라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피쉬 배아의 단일 세포 해상도에서 화학적으로 케이지드(caged)된 형광 염료와 같은 특정 광 반응성 시약을 광활성화하는 것입니다. 이는 살아있는 유전적 랜드마크를 발현하는 단일 세포 단계의 배아에 광 반응성 시약을 주입하여 관심 세포를 찾아 정밀하게 타겟팅함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 배아를 성장시킨 후 살아있는 배아를 고정시키는 저융점 아가로스(low melting point agarose)에 마운팅합니다.

다음으로, 가시광선 형광 전이 표지를 국소화하기 위해 이광자 현미경을 사용합니다. 그런 다음 원하는 초점 평면에서 광반응제를 활성화하고 광활성화 범위를 모니터링합니다. 이후 발생 단계에서 결과적으로 표지된 세포들의 운명을 추적할 수 있습니다.

이 절차는 살아있는 표본에서 단일 세포 해상도로 다양한 화합물을 활성화하는 데 활용될 수 있습니다. 공초점 현미경이나 플래시 램프와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 낮은 광독성으로 수 마이크론의 축 방향 레벨에서 비교적 깊은 조직의 광활성화를 가능하게 한다는 점입니다. 하지만 여기서 제시된 방법은 셀라인 엣지 트레이싱(seline edge tracing)에 사용되며, 다양한 성분의 광활성화에 적용될 수 있어 발달 및 생리학적 과정에 대한 표적 제어가 가능합니다. 주입 전날 저녁에 교배 탱크를 준비하고, 가시적인 형광 랜드마크를 발현하는 형질전환 라인의 암수 제브라피시를 분리합니다.

본 실험에서 형질전환 라인은 neurogenic N one 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현합니다. 0.2 M potassium chloride에 포함된 5% dextran 결합 caged fluorescein 분주액을 얼음 위에서 해동하십시오. caged fluorescein을 0.2 M potassium chloride로 희석하여 최종 농도를 1%로 맞추십시오. fluorescein은 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 차단하십시오. 제브라피쉬 교배 쌍이 짝짓기를 하도록 둡니다. 수정란이 산란되는 즉시 수집하여 본문에 설명된 대로 세척하십시오. 해부 현미경 하에서 플라스틱 피펫을 사용하여 1세포기 배아를 신선한 E3 배지가 덮인 1% agarose 주입 플레이트로 옮기십시오.

피펫을 사용하여 주입 트러프 내의 배아 방향을 잡습니다. 길게 테이퍼진 모세관 주입 바늘의 팁을 부러뜨립니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 바늘에 약 1 µL의 1% caged fluorescein을 역충전합니다.

시료가 충전된 바늘을 공압식 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 조작기에 장착합니다. 각 배아의 세포질에 2~3 nanoliters의 caged fluorescein을 직접 주입합니다. 실험당 최소 50개의 배아에 주입하십시오.

주입된 배아를 신선한 E three 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮기고, 28.5 °C의 암소에서 원하는 발달 단계까지 배양합니다. 색소 침착을 억제하기 위해 배아 24시간째에 0.1% Phenyl threa를 처리하여 배아 마운팅을 준비합니다. 신선한 E two 배지에 용해된 1% Aros를 15~20개의 60 mm 페트리 접시에 얇게 코팅합니다. Aros가 응고되면 해부 현미경 하에서 접시에 E two 배지를 채웁니다.

날카로운 핀셋을 사용하여 주입된 배아를 코팅된 플레이트로 옮깁니다. 배아가 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. 증류수에 희석한 2% low melting point agarose 분주액을 준비해 둡니다.

72 °C의 히트 블록에서 수행합니다. 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 150 µL의 배지가 담긴 코팅된 배아 하나를 60 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 배아 옆에 비슷한 부피의 2% Agros를 떨어뜨리고, 두 방울을 빠르게 섞어 균질한 1% Agros 방울을 만듭니다.

배아의 등쪽이 대물렌즈를 향하도록 배치합니다. agarose가 응고되도록 기다린 후, 매립된 배아를 E2 배지에 담급니다. 광대역 터너테이블 레이저가 장착된 이광자 현미경 아래의 플레이트 홀더에 갓 마운팅한 배아를 놓습니다.

광활성화 과정을 시작하기 전, 발현 조직의 가장 복측(ventral) 가장자리부터 배측(dorsal) 가장자리까지 860 nanometers 간격으로 이미지 시리즈를 획득하십시오. Z 평면상에서 이미지 간격을 6 microns로 설정하십시오. 광활성화를 위한 대상 Z 평면을 선택하고 GFP를 기준점으로 사용하여 초점을 맞추십시오.

관심 영역을 찾으십시오. 860 nanometers에서 단일 이미지를 촬영하고, 정확한 정렬을 위해 이를 별도의 창에 띄워 놓으십시오. edit bleach 메뉴를 열기 전에 720 nanometers 레이저가 모드 잠금 상태여야 하는 것이 매우 중요합니다.

860 nanometer에서 촬영한 이미지를 사용하여 광활성화를 위한 관심 영역(ROI)을 설정하십시오. Bleach 편집 창에서 상대적 레이저 출력, 반복 횟수 및 스캔 속도를 조정하십시오. 광활성화를 위해 레이저가 멈췄을 때 bleach를 누르고, 다시 860 nanometer로 전환하여 단일 평면 이미지를 획득함으로써 광활성화된 물질의 강도를 평가하십시오.

활성화된 도메인의 z-축 범위(zsan) 또는 두께를 평가하기 위해 이미지 스택을 수집하십시오. 이러한 방식으로 레이저 강도와 노출 시간을 경험적으로 결정할 수 있습니다. 각 클론 또는 교차 사진의 최적의 광활성화를 위해, 실험에 사용할 나머지 배아를 모두 활성화하십시오.

이러한 조건 하에서, 0.1% Phenyl thio urea가 포함된 E2 배지 내 28.5 °C의 암소에서 고정된 광활성 배아가 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 실체 현미경 하에서, 끝이 뾰족한 메스를 사용하여 고정된 배아 근처의 융기 부위에 V자형 홈을 만들며, 홈의 바닥 부분이 배아의 머리 쪽을 향하도록 합니다. 닫힌 상태의 핀셋을 홈의 정점에 놓습니다.

포셉을 조심스럽게 벌려 배아의 길이를 따라 아로스를 분리하고 배아를 배지로 방출합니다. 각 배아를 방출한 후, 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 마이크로 원심 분리 튜브에 수집합니다. 화학 흄 후드 내에서 4% formaldehyde로 배아를 3시간 동안 고정합니다.

실온에서 동반된 텍스트에 기술된 대로 탈수, 재수화, 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase), 접합된(conjugated) 항-플루오레세인(anti fluorescein) 염색 및 모든 관련 세척 과정을 진행하십시오. 여과된 fast red 용액 500 µL를 배아에 첨가하십시오. 실온의 암소에서 배양하며, 원하는 신호 대 배경 비율(signal to background ratio)에 도달할 때까지 매 시간 새로운 fast red 염색 용액으로 교체해 주십시오.

PBST로 5분씩 3회 세척하여 염색 반응을 중단시킵니다. 흄 후드 내에서 4% formaldehyde로 20분 동안 염색물을 고정합니다. PBST로 5분씩 2회 세척합니다.

투명해진 배아를 PBS 내의 25%, 50%, 75% 글리세롤 농도 구배로 순차적으로 세척하여 각 배아가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 처리합니다. 현미경 관찰 준비가 될 때까지 배아를 4 °C에서 보관합니다. 관찰을 위해 배아를 고정하려면, 1 mL 주입기를 사용하여 현미경 슬라이드 위에 15 mm 정사각형 모양의 네 모서리에 투명 실리콘 그리스를 20 µL씩 네 군데에 도포합니다.

그리스 방울 사이에 약 200 µL의 75% glycerol을 넣고 배아를 배치합니다. 배아 위에 커버슬립을 덮습니다. glycerol 용액이 가득 찰 때까지 커버슬립을 조심스럽게 수직으로 누릅니다.

그리스에 고정된 배아 방울 사이의 공간은 공초점 현미경으로 시각화하기 전 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 이 이미지는 neurogenin1 프로모터 제어 하에 GFP를 발현하는 살아있는 제브라피시 배아를 보여줍니다. 이 배아는 앞서 설명한 방법을 사용하여 1세포기 단계에서 caged fluorescein 추적 염료가 주입되었으며, 현재 3~5 somite 단계입니다.

두 광자 레이저를 통해 뇌 원기의 특정 영역을 광활성화하였으며, 이에 따라 케이지가 해제된 플루오레세인 추적 염료가 검출되었습니다. 광활성화 절차 이후 배아를 28.5 °C에서 배양하였으며, 수정 후 24시간째에 케이지가 해제된 플루오레세인을 포함하는 뇌 세포를 항-플루오레세인 면역 염색을 통해 적색으로 추적하였습니다. 라벨링된 세포 수가 적음에 유의하십시오. 광활성화 절차를 숙달하면 단 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 단일 세포 해상도로 정밀한 광활성화를 가능하게 하는 최적의 파라미터를 제어하는 것이 중요합니다.