 아로스를 분리하고 배아를 배지로 방출합니다. 각 배아를 방출한 후 불에 닦인 목초지 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. 화학 흄 후드에서 4% 포름알데히드로 배아를 3시간 동안 고정합니다.

실온에서 탈수, 알칼리성 인산가수분해효소를 사용한 재수화 염색, 공액, 항플루오레세인 및 함께 제공된 텍스트에 설명된 대로 모든 관련 세척을 진행합니다. 500마이크로리터의 여과된 빠른 적색 용액을 배아에 추가합니다. 실온의 어두운 곳에서 배양하고 원하는 신호 대 배경 비율에 도달할 때까지 매시간 새로운 고속 적색 염색 용액으로 보충합니다.

PBST에서 각각 5분씩 3회 세척하여 염색 반응을 중지합니다. 흄 후드에서 4% 포름알데히드의 얼룩을 20분 동안 고정합니다. PBST에서 각각 5분씩 두 번 씻습니다.

각 배아가 튜브 바닥에 정착할 때까지 PBS에서 일련의 25%50% 및 75% 글리세롤 구배를 통해 투명한 배아를 세척합니다. 현미경에서 시각화할 준비가 될 때까지 배아를 섭씨 4도에서 보관합니다. 시각화를 위해 배아를 장착하려면 1밀리리터 주사기를 사용하여 15mm 정사각형 모양의 모서리에 있는 현미경 슬라이드에 20마이크로리터의 투명한 실리콘 그리스 4개를 도포합니다.

그리스 방울 사이에 약 200마이크로리터의 75%글리세롤에 배아를 놓습니다. 배아 위에 커버 슬립을 놓습니다. 글리세롤 용액이 채워질 때까지 덮개를 똑바로 아래로 밀어 부드럽게 밀어 넣습니다.

그리스가 장착된 배아 방울 사이의 공간은 컨포칼 현미경으로 시각화하기 전에 섭씨 4도에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 이 이미지는 신경 유전자의 통제하에 GFP를 발현하는 살아있는 제브라피시 배아를 보여줍니다. 1 세포 단계에서 케이지 플루오레세인 추적염료를 주입한 1개의 프로모터에서, 3 내지 5개의 소마이트 단계에서 선행의 방법을 사용하여

4개의 뇌 원시 영역의 개별 영역은 2개의 광자 레이저에 의해 광적으로 활성화되었으며 케이지되지 않은 플루오레세인 추적 염료를 감지할 수 있었습니다. 광활성화 시술에 이어 배아를 섭씨 28.5도에서 배양하고, 수정 후 24시간 후에 적색으로 안티 플루오레세인 면역염색을 통해 폴리오레세인을 함유한 뇌세포를 추적했습니다. 라벨이 붙은 소수의 세포에 유의하십시오: 일단 숙달되면 사진 활성화 절차는 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다 이 절차를 시도하는 동안 단일 세포 해상도에서 정확한 사진 활성화를 허용하는 최적의 매개변수를 제어하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.