50 % Haemolytic 보완 (CH 측정 _{50) 활동}

혈청의 50% 용혈 보체 CH 50 활성을 측정합니다. 얼음 위에 보관된 테스트 혈청 200 µL와 1000 µL를 분주할 수 있는 피펫, 감작된 양 적혈구, Varone 완충 식염수, 증류수가 필요합니다. 테스트용 튜브, 기저치 및 전체 용혈용 튜브, 볼텍스 믹서, 그리고 96웰 평저 플레이트를 준비하십시오. 각 튜브에 대조군과 최종 희석 배수를 개별적으로 표시합니다. 본 실험에서는 1:8 희석으로 시작합니다.

나머지 튜브들에 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 희석액 및 공시료(blank), 전체 용해(total lysis)라고 라벨을 붙여 2배 연속 희석을 계속합니다. 모든 튜브의 라벨링이 완료되면 시험 혈청의 희석을 시작할 수 있습니다. 먼저 새 튜브에 300 µL의 R buffer saline을 옮겨 담으십시오.

이제 혈청 100 µL를 300 µL의 R buffer saline에 옮깁니다. 이렇게 하면 1:4의 초기 희석 배수가 됩니다. 혈청 샘플이 충분히 혼합되었는지 확인하십시오.

이제 이전에 라벨을 붙여둔 튜브에 200 µL의 royal buffer saline을 옮깁니다. 또한, 총 용해 튜브 중 두 개의 공백 튜브에 200 µL의 royal buffer saline을 추가합니다. Verona buffet saline이 아닌 200 µL의 증류수를 추가합니다.

이제 1/4로 희석된 혈청 200 µL를 1/8로 표시된 튜브로 옮깁니다. 앞서 1/8부터 1/128까지의 희석 시리즈 튜브에 albumin buffered saline 200 µL를 각각 옮겨 두었습니다. 이렇게 하면 1/8 희석액이 만들어집니다.

시료를 잘 섞은 다음, 200 µL를 16번에서 표시된 1번 튜브로 옮깁니다. 모든 튜브 시리즈의 희석이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 최종 부피가 200 µL가 되도록 1:28 희석액에서 200 µL를 버립니다.

감작된 양 적혈구가 시간이 지나면서 가라앉았을 수 있습니다. 튜브를 여러 번 조심스럽게 뒤집어 이들을 다시 현탁시켜야 합니다. 완전히 재현탁되면 감작된 양 적혈구 200 µL를 준비된 각 튜브에 옮깁니다.

혈청이 적혈구와 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 공시료(blank) 튜브에 감작된 양 적혈구를 첨가하면 자발적 용혈을 측정할 수 있으며, 전체 용혈(total lysis) 튜브에 혈액을 첨가하면 100% 값을 결정할 수 있습니다. 볼텍스 믹서를 낮게 설정하여 각 튜브를 부드럽게 혼합하십시오. 이제 튜브를 37 °C 항온수조에 넣고 30분 동안 배양하십시오.

15분간 배양한 후, 튜브를 다시 한번 가볍게 볼텍싱하고 15분 더 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 4°C로 설정된 원심분리기로 옮겨 1500 G에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브를 조심스럽게 꺼내 적절한 홀더에 놓습니다. 여기서 적혈구 펠렛을 확인할 수 있으며, SNA는 붉은색으로 나타납니다.

헤모글로빈 전이를 위해, 96웰 평저 플레이트의 필요한 수의 웰에 3차 증류수 100 µL를 분주합니다. 펠릿이 옮겨지지 않도록 주의하며 상층액 100 µL를 96웰 플레이트의 적절한 웰로 전이합니다. 모든 시료가 플레이트에 로딩되면, 540 nm로 설정된 플레이트 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정합니다.

여기에 두 번의 반복 실험, A1과 B1에 대한 원시 흡광도 데이터가 있습니다. 1/8 희석 배수를 참조하십시오.

그 다음으로 16배, 32배, 64배, 128배 희석된 샘플의 데이터를 얻습니다. A6와 B6는 공시료(blank)이며, A7과 B7은 완전 용해(total lysis) 샘플입니다.

데이터 수집이 완료되면, 각 반복 시료의 평균 흡광도를 계산해야 합니다. 그런 다음 모든 시료에서 자연 용해 값인 공시료(blank) 흡광도를 뺍니다. 모든 데이터가 수집되면, 다음 공식을 사용하여 각 희석 배수별 용해 백분율을 계산할 수 있습니다.

모든 데이터 계산이 완료되면, 세로축에 용해 백분율을, 가로축에 혈청 희석 배수를 플롯합니다. 이렇게 얻은 그래프를 사용하여 감작된 양 혈구의 50%를 용해시키는 데 필요한 혈청 희석 배수를 계산할 수 있습니다. 이 그래프는 혈청의 희석 배수에 따른 용해 백분율을 보여줍니다.

그 다음 50% lysis 지점부터 곡선과 교차하는 지점까지 선을 긋습니다. 곡선과 교차하는 지점에서 가로축으로 수직선을 내립니다. 이 값은 두 혈청 샘플을 비교할 때 50% lysis를 보장하기 위해 혈청을 희석해야 하는 희석 배수를 나타내며, CH 50의 차이가 있는지 판단하기 위해 50% lysis를 제공하는 이 희석 배수를 측정값으로 사용할 수 있습니다.