Name: 에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis thaliana에서 형광 활성화 세포 분류를 이용한 세포 유형별 프로토플라스트 분리 및 유전자 발현 분석 방법. 이 기술은 조직 특이적 phytochrome 반응 연구에 활용됩니다.

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식물에 phytochrome 응답에있는 몽고메리 실험실 작업은 국립 과학 재단 (부여 BLM없이. MCB - 0919100) 및 화학 과학 Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학 사무소, 과학의 사무실 미국학과로 지원됩니다 에너지 (BLM 부여 안돼. DE FG02 91ER20021). 우리는 촬영 기간 동안 기술 지원을 멜리사 휘태커 감사하고 비판적으로 실험 지원, 개발 및 공촛점와 지원 Arabidopsis 원형질 정렬 박사 멜린다 프레임에 대한 프로토콜을 정렬 형광 활성화 셀을 최적화와 지원 박사 루이스 킹을 위해, 스테파니 코스티건을 원고를 읽고 현미경. 우리는 그래픽 디자인 지원 및 편집 지원 캐런 버드 말린 카메론 감사합니다.

1. 식물의 성장 <ol><li> 격리된 확인 UAS - BVR X GAL4 - GFP 향상제 트랩 라인과 같이 4 설명 (요약에 대한 그림을 참조하십시오. 1) 야생 입력하거나 부모의 라인이 땅에서 sown 있으며, 즉, 한 줄에 ~ 2000 소독 종자. </li><li> 식물 22 100 μmolm -2 S -1의 하얀 조명 아래에서 흙 5 주 동안 재배 ° C와 70 % 습도. </li></ol> 2. 리프 원형질 분리 (Denecke 및 비테일 9 적응) <ol><li> protoplasts를 분리, 텍, 버퍼를 준비합니다. - (N - morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES, 2.56 ㎜), 0.75 g의 염화칼슘 이수화물 (CaCl 2 0.2 H 2 O, 6.75 3.1 g Gamborg의 B5 소금, 0.5 g 2 : 일리터 텍스 버퍼 들어, 다음과 같은 구성 요소를 달다 음), 0.25 g의 질산 암모늄 (NH 4 NO 3, 3.12 MM)은 136.9 g의 자당 (0.4M)가. deionized, 증류수의 ~ 900 ML (ddH 2 O)에서 완전히 구성 요소를 디졸브 1과 5.7으로 산도를 가지고 M 코. 1리터와 진공 펌프에 연결된 0.2 μm의 병 - 최고의 필터 소독 필터 최종 볼륨을 가져와. </li><li> 식물의 녹색 잎이 건강 (느슨하게 비커에 포장 단풍 ~ 250 ML) 수집하고 ~ 40 ML ddH 2 O 4 배와 린스, 살균 ddH 2 O.로 두 번 rinsing 다음 얇은 스트립에 # 20 메스, 절단 잎을 사용하고 동일이 50 ML 멸균 플라스틱 튜브로 조직을 나눕니다. 10X 잎 소화 주식 솔루션 (10X 잎 소화 주식 솔루션 5 ML의 나누어지는를 추가하여 1X 잎 소화 혼합물을 준비 : W / V Macerozyme R - 10, 4% W / V 텍 버퍼에 Cellulase "Onozuka"R - 10, 2 % 해산 0.2 μm의 45 ML 신선한 텍스 버퍼)를 -80 ° C에서 5 ML aliquots를 필터링하고 동결로 소독 필터. 모든 잎 조직을 커버 50 ML 튜브 당 1X 잎 소화 믹스의 ~ 25 ML을 추가합니다. </li><li> 부드러운 떨고있는 로커에 실온에서 3 시간 보육 다음 물을 펌프에 연결된 진공 건조기를 사용하여 실온에서 1 시간 오픈 튜브의 소화 혼합물의 잎 조직에 침투 진공. 1X 잎 소화 믹스의 잎 조직과 덮인 튜브는 빛에 노출을 방지하기 위해이 과정에서 알루미늄 호일에 싸서 보관됩니다. </li><li> 삼시간 후, protoplasts 발표 ~ 2 분 동안 로커 속도를 향상시킬 수 있습니다. 부스러기를 제거하고 멸균 유리 비커에 여과물를 수집하기 위해 멸균 치즈 천의 두 레이어를 통해 원유 원형질의 현탁액을 필터링합니다. 멸균 페트리 접시에 멸균 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 여과물을 필터링합니다. 을 통해 흐름을 수집하고 새로운 살균 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 멸균 페트리 접시를 세척하여 표면을 준수하는 어떠한 protoplasts를 수집하는 신선한 텍스 버퍼의 15-20 ML에 대해 사용합니다. </li><li> 10 100xg에서 스윙 버켓 로터를 사용하여 ° C를 15 분 (가속 6 감속 0)에 대한 통해 흐름을 원심 분리기. </li><li> ~ 25을 제거 - 잔류 및 pelleted 파편을 포함하는 부동 원형질 층 아래의 액체 30 ML을 부동 원형질 층을 교란하고 ~ 10 떠나지 않고 연동 펌프에 연결된 멸균 9 "유리 파스퇴르 피펫과 함께 - 15 ML 볼륨을. </li><li> 부드럽게 protoplasts을 resuspending 동안 40 ML의 최종 볼륨에 신선한 텍스 버퍼를 추가합니다. </li><li> 가능한 많은 세포 파편을 제거하는 단계를 2.5-2.7 두 번 반복합니다. 원심 분리 시간은 첫 번째 반복에서 10 분 및 최종 반복 5 분 줄어 듭니다. </li><li> 새로운 15 ML 튜브로 절단, 살균 한 ML 전송 피펫과 부동 protoplasts을 대기음. 4에서 2 시간 동안을 정렬하거나 어둠 속에 저장 ° C를 정렬까지 직접 진행합니다. </li></ol> 3. 형광 - 활성 셀 정렬 (외과)에서 원형질의 정렬 <ol><li> 정렬하기 전에, 원형질 무결성 및 원형질의 수영장에서 GFP 형광의 존재를 확인하기 위해 여기에 488 - nm의 레이저를 사용하여 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 의해 protoplasts을 확인합니다. 최소한의 파편 외과 정렬 노즐을 막히는 것을 방지하는 것이 필요합니다. </li><li> 적응 프로토콜 10을 다음과 주위에 9 PSI의 시스템 압력과 6,000 달러와 15000 사이의 행사 가격에서 매크로 정렬 머리에 200 μm의 노즐을 사용하여 외과 통해 텍 버퍼 (BD FACSVantage SE, BD Biosciences)에 정렬 고립 protoplasts. </li><li> 야생 형이 아닌 GFP의 protoplasts은 autofluorescence 임계값을 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> GFP 양성 protoplasts, 30분의 530 밴드를 사용하여 GFP 형광을 확인하기 위해 488 - NM 아르곤 라인에 공기 냉각 아르곤 레이저 (스펙트럼 물리 모델 177, 뉴 포트 주식 회사, 어바인, CA) 100 MW에서 운영을 사용하여 정렬 세포를 수집하는 필터를 전달합니다. </li><li> GFP 양성 protoplasts의 수집에 따라, 단계 3.1 상세으로 CLSM으로 정렬 protoplasts을 확인합니다. </li><li> Qiagen RNeasy 플랜트 미니 키트를 사용하여 정렬 protoplasts에서 총 RNA를 추출합니다. Affymetrix GeneChip Expr에서 설명한대로 cDNA가 다음 하이브 리다이 제이션 준비할 수ession 분석 기술 매뉴얼 후 AtH1 Arabidopsis Affymetrix 전체 게놈 배열에 hybridized. </li></ol> 대표 결과 우리는 외과 (그림 2)에 의해 GFP의 채널에 GFP 양성 세포의 상당수를 발견했습니다. 혈관과 피부 표현과 선, J1071은 ~ 1.4 %의 GFP 양성 protoplasts 있었 반면, GFP 향상제 - 트랩 부모, constitutively GFP - 표현 라인, J0571, 표시 ~ 17 %로 24% GFP 양성 protoplasts를 사용하여 최적화 assays에서 (표 1). 1 H에 대한 J0571 protoplasts 3 X 500 μl (원형질의 정지 ~ 1.5 ML 합계)의 정렬하면 ~ 100,000 GFP 양성 protoplasts했다. 1.5 H에 대한 J1071 protoplasts 3 X 500 μl (~ 1.5 ML 총 원형질 서스펜션)의 정렬하면 ~ 3000 GFP 양성 protoplasts했다. 분류가 (그림 3C 및 3E) 실시되기 전에 공촛점 이미지 J0571 및 J1071 모두 샘플 protoplasts 매우 높은 수율을 표시하고 정렬 분수는 밝은 GFP - 형광 protoplasts를 (그림 3G 및 표시되지 데이터)가 들어 있습니다. 이 발견은 그대로 GFP 양성 protoplasts가 외과로 정렬할 수 있습니다 확인합니다. 비 GFP의 protoplasts 또한 정렬 및 별도의 채널에 수집하실 수 있습니다. 비 GFP의 protoplasts은 holophytochrome 수준의 감소에 따라 유전자 발현의 구체적인 변화를 감지하기 위해 후속 microarray 분석을위한 이상적인 부정적인 제어 역할을합니다. 격리 protoplasts (1 ML) fluorospectrometry (그림 4)에 의해 검출을위한 충분한 수량의 산출의 RNA에서 RNA 추출. 절연 RNA는 NanoDrop 악기 (NanoDrop 1000, 써모 사이 언티픽)을 사용하여 평가하고 NanoDrop 3.7.1 RNA의 부량 소프트웨어 계량했다. 에서 RNA의 수확량은 C24 야생 형 protoplasts 또는 외과 - 정렬 GFP 양성 향상제 트랩 protoplasts가 사용하기 위해 필요한 최소 20 NG를 초과를 미리 정렬 RNA - 라벨 microarray (표 2) assays합니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 향상제 트랩 린 </td><td> GFP 양성 protoplasts의 비율 (%) </td><td> 정렬 GFP의 protoplasts 수 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17.18 % ~ 24.06 % </td><td> 26,400 ~ 36,000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1.43 % </td><td> 1,000 ~ 1,300 </td></tr></tbody></table> 정렬 및 형광 활성 세포 분류기 (FACSVantage, BD)를 통해 원형질 서스펜션 500 μL를 실행하여 수집한 GFP 양성 protoplasts의 수를 전에 두 향상제 트랩 라인에서 GFP 양성 protoplasts 표 1. 비율. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 플랜트 라인 </td><td> RNA 수율 (NG) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71.5 </td></tr></tbody></table> 표 2. protoplasts에서 RNA 격리에서 항복. RNA는 두 향상제 트랩 라인에서 미리 정렬 C24 야생 입력하거나 정렬 GFP 양성 protoplasts에서 분리 계량되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 빌리베르딘 환원 효소 (BVR) 유전자 변형 Arabidopsis thaliana 공장에서 표현의 GAL4 향상제 - 트랩 기반 유도. (A). GAL4 - 응답 GFP 마커 유전자를 포함하는 GAL4 기반 향상제 트랩 라인의 라이브러리에서 선택한 개인은에서 대상 유전자의 표현을 유도하는 GAL4 - 응답 대상 유전자를 포함하는 라인 GAL4 함유 표시 전지와 교차 수 있습니다 GFP 형광에 의해. 박사 짐 Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html)에서 수치를 기반으로. 상위 라인에 phytochrome 발색단, phytochromobilin (PΦB)와 holophytochrome의 (B) 제작. (C) 왼쪽, 빌리베르딘 환원 효소 (BVR) BR 및 PΦR하는 활동에 의해 빌리베르딘 IXα (BV IXα)와 PΦB 감소, 각각. BVR 활동 PΦB의 고갈에 결과 및 광활성이있는 생산의 감소로 연결이 holophytochrome. 맞아요, BVR에 의해 촉매 반응이 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 형광 활성 세포 정렬 (외과) 수집 도트 플롯. 원형질 세포의 비교 C24 야생 유형 (A), J0571 (B) 및 J1071 (C)에 대한 정렬. 488 - nm의 아르곤 레이저에 의해 흥분하고 autofluorescence 임계값을 결정하는 데 사용 이외의 GFP 형광 C24 야생 타입 protoplasts의 (A) 취득 도트 플롯. (B)와 (C) 수집 도트 플롯은 488 - NM 레이저에 의해 여기에 대응 긍정적인 GFP 아르 protoplasts의 비율을 보여줍니다. B와 C 구분 형광 활성화된 세포 분류기 기준으로 정렬 (FACSVantage, BD)와 수집된 GFP 양성 목표에 R3 정렬 게이츠. 레드 채널 V를 나타냅니다protoplasts과 녹색 채널에서 엽록소의 autofluorescence에 대한 alues​​는 GFP 형광 값을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 셀 정렬에 사용되는 식물 protoplasts의 공촛점 현미경. 공촛점 레이저 형광 활성화된 세포 분류기 (외과)를 통해 (G) 정렬하기 전에 (A, C, E) 후 protoplasts의 이미지를 스캔. B, D, F와 H는 DIC 이미지입니다. C24 야생 유형 (A, B), J1071 (C, D)와 J0571 (E, F, G, H)의 Protoplasts가 표시됩니다. 와 488 - nm의 레이저로 여기에서 얻은 Autofluorescence (LP 650 NM) - 이미지 C, E와 G는 GFP 형광 (575 nm의 BP 505 NM)의 이미지를 통합하고 있습니다. H를 통해 A는 63x 오일 이하 4 스캔의 평균입니다. 바 = 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. fluorospectrometry로 protoplasts으로부터 격리 RNA의 양을 정함. RNA는 (A) C24 야생 유형 (B) J0571, 그리고 (C) J1071에서 추출한. 사전 정렬 야생 형 protoplasts에 대한 RNA를 나타냅니다. B와 C는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)를 기준으로 정렬 GFP 양성 protoplasts에서 RNA를 나타냅니다. RNA의 부량 소프트웨어 NanoDrop 3.7.1 (NanoDrop 1000, 써모 사이 언티픽).

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</ol>

microarrays를 통해 유전자 발현 프로 파일링 (1) Arabidopsis 모종의 유전자의 30 % 이상이 가벼운 규제 11아르 것을 지적하고 있으며 (2) phytochrome 신호 폭포 12, 13에 관련된 빛 신호 전달 단백질을 인코딩 유전자의 거대한 그룹을 확인했습니다 . 이러한 실험은 빛이 유전자 발현에 신속하고 장기적인 변화를 유도하는 것이 좋습니다. phytochromes 각 수영장 발달과 적응 반응의 하위 집합만를 제어할 수 있습니다. 또한, 그것은 하류 신호 구성 요소가 세포와 조직을 특정 방식으로 2, 14, 15 phytochromes와 상호 작용 가능성이 높습니다. 하류 후보 유전자의 표현 수 위로 또는 아래로 - 규제 대상 BVR 표현시. UAS - BVR X GAL4 - GFP의 자손과 부모의 라인에서 유전자 발현의 변화의 비교 분석을 통해, 우리는 유전자 발현의 뚜렷한...

<table><tbody><tr><td>Anti-BVR 항체</td><td>QED Bioscience Inc.</td><td>56257-100</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase &amp;#8220;Onozuka&amp;#8221; R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>MSPC 0930</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s B5 기초 염 혼합물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5768</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>PTC 001</td><td></td></tr><tr><td>MES, 저수분 함량</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog 염</td><td>Caisson Laboratories</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>Phytablend</td><td>Caisson Laboratories</td><td>28302</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant Minikit</td><td>Qiagen</td><td>16419</td><td></td></tr></tbody></table>

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 phytochrome 응답 조사 arabidopsis thaliana</em

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

라이트 mediates 식물의 수명주기 전반에 걸쳐 발달 및 적응 과정의 배열입니다. 식물 활용 흡광 photoreceptors은 감각과 불빛에 적응이라는 분자를. 멀리 빨간 / 빨간색 빛을 흡수 phytochrome photoreceptors 것은 광범위하게 연구되고있다. Phytochromes 그들이 연구되고이있는 모든 높은 식물 시스템에서 확실하고 중복 기능을 가진 단백질의 가족으로 존재<sup&gt; 1</sup&gt;. 종자 발아에서 꽃과 노화를 통해 다양한 Phytochrome - 중재 조명 응답은, 종종 특정 식물 조직이나 장기화된 아르<sup&gt; 2</sup&gt;. mutational 분석을 통해 개인 및 이중화 기능 phytochrome의 발견과 해설에도 불구하고, photoperception의 독특한 사이트와 phytochromes의 지역화된 수영장의 분자 메커니즘에 대한 최종 보고서 공간적 특정 phytochrome 응답이 제한됩니다 중재 것을. 우리는 phytochrome photoperception 특정 사이트 조직 및 photomorphogenesis의 오르간 특정 측면, 그리고 지역화된 phytochrome 수영장은 휴대 전화 신​​호의 하류 대상 유전자의 서로 다른 하위 집합을 종사 조절한다는 가설에 따라 실험을 설계했습니다. 우리는 선택 기관 또는 유전자 변형 식물 조직 내에서 특정 방식으로 기능 phytochromes을 줄이기 위해 생화 학적 접근 방식을 개발했습니다. 우리의 연구는 transcriptional 활성제 GAL4하여 업스트림 활성화 순서 (UAS) 요소의 통제하에 유전자의 표현의 transactivati​​on로 이어지는 bipartite 향상제 - 트랩 방식을 기반으로<sup&gt; 3</sup&gt;. 빌리베르딘 환원 효소 (<em&gt; BVR</em&gt; UAS의 통제하에) 유전자가 자동​​으로 UAS - BVR 부모의 GAL4 transactivati​​on의 부재로 유지됩니다<sup&gt; 4</sup&gt;. UAS - BVR 형질 전환 라인 및 특정 표현의 GAL4 - GFP 향상제 트랩 라인 결과 사이의 유전 십자가<em&gt; BVR</em로 표시된 셀에&gt; 유전자<em&gt; GFP</em&gt; 표현<sup&gt; 4</sup&gt;. phytochrome 발색단 결핍증에 Arabidopsis 공장 결과에 BVR 적립<em&gt; planta에</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. 우리가의 전시 GAL4 종속 활성화를 생산한다는 따라서, 유전자 변형 식물<em&gt; BVR</em&gt; phytochrome의 생화학 불활 성화의 결과 유전자뿐만 아니라 GAL4 종속<em&gt; GFP</em&gt; 표현. 의 Photobiological 및 분자 유전 분석<em&gt; BVR</em&gt; 유전자 변형 라인 조직 및 photoperception의 해당 사이트와 관련이있다 오르간 특정 phytochrome - 매개 반응에 대한 통찰력을 매우 저조한<sup&gt; 4, 7, 8, 9, 10</sup&gt;. GFP 양성의 형광 활성 세포 정렬 (외과), 확장기 - 트랩 - 유도<em&gt; BVR</emmicroarray 분석을 통해 세포 유형 특정 유전자 발현 프로 파일링과 함께&gt; - 표현 공장 protoplasts는 공간 특정 phytochrome 반응을 중재에 참여 putative 하류 대상 유전자를 식별하는 데 사용되고 있습니다. 이 연구는 빛을 인식의 사이트에 우리의 이해를 확대하고, 여러 조직이나 장기가 가벼운 규제 식물의 성장 및 개발에 협력하고, 복잡한 phytochrome - 중재의 분자 해부 휴대 전화의 신호 폭포를 증진하는 통해 메커니즘.

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

빛은 식물의 전 생애 주기에 걸쳐 다양한 발달 및 적응 과정을 매개합니다. 식물은 ...라고 불리는 빛 흡수 분자를 활용하여

특정 식물 세포 유형에서의 피토크롬 반응을 조사하기 위해, GAL 4G FP 인핸서 트랩(enhancer trap)과 U-A-S-B-V-R 형질전환 라인을 교배하여 피토크롬 결핍 개체를 생성합니다. U-A-S-B-V-R 교배 GA 4G FP 후손 식물로부터 잎 원형질체를 분리합니다.다음으로, GFP 음성과 GFP 양성 원형질체를 각각 별도의 샘플로 분리하기 위해 FACS로 원형질체를 분류하며, 분리된 원형질체는 공초점 레이저 주사 현미경으로 분석합니다. GFP 양성 원형질체가 제대로 수집되었는지 확인하기 위해 원형질체에서 RNA를 추출하여 분광 분석을 수행합니다. 안녕하세요, 미시간 주립대학교 에너지 식물 연구소 BARDA Montgomery 교수 연구실의 Sanka Pivar입니다.오늘은 형광 활성 세포 분류(FACS) 및 세포 유형 특이적 유전자 발현 분석을 위해 Arabidopsis thaliana의 잎에서 원형질체를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 조직 및 기관 특이적인 파이토크롬 의존적 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 절차에 사용된 Arabidopsis ANA 라인은 이분법적 인핸서 트랩(bipartite enhancer trap) 접근법을 통해 생성되었습니다. 부모 라인 중 하나는 gal 발현 패턴이 서로 다른 인핸서 트랩 라인 라이브러리에서 유래했습니다. 첫 번째 부모 라인은 또한 상위 활성 서열(upstream activation sequence) 또는 UAS의 제어 하에 GFP를 발현합니다.요약하자면, 전사 인자 GAL4는 UAS의 제어를 받는 모든 유전자를 활성화합니다. 부모 1 계통에서는 GAL4가 GFP를 활성화하며, 이 부모 1을 부모 2와 교배시켰습니다. 부모 2에서는 BVR 유전자가 UAS를 통해 GAL4의 제어를 받습니다.교배의 결과로 얻은 계통은 U-A-S-B-V-R 교배 G 4G FP입니다. 부모 계통에서는 파이토크롬 발색단(chromo four)의 생합성이 heme을 거쳐 LA에서 biver(약어 bv)로 진행됩니다. 하지만 후손에서는 BVR 유전자 산물이 BV 전구체를 환원시킴으로써 파이토크롬 발색단의 생성을 차단합니다. 이 enhancer trap BVR 후손 계통은 확인이 완료되었으며, 활성 파이토크롬 수치의 감소가 다양한 식물 조직에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 사용할 수 있습니다.잎 원형질체를 생성하기 위해

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기...

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 2 + 신호.

측정 공간적 칼슘 2 + 신호

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.

머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

우리는 시간의 연장된 기간 동안 형광 라이브 이미징 애기 thaliana 잎을 수행 하기 위한 간단 하 고 다재 다능 한 방법 보고. 우리는 식물 면역 반응의 spatiotemporal 이해에 대 한 예를 들어 면역 관련 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 유전자 변형 애기 식물을 사용 합니다.

Intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

학습하세요 Arabidopsis thaliana에서 형광 활성화 세포 분류를 이용한 세포 유형별 프로토플라스트 분리 및 유전자 발현 분석 방법. 이 기술은 조직 특이적 phytochrome 반응 연구에 활용됩니다.

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