Name: 50 % Haemolytic 보완 (CH 측정 50) 활동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-29T18:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 CH 50 보완 활성 측정법을 통해 혈청의 면역 반응 기능을 정량화하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구와 임상 진단에 필수적인 도구로 활용됩니다.

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저자는 촬영에 대한 기술과 미스터 폴 목사는 수행 미스 로라 매튜스를 감사하고 싶습니다. 이 프로젝트는 사우스 오스트 레일 리아 대학, 연구소의 의학 프로그램에 의해 투자되었다.

5 배 Veronal 버퍼 살린 (VBS)의 준비 <ol><li> Veronal 버퍼 살린 (VBS)를 준비하려면, 별도의 세 가지 솔루션을 준비해야합니다. </li><li> 증류수의 350ml에 나트륨 Barbitone의 NaCl과 0.94gm의 21.25gm을 용해하여 용액 1을 준비합니다. NaCl과 나트륨 Barbitone의 최종 농도는 각각 1.02M과 13mM 있습니다. </li><li> 뜨거운 증류수의 125ml에 Barbitone의 1.44gm을 용해하여 용액 2를 준비합니다. Barbitone의 최종 농도는 62.5mM입니다. </li><li> 증류수의 100ml에 CaCl 2 MgCl 2 4.41gm의 20.33gm을 용해하여 용액 세를 준비합니다. MgCl 2, CaCl 2의 최종 농도는 각각 2.18M과 440mM입니다. </li><li> 믹스 솔루션 1, 2 룸 온도 냉각. </li><li> 통합 솔루션이 냉각되면, 솔루션 3 1.25ml를 추가하고 1M HCL을 사용하여 7.3-7.5 수있는 산도를 조정합니다. </li><li> 배 재고 솔루션을 준비하는 증류수로 500ml로 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 1X 작업 솔루션을 준비하려면, 증류수와 주식 1:5 희석. </li></ol> haemolysin와 양 적혈구의 Sensitisation <ol><li> 첫째 VBS로 1시 50분를 diluting하여 haemolysin 준비 </li><li> SRBC의 위해 4ml는 VBS의 6ml를 추가하고 부드럽게 반전에 의해 믹스 </li><li> 600g X 오분에서 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 취소하고 세포를 다른 2 번 씻어 </li><li> 최종 세척 후, 세포를 싣고 900g X의 오분의 세포를 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 취소하고 포장 세포의 10 % 즉, 솔루션 0.5ml를 준비하는 충분한 VBS에있는 세포를 resuspend는 버퍼의 5 ML에 resuspended 아르 </li><li> 지속적으로 소용돌이 치는 동안 세포 haemolysin의 동일한 음량을 (토끼 안티 양 적혈구 세포 항체) 추가 Dropwise </li><li> 물 목욕 30 분 30 ° C에서 알을 품다 </li><li> 부드럽게 세포 매 십오분 믹스 </li><li> Sensitised SRBC 4에서 하룻밤 저장할 수 있습니다 ° C </li></ol> CH 50 검정 <ol><li> 1시 8분, 1시 16분, 1시 32분, 1:64 및 1:128와 중복의 튜브 일련의 라벨. </li><li> 중복 각 VBS의 제어 및 시험 혈청의 두 배 시리얼 dilutions 일련의 준비 </li><li> 1시 4분 (100ml + 300ml 혈청 VBS)에서 시작하고 다음 표시된 튜브에 시료의 200ml를 전송할 수 있습니다. </li><li> 신선한 피펫 팁과 다음 희석에 dilutions 및 전송 200ml 사이에 철저히 섞는다. </li><li> 다섯 dilutions이 이루어질 때까지 반복합니다. </li><li> 최종 1:128 희석에서 200ml를 폐기하십시오. </li><li> 모든 튜브에 정지 sensitized SRBC의 200ml를 추가합니다. </li><li> 라벨 두 개의 튜브로 빈과 sensitized SRBC + 200ml VBS의 200ml를 추가합니다. 이러한 튜브는 VBS의 SRBC의 자발적인 용해를 측정합니다. </li><li> TOTAL 용해와 같은 다른 두 개의 튜브 라벨과 sensitized SRBC + 200ml 증류수의 200ml 추가합니다. </li><li> 부드럽게 모든 튜브를 섞는다. </li><li> 37 ° C 십오분 후 혼합 waterbath 30 분 알을 품다. </li><li> 퇴적물 RBCs를 5 분 1천5백g에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 96 잘 플랫 바텀 플레이트에 잘 각 튜브의 표면에 뜨는의 100ml를 전송합니다. </li><li> 각 잘하는 증류수의 100ml를 추가합니다. </li><li> 플레이트 분광 광도계를 사용하여 540nm에서 샘플 흡광도를 읽어보십시오. </li></ol> 계산 <ol><li> 각 샘플에 대한 평균 흡광도를 계산 </li><li> 모든 샘플에서 빈 흡광도 (자발적인 용해)을 빼기 </li><li> 다음 수식을 사용하여 각 희석에 대한 %의 용해를 계산 : <img src="/files/ftp_upload/1923/1923eq1.jpg" alt="방정식" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식"></li><li> 수평축에 혈청 희석 대 비율 용해 (수직 축)를 플롯. </li><li> 제어 및 시험 혈청 (그림 2) 50 % haemolysis에 필요한 희석을 계산합니다. </li></ol> 대표 결과 : 비디오는 대표적인 결과의 예를 포함하고 있습니다. 연습에서는 컨트롤 혈청 또한 시험 혈청 동시에 실행하고 같은 방식으로 처리됩니다. 아래 (표 1) 검사 혈청 샘플에서 예제 데이터입니다. 데이터는 5.3에서 제시한 공식에 따라 조작할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> OD 540 </td><td> 평균 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 공백 </td><td> 0.042, 0.044 </td><td> 0.043 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 총 용해 </td><td> 0.183, 0.183 </td><td> 0.183 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td> 노동 희석 </td><td> OD 540 </td><td> 평균 </td><td> 평균 - 빈 </td><td> %의 용해 </td></tr><tr><td> 1시 8분 </td><td> 0.200, 0.219 </td><td> 0.210 </td><td> 0.168 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 1시 16분 </td><td> 0.179, 0.173 </td><td> 0.176 </td><td> 0.134 </td><td> 93 </td></tr><tr><td> 1시 32분 </td><td> 0.134, 0.110 </td><td> 0.122 </td><td> 0.08 </td><td> 55 </td></tr><tr><td> 1:64 </td><td> 0.053, 0.066 </td><td> 0.059 </td><td> 0.017 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 1:128 </td><td> 0.044, 0.045 </td><td> 0.045 </td><td> 0.003 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table><img src="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. 고전적인 보완 경로의 활성화. 고전 경로가 대상 세포의 표면에 결합 면역 글로불린 - M (IgM) 또는 면역 글로불린 - G (IgG)에 의해 활성화됩니다. AB의 FC 부분은 C1q에 바인딩, C1r가 활성화되고 이것은 차례로 함께 C1s 두 분자를 활성화 C1r의 다른 분자를 활성화합니다. C1s 지금도 죽습니다 C2에 대한 구속력이 사이트를 노출 C4를 클리브스. C4b 및 C2A의 바인딩은 C3의 convertase로 불리는 복잡한 형성에 이르게한다. 이 복잡​​한 이제 C5의 convertase을 형성 C3의 convertase와 결합 일부의 C3 성형 C3a와 C3b를 클리브스. 이 복잡​​한 이제 막 공격 복잡한 (MAC)의 형성을 시작 C6에 바인딩 결과 C5b과 C5의 역할을합니다. C8 설정 행위의 궁극적 C9에 대한 최종 MAC의 형성에 결과 C7에 C5b6 행위. (Goldsby 외, 2003). <img src="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 샘플 데이터하려하고 제어 및 테스트 혈청 샘플에 대한 CH50을 계산. (A), 컨트롤 (•) 및 테스트 () 혈청 샘플을 모두 계산된 비율 (%)가 용해는 희석 요인이 역모를 꾸몄다됩니다. 이 그래프 라인과 교차 다음 수직선이 희석로 그려진까지 (B) 50 % 용해를 계산하려면, 라인은 50 % %의 가치에서 도출됩니다. 이 예제에서는 테스트 혈청의 제어 및 21.6 배 희석의 35 배 희석은 50 %의 용해를 달성해야합니다. 이 데이터는 50 %의 용해에 도달되기 전에 덜 희석 필요한 컨트롤에 비해 테스트 혈청에있는 적은 보완이있다는 것을 나타냅니다. 컨트롤 샘플도 1시 8분 희석시&gt; 100 % 용해를 보여줍니다. 이것은 대부분 보완 구성 요소로 증류수와보다 효율적으로 용해하여 SRBC의 불완전한 용해에 의한 것입니다.

<ol><li>Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldsby%2C+RA+%22Immunology%22">Immunology</a>. , W.H. Freeman. (2003).</li>
</ol>

CH 50 검정은 많은 interferences의 적용을받습니다. 일부 SRBC는 활동을 보완하기 위해 무관 자연 haemolysis의 결과로, 다른 사람보다 더 연약하고 있습니다. 토끼 항체의 친화도는 많은에서 많은 한 제조 업체에서 다른 다릅니다, 이것은 SRBC에 바인딩 항체의 양을 영향을 미칩니다. 또한, 항체 코팅 SRBC의 다양한 양의와 세포 항체 결과 SRBC을 sensitizing의 과정. 표본 수집 및 저장 오류의 중요한 잠재적인 소스입니다. 보완 구성 요소 예 : C1q, C3, C4 및 C5 매우 불안 정한 있으므로 적절한 샘플 처리가 중요합니다. 더위에 장시간 노출은 보완 작업을 감소하고 보완 구성 요소의 비활성 조각을 생산합니다. 가능한 오류의 많은 소스로 감지하기 위해서는 알려진 CH 50 가치 분석을 수행할 때마다 제어 혈청을 검사하고 알려진 혈청 컨트롤의 허용 값을 재현하는 것이 중요합니다. haemolysis의 기초 수준이나 CH 50 가...

<table><tbody><tr><td>양 적혈구</td><td>CSL</td><td>2490201</td><td>최종 농도 1%로 사용</td></tr><tr><td>혈청</td><td></td><td></td><td>인간 혈청</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated</td><td>AbD Serotec</td><td>C12HSB</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 평평한 바닥 플레이트</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Veronal 완충 식염수</td><td></td><td></td><td>최종 농도 1x로 사용</td></tr><tr><td>항온 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 실온/배양기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

50 % haemolytic 보완 (ch 측정 50</sub혈청>) 활동

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

보완 시스템은 세포 용해를 대상으로 이끌 활성화되고 opsonisation 통해 phagocytosis을 용이하게 단백질의 그룹입니다. 개인 보완 구성 요소가 있지만 이것은 경로의 활동에 같은 정보를 제공하지 않습니다 계량하실 수 있습니다. CH<sub&gt; 50</sub&gt; 클래식 보완 경로 (그림 1)의 정품 인증에 대한 심사 분석하고 그것은 경로의 모든 구성 요소의 감소, 부재 및 / 또는 비활성으로 구분합니다. CH<sub&gt; 50</sub&gt; 토끼 안티 양 적혈구 세포 항체 (haemolysin)로 사전 코팅 양 적혈구 (SRBC)을 lyse하는 고전 경로의 혈청 보완 구성 요소의 기능 능력을 테스트합니다. 항체 - 코팅 SRBC은 시험 혈청, 보완의 고전 경로가 활성화되고 haemolysis 결과 incubated 때. 보완 구성 요소가 없을 경우, CH<sub&gt; 50</sub&gt; 레벨 제로합니다, 전통적인 경로 중 하나 이상의 구성 요소가 감소하는 경우, CH<sub&gt; 50</sub&gt;가 감소됩니다. 최적 sensitized SRBC의 고정 볼륨은 각 혈청 희석에 추가됩니다. 부화 후, 혼합물은 centrifuged되고 haemolysis의 정도는 540nm에서 뜨는로 출시 헤모글로빈의 흡광도를 측정하여 계량입니다. 보완 활동의 금액은 항체 코팅 SRBC을 lyse에 혈청 검사의 다양한 dilutions의 용량을 검사에 의해 결정됩니다. 이 비디오는 고전적인 보완 경로의 보완 활동의 수준을 분석에 관련된 실험 단계를 설명합니다.

고전 경로는 항체에 의해 활성화되고 대상 세포 용해에 culminates 있습니다. CH<sub&gt; 50</sub&gt; 검정은 혈청 샘플의 보완 활동의 측정을 제공합니다. 이 비디오는 CH를 결정에 관련된 단계를 설명합니다<sub&gt; 50</sub&gt; 혈청 샘플의 결과의 계산 및 해석.

50 % Haemolytic 보완 (CH 측정 50</sub혈청>) 활동

보체계는 활성화 시 표적 세포의 용해를 유도하고 옵소닌화를 통해 식세포 작용을 촉진하는 단백질 집단입니다. 개별...

혈청의 50% 용혈 보체 CH 50 활성을 측정합니다. 얼음 위에 보관된 테스트 혈청 200 µL와 1000 µL를 분주할 수 있는 피펫, 감작된 양 적혈구, Varone 완충 식염수, 증류수가 필요합니다. 테스트용 튜브, 기저치 및 전체 용혈용 튜브, 볼텍스 믹서, 그리고 96웰 평저 플레이트를 준비하십시오. 각 튜브에 대조군과 최종 희석 배수를 개별적으로 표시합니다. 본 실험에서는 1:8 희석으로 시작합니다.나머지 튜브들에 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 희석액 및 공시료(blank), 전체 용해(total lysis)라고 라벨을 붙여 2배 연속 희석을 계속합니다. 모든 튜브의 라벨링이 완료되면 시험 혈청의 희석을 시작할 수 있습니다. 먼저 새 튜브에 300 µL의 R buffer saline을 옮겨 담으십시오.이제 혈청 100 µL를 300 µL의 R buffer saline에 옮깁니다. 이렇게 하면 1:4의 초기 희석 배수가 됩니다. 혈청 샘플이 충분히 혼합되었는지 확인하십시오.이제 이전에 라벨을 붙여둔 튜브에 200 µL의 royal buffer saline을 옮깁니다. 또한, 총 용해 튜브 중 두 개의 공백 튜브에 200 µL의 royal buffer saline을 추가합니다. Verona buffet saline이 아닌 200 µL의 증류수를 추가합니다.이제 1/4로 희석된 혈청 200 µL를 1/8로 표시된 튜브로 옮깁니다. 앞서 1/8부터 1/128까지의 희석 시리즈 튜브에 albumin buffered saline 200 µL를 각각 옮겨 두었습니다. 이렇게 하면 1/8 희석액이 만들어집니다.시료를 잘 섞은 다음, 200 µL를 16번에서 표시된 1번 튜브로 옮깁니다. 모든 튜브 시리즈의 희석이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 최종 부피가 200 µL가 되도록 1:28 희석액에서 200 µL를 버립니다.감작된 양 적혈구가 시간이 지나면서 가라앉았을 수 있습니다. 튜브를 여러 번 조심스럽게 뒤집어 이들을 다시 현탁시켜야 합니다. 완전히 재현탁되면 감작된 양 적혈구 200 µL를 준비된 각 튜브에 옮깁니다.혈청이 적혈구와 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 공시료(blank) 튜브에 감작된 양 적혈구를 첨가하면 자발적 용혈을 측정할 수 있으며, 전체 용혈(total lysis) 튜브에 혈액을 첨가하면 100% 값을 결정할 수 있습니다. 볼텍스 믹서를 낮게 설정하여 각 튜브를 부드럽게 혼합하십시오. 이제 튜브를 37 °C 항온수조에 넣고 30분 동안 배양하십시오.15분간 배양한 후, 튜브를 다시 한번 가볍게 볼텍싱하고 15분 더 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 4°C로 설정된 원심분리기로 옮겨 1500 G에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브를 조심스럽게 꺼내 적절한 홀더에 놓습니다. 여기서 적혈구 펠렛을 확인할 수 있으며, SNA는 붉은색으로 나타납니다.헤모글로빈 전이를 위해, 96웰 평저 플레이트의 필요한 수의 웰에 3차 증류수 100 µL를 분주합니다. 펠릿이 옮겨지지 않도록 주의하며 상층액 100 µL를 96웰 플레이트의 적절한 웰로 전이합니다. 모든 시료가 플레이트에 로딩되면, 540 nm로 설정된 플레이트 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정합니다.여기에 두 번의 반복 실험, A1과 B1에 대한 원시 흡광도 데이터가 있습니다. 1/8 희석 배수를 참조하십시오.그 다음으로 16배, 32배, 64배, 128배 희석된 샘플의 데이터를 얻습니다. A6와 B6는 공시료(blank)이며, A7과 B7은 완전 용해(total lysis) 샘플입니다.데이터 수집이 완료되면, 각 반복 시료의 평균 흡광도를 계산해야 합니다. 그런 다음 모든 시료에서 자연 용해 값인 공시료(blank) 흡광도를 뺍니다. 모든 데이터가 수집되면, 다음 공식을 사용하여 각 희석 배수별 용해 백분율을 계산할 수 있습니다.모든 데이터 계산이 완료되면, 세로축에 용해 백분율을, 가로축에 혈청 희석 배수를 플롯합니다. 이렇게 얻은 그래프를 사용하여 감작된 양 혈구의 50%를 용해시키는 데 필요한 혈청 희석 배수를 계산할 수 있습니다. 이 그래프는 혈청의 희석 배수에 따른 용해 백분율을 보여줍니다.그 다음 50% lysis 지점부터 곡선과 교차하는 지점까지 선을 긋습니다. 곡선과 교차하는 지점에서 가로축으로 수직선을 내립니다. 이 값은 두 혈청 샘플을 비교할 때 50% lysis를 보장하기 위해 혈청을 희석해야 하는 희석 배수를 나타내며, CH 50의 차이가 있는지 판단하기 위해 50% lysis를 제공하는 이 희석 배수를 측정값으로 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

Haemagglutination는 항체가 적혈구에 바인딩 유착의 한 형태입니다. 적혈구가 모두 쉽게 사용할 수 있으며 그 결과는 즉시 육안을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이 비디오는 결과를 해석하고 titre을 결정, haemagglutination 분석에 관련된 단계를 설명합니다.

Haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 Titre를 결정

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이 동영상은 혈청에 존재하는 항체의 보체 매개 살균 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 이 접근법은 분리된 혈청과 병원성 박테리아 및 외인성 보체 단백질을 결합합니다. 배양 시, 박테리아는 한천 플레이트에서 성장하고, 생산된 콜로니는 혈청 살균 역가를 측정하기 위해 정량화됩니다.

항체의 보체 매개 박테리아 활성을 위한 혈청 박테리아 분석

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인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트

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학습하세요 CH 50 보완 활성 측정법을 통해 혈청의 면역 반응 기능을 정량화하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구와 임상 진단에 필수적인 도구로 활용됩니다.

50 % Haemolytic 보완 (CH 측정_{50) 활동}

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