에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana

특정 식물 세포 유형에서의 피토크롬 반응을 조사하기 위해, GAL 4G FP 인핸서 트랩(enhancer trap)과 U-A-S-B-V-R 형질전환 라인을 교배하여 피토크롬 결핍 개체를 생성합니다. U-A-S-B-V-R 교배 GA 4G FP 후손 식물로부터 잎 원형질체를 분리합니다.

다음으로, GFP 음성과 GFP 양성 원형질체를 각각 별도의 샘플로 분리하기 위해 FACS로 원형질체를 분류하며, 분리된 원형질체는 공초점 레이저 주사 현미경으로 분석합니다. GFP 양성 원형질체가 제대로 수집되었는지 확인하기 위해 원형질체에서 RNA를 추출하여 분광 분석을 수행합니다. 안녕하세요, 미시간 주립대학교 에너지 식물 연구소 BARDA Montgomery 교수 연구실의 Sanka Pivar입니다.

오늘은 형광 활성 세포 분류(FACS) 및 세포 유형 특이적 유전자 발현 분석을 위해 Arabidopsis thaliana의 잎에서 원형질체를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 조직 및 기관 특이적인 파이토크롬 의존적 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 절차에 사용된 Arabidopsis ANA 라인은 이분법적 인핸서 트랩(bipartite enhancer trap) 접근법을 통해 생성되었습니다. 부모 라인 중 하나는 gal 발현 패턴이 서로 다른 인핸서 트랩 라인 라이브러리에서 유래했습니다. 첫 번째 부모 라인은 또한 상위 활성 서열(upstream activation sequence) 또는 UAS의 제어 하에 GFP를 발현합니다.

요약하자면, 전사 인자 GAL4는 UAS의 제어를 받는 모든 유전자를 활성화합니다. 부모 1 계통에서는 GAL4가 GFP를 활성화하며, 이 부모 1을 부모 2와 교배시켰습니다. 부모 2에서는 BVR 유전자가 UAS를 통해 GAL4의 제어를 받습니다.

교배의 결과로 얻은 계통은 U-A-S-B-V-R 교배 G 4G FP입니다. 부모 계통에서는 파이토크롬 발색단(chromo four)의 생합성이 heme을 거쳐 LA에서 biver(약어 bv)로 진행됩니다. 하지만 후손에서는 BVR 유전자 산물이 BV 전구체를 환원시킴으로써 파이토크롬 발색단의 생성을 차단합니다. 이 enhancer trap BVR 후손 계통은 확인이 완료되었으며, 활성 파이토크롬 수치의 감소가 다양한 식물 조직에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

잎 원형질체를 생성하기 위해 식물 재배용 토양과 화분을 준비함으로써 이 절차를 시작합니다. 실험당 샘플당 약 2000개의 멸균된 종자를 화분 내 토양에 심습니다. 화분이 담긴 트레이 바닥에 물을 추가하고 트레이 전체를 플라스틱 랩으로 덮습니다.

백색 조명 하에 22 °C, 습도 70% 조건에서 식물을 5주 동안 재배합니다. 처음 5~6일 후, 종자의 발아가 확인되면 트레이에서 플라스틱 랩을 제거합니다. 원형질체를 분리하기 위해 먼저 TEX 버퍼를 준비하며, 버퍼 1L를 만들기 위해 GA's B 5가지 염(MES, 염화 칼슘, 질산 암모늄 및 sucrose)의 무게를 측정하여 넣습니다.

약 900 밀리리터의 탈이온 증류수(DD H2O로 약칭)에 성분들을 완전히 용해합니다. 1 M KOH를 사용하여 pH를 5.7로 맞춥니다. 그 후 최종 부피를 1리터로 맞추고 여과 멸균합니다.

다음으로, 식물에서 건강한 녹색 잎을 채취합니다. 비커에 잎을 느슨하게 채워 약 250 milliliters를 수집합니다. 잎을 40 milliliters로 헹굽니다.

20번 메스로 잎을 자르며 멸균된 DD H2O로 4회 세척한 후, 다시 멸균된 DD H2O로 2회 헹굽니다. 잎을 얇은 조각으로 자르고 조직을 두 개의 50 mL 멸균 플라스틱 튜브에 동일하게 나누어 담습니다. 1x 잎 소화 혼합물(leaves digestion mix)은 45 mL의 신선한 TEX 버퍼에, TEX 버퍼에 2% (w/v) mazy R 10과 4% (w/v) cellulase on azua R 10을 녹여 만든 10x 스톡 용액 5 mL aliquot를 첨가하여 조제합니다.

1x 잎 소화액 약 25 milliliters를 추가합니다. 각 튜브에 담긴 잎 조각들에 섞어 모든 잎 조직이 잠기도록 합니다. 진공 침투 과정을 통해 잎 조직에 소화액을 침투시킵니다.

워터 펌프에 연결된 진공 데시케이터를 사용하여 실온에서 1시간 동안 튜브 캡을 연 상태로 혼합합니다. 빛 노출을 방지하기 위해 잎 조직과 잎 소화 혼합물이 들어 있는 캡 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 보관하십시오. 이어서 로커 위에서 부드럽게 흔들며 실온에서 3시간 동안 배양합니다.

3시간 후, 로커(rocker) 속도를 2분 동안 높여 원형질체를 분리합니다. 거친 원형질체 현탁액을 멸균된 치즈클로스 두 겹으로 여과하여 잔해물을 제거하고, 여과액을 멸균된 유리 비커에 수집합니다. 수집한 여과액을 멸균된 100 $\mu\text{m}$ 나일론 메쉬로 여과하여 멸균된 페트리 접시에 담습니다.

통과액을 수집하여 새로운 멸균 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 약 15 milliliters의 신선한 TEX 버퍼를 사용하여 멸균 페트리 접시를 세척하고 표면에 남아 있는 원형질체를 모두 수집합니다. 가속도는 6, 감속도는 0으로 설정한 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여, 통과액을 10 degrees Celsius에서 100 times gravity로 15분 동안 원심분리합니다.

연동 펌프에 연결된 9인치 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 부유하는 원형질체 층을 방해하지 않고 그 아래에 있는 잔해 및 펠릿 찌꺼기가 포함된 액체 약 25~30 mL를 제거하여 약 10~50 mL가 남도록 합니다. 펠릿 찌꺼기를 제거한 후, 최종 부피가 40 mL가 되도록 신선한 TEX 버퍼를 추가합니다. 원형질체를 부드럽게 재현탁하면서 찌꺼기 제거와 남은 부유 원형질체의 재현탁 과정을 반복합니다.

세포 잔해를 최대한 제거하기 위해 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 원심분리 시간은 첫 번째 반복 시 10분으로, 마지막 반복 시에는 5분으로 단축합니다. 마지막으로, 멸균된 1 mL 전송 피펫을 사용하여 부유하는 프로토플라스트를 흡입한 후 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다.

분리 직후 즉시 소팅을 진행하십시오. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 488 nm 레이저로 들뜨게 함으로써, 프로토플라스트 풀 내의 프로토플라스트 무결성과 GFP 형광 존재 여부를 신속하게 확인하십시오. 소팅 노즐의 막힘을 방지하기 위해 세포 잔해를 최소화해야 하며, 분리된 프로토플라스트를 TEX 버퍼 내에서 FACS로 소팅하십시오.

적응된 프로토콜에 따라, 시스템 압력을 약 9 PSI로 유지하고 이벤트 속도를 6,000에서 15,000 사이로 설정한 매크로 소트 헤드의 200 µm 노즐을 사용합니다. 488 nm 아르곤 라인에서 100 mW로 작동하는 아르곤 레이저를 이용하여, 야생형 비 GFP 원형질체를 사용하여 GFP 양성 원형질체 소트 세포를 수집하기 위한 자가형광 임계값을 결정합니다. GFP 양성 원형질체를 수집한 후, 530/30 밴드 패스 필터를 사용하여 GFP 형광을 확인합니다. 발현 프로파일링을 위해, 소트 전과 마찬가지로 소트된 원형질체를 현미경으로 검사합니다.

분리된 프로토플라스트로부터 총 RNA를 추출합니다. 이후 하이브리드화를 위한 cDNA를 준비할 수 있습니다. 준비된 cDNA는 TH one OPSYS Ametri 전유전체 어레이 하이브리드화를 위해 제출됩니다.

야생형 대조군 원형질체의 분리 결과의 대표적인 예시입니다. GFP 양성 게이트 내에서 원형질체 신호가 전혀 나타나지 않습니다. 반면, GAL 4G FP 라인에서 분리한 원형질체 샘플에서는 GFP 양성 신호가 확인됩니다. 분리 전 야생형 식물에서 분리한 원형질체는 CLSM 분석에서 GFP 형광이 전혀 나타나지 않습니다.

GAL 4G FP 라인 유래 원형질체 샘플에서 GFP 형광이 나타나지 않는 원형질체와 나타나는 원형질체가 혼합되어 검출되었습니다. CLSM 분석 결과, 대표적인 gal 4G FP 라인으로부터 GFP 양성 원형질체가 분리되었음을 확인하였습니다. 분리된 원형질체로부터 RNA를 추출할 수 있으며, 1 mL당 형광 광도계로 검출 가능한 충분한 양의 RNA가 얻어집니다. 지금까지 형광 활성화 세포 분류 및 세포 유형 특이적 유전자 발현 분석을 위해 atopy ANA에서 잎 원형질체를 분리하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 원형질체를 조심스럽게 다루고 빛 노출을 제한하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마쳤습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.