개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

이 비디오에서는 광수용체 세포에 초점을 맞춰 라이브 이미징 및 면역조직화학을 위해 뇌와 망막의 oph를 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 우선, 뇌 박리를 준비하는 방법을 소개해 드리겠습니다. 그런 다음 성인의 뇌, 성인의 망막, 발달 중인 눈의 세 가지 다른 해부를 시연할 것입니다.

이들 각각에 대해 조직은 면역조직화학 또는 이미징된 생명을 위해 고정될 수 있습니다. 마지막으로, 생명 조직을 이미지화하는 방법을 설명하고 공명 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용한 라이브 이미징의 몇 가지 예를 보여드리겠습니다. 자, 이제 시작하겠습니다.

맙소사, 단면을 위해서는 날카로운 집게가 필요합니다. 숫돌 블록이나 아주 고운 사포를 사용하여 끝이 만날 때까지 집게를 양쪽에서 앞뒤로 부드럽게 통과시킵니다. 미세한 점에서는 표준 숫돌을 사용합니다.

여기서 샤프닝 기술에 대해서는 다루지 않겠지만 날카로운 집게는 생체 해부에 필수적이라고 말씀드리겠습니다. 우리는 성인 뇌 박리를 위해 매일 겸자를 날카롭게 합니다. 파리를 CO2 패드에 올려 마취시키고 원하는 유전자형을 분류합니다.

동공 해부의 경우 바이알에 손을 뻗어 집게로 동공을 조심스럽게 제거하고 동공 케이스가 파손되지 않도록 주의하십시오. 김 물티슈를 뭉쳐 물에 적십니다. 해부하는 동안 이것을 사용하여 집게에서 이물질을 제거합니다.

입체경의 무대에 해부 접시를 놓고 HL 3 용액으로 채웁니다. 모든 해부는 해부 절차 동안 조직이 살아 있고 건강하게 유지되도록 HL 3으로 수행됩니다. 또한 해부 중 집게를 보호하기 위해 Syl guard의 바닥 덮개가 있는 해부 접시를 사용하는 것을 좋아합니다.

이제 고정 솔루션을 준비하십시오. 면역조직화학을 수행할 계획인 경우. 180마이크로리터의 HL 3을 500마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

3.7% 포름알데히드 용액을 얻기 위해 37%포름알데히드 20마이크로리터를 첨가합니다. 마지막으로, 올바른 손 위치로 좋은 해부를 위해서는 적절한 손 위치가 중요합니다. 집게는 안정적이며 미묘한 움직임을 제어할 수 있습니다.

먼저 엄지 손가락 측면에 집게를 놓고 검지 끝을 위로 오도록 집게 손가락을 똑바로 아래로 가져옵니다. 이제 집게의 측면을 가운데 손가락 쪽에 놓고 해부 접시로 이동합니다. 엄지와 중지를 접시에 올려놓고 엄지와 중지로 접시를 물리적으로 접촉합니다.

현미경 스테이지에 손목을 놓습니다. 이쪽. 해부하는 동안 표면에 세 개의 점이 단단히 고정되었으며 이제 집게를 매우 미묘하게 조작할 수 있습니다.

CO2 패드에서. 머리를 손에서 멀어지게 하고 성인 플라이 복부 쪽을 위로 향하게 합니다. 머리 바로 아래의 흉부를 잡습니다.

제대로 수행하면 입체경 아래에서 보는 동안 다리와 프로버스가 확장되고 집게로 확장된 주둥이를 잡고 머리를 제거하고 시체를 버리고 머리를 담그십시오. 물에 잠긴 머리에 다시 초점을 맞춥니다. 전체 해부는 용액에서 수행됩니다.

항상 집게로 머리를 잡는 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 머리가 떠 있습니다. 그리고 떠 있는 머리는 항상 회수하기 어렵다는 것을 기억하십시오.

해부 중에 머리가 초점 밖으로 이동하면 현미경을 조정하지 않고 초점면으로 다시 이동하기만 하면 됩니다. 이 간단해 보이는 작업은 처음에는 어려울 수 있지만 시간이 지남에 따라 머리에 집중하는 것이 더 쉬워질 것입니다. 먼저 프로버스와 눈 사이의 결합 조직을 찢는 것으로 해부를 시작합니다.

항상 하나 이상의 집게로 단단히 잡고 눈을 찢습니다. 겸자의 발가락이 망막이나 표피 바로 아래에만 있는지 확인하십시오. 아래의 뇌가 손상되지 않도록 왼쪽과 오른쪽을 번갈아 가며 사용하십시오.

집게를 사용하여 머리 뒤쪽으로 향하는 망막을 뜯어냅니다. 망막을 찢어내면 얇은 판이 시신경에 붙어 있을 가능성이 높아집니다. 이 박리 내내 머리 뒤쪽을 계속 돌면서 큐티클을 찢고 다른 쪽 눈을 찢어 큐티클을 빼내기 시작합니다.

큐티클을 잡고 있는 한, 뇌를 망가뜨리고 있지 않다는 것을 알 수 있습니다. 이를 염두에 두고 뇌가 드러날 때까지 큐티클과 망막을 계속 당겨냅니다. 뇌가 보이게 되면 뇌에 부착된 기관을 제거하고 뇌가 분리될 때까지 기관과 큐티클을 계속 당기기 시작할 수 있습니다.

이 시점에서, 광수용체 말단의 이미징을 위한 나머지 단계를 위해 접시 바닥에 다시 초점을 맞춰야 합니다. 얇은 판을 유지하는 것이 바람직하지만 세포체와 강한자가 형광 색소를 포함하는 망막을 제거해야합니다. 이렇게하려면 얇은 판을 손상시키지 않고 덤불 같은 세포체 잔해를 조심스럽게 잡아 당깁니다.

이것은 더 미세한 기술이며 연습이 필요합니다. 남아있는 기관을 제거하라 그렇지 않으면 하룻밤 동안의 항체 세척 중에 뇌가 떠다닐 수 있기 때문에, 성인의 뇌는 7절에서 논의할 조건을 사용하여 몇 시간 또는 심지어 밤새도록 살아 있을 수 있다. 면역조직화학의 경우, 성인의 뇌는 이제 포름알데히드를 고정할 준비가 되었습니다.

5마이크로리터로 설정된 P 20 피펫을 사용하여 성인의 뇌를 이미 준비한 고정 용액으로 이동합니다. 20분 동안 성인의 뇌를 계속 해부하면 4개에서 10개의 뇌가 얻어진다. 뇌를 그대로 두고 40분 더 고정합니다.

그러나 이 기간은 다를 수 있습니다. 최적의 1차 항체 염색을 위해 포름알데히드 용액을 제거하고 뇌를 각각 5분씩 3회 세척하고 PBS와 0.4% TRITTON X 100(이하 PBS Triton)이라고 하는 0.4% TRITTON X 100이 포함된 용액 400마이크로리터를 세척합니다. 고정된 용액을 완전히 세척한 후 1차 항체 용액을 추가할 수 있습니다.

성인의 뇌에 대해 설명된 대로 이 해부를 시작합니다 머리를 담그고 현미경의 초점을 다시 맞춘 후, 프로버스와 프로버스 위의 눈 사이의 결합 조직을 찢는 것으로 시작합니다. 큐티클과 눈을 분리합니다. 이제 하나의 집게로 눈 아래쪽에서 큐티클을 분리하여 머리 뒤쪽으로 이동합니다.

이 해부를 위해 머리 뒤쪽의 중앙을 잡습니다. 다른 겸자로 뇌를 부숴도 괜찮다. 시선을 잡고 떼어내세요.

눈이 접시 바닥에 머물도록 합니다. 얇은 판은 아마도 여전히 눈에 부착되어 있을 것이며 완전히 손상되지 않은 광수용체 세포의 광수용체 말단의 실시간 이미징에 사용할 수 있습니다. 다음 세 섹션에서는 면역조직화학을 위해 눈을 준비하는 방법을 설명합니다.

면역조직화학을 위해 눈을 고정 용액으로 이동합니다. P 20 파이프를 사용하여 Petman을 5마이크로리터로 설정하고 총 10분 동안 성인의 눈을 계속 해부합니다. 눈을 그대로 두고 30분 더 고정합니다.

고정된 용액을 제거하고 성인 뇌 해부에 설명된 대로 세척을 수행합니다. 궁극적으로 눈의 물질 구조를 이미지화하려면 제거해야 합니다. 이제 고정된 눈을 해부 접시로 되돌리고 아직 붙어 있을 수 있는 기관이나 지방 세포를 제거합니다.

그런 다음 한쪽 집게로 눈 바깥쪽을 잡고 다른 집게로 얇은 판을 제거합니다. 그것은 한 조각으로 벗겨져 아래에 있는 세포체를 노출시켜야 합니다. 얇은 판만 잡도록 주의하십시오 그렇지 않으면 망막에서 세포체가 분리될 위험이 있습니다.

P 20 파이프 Eman을 사용하여 500 마이크로 리터 튜브에 담긴 400 마이크로 리터의 PBS Triton으로 눈을 옮깁니다. 하룻밤 동안 4도에서 부드럽게 흔들어 다음 날 광수용체에서 자가형광 적색 색소를 제거합니다. 세척 용액을 버리고 얇은 판이 없는 성인 눈의 실시간 이미징을 위해 1차 아무나 추가할 수 있습니다.

우리는 elo 직전에 후기 단계 puy인 흰족제비 성충 파리만 사용합니다. 이 단계에서, 광수용체 세포체는 해부 페레이트 동안 얇은 판의 말단에서 분리됩니다. 다 자란 puy는 날개, 눈, 표피가 뚜렷

번데기를 선택하고 HL 3에 담그십시오. 동공 케이스의 앞쪽 부분을 제거하여 머리 부분을 노출시킵니다. 발달하는 파리를 추가로 둘러싸고 있는 얇은 내막을 조심스럽게 제거합니다.

집게로 머리 밑부분을 잡고 당깁니다. 머리를 물에 담근 상태에서 나머지 번데기는 버립니다. fer rate 성인 단계에서 면역조직화학을 위한 안구 해부에 설명된 대로 진행합니다.

그러나 광수용체 세포체는 얇은 판에서 더 쉽게 분리되어 망막에 자리 잡은 세포체를 이미지화할 수 있습니다. 또한 얇은 판은 시신경엽에 부착된 상태로 유지되어 원위 얇은 판을 이미지화할 수 있습니다. 광수용체 말단 카트리지가 보이는 근위층을 영상화하려면 층판이 눈에 더 강하게 부착된 성체 파리에서 안구 해부를 수행합니다.

20%의 동공 발달 단계에서 발달하는 눈 디스크는 우리 실험실에서 라이브 이미징에 가장 좋아하는 것이 되었습니다. 상대적으로 큰 발달 중인 세포의 이 단일 층은 컨포칼 현미경을 사용하여 쉽게 관찰할 수 있기 때문입니다. 20%의 번데기를 선택하려면 동공 아래에 나타나는 녹색 반점인 이안 세뇨관을 찾고 20%의 동공 발달 후에 형성되는 어두운 몸을 가진 번데기를 피하십시오.

번데기를 선택한 후 해부 접시에 HL 3에 담그고 동공 자루의 앞부분을 조심스럽게 제거합니다. 얇은 내막을 관통하지 않도록 주의합니다. 집게로 내막을 잡고 당겨 빼냅니다.

공개된 내용을 꼼꼼히 훑어보면 상당히 두드러진 발달 중인 뇌와 안구 디스크를 찾을 수 있습니다. 해부 접시의 바닥에서 뇌를 분리하십시오. 중추 뇌와 시신경을 조심스럽게 분리하십시오.

시신경엽 I 디스크 복합체는 라이브 이미징에 사용됩니다. 짧은 기간 동안 하나 또는 두 개의 용액으로 이미지를 생성하려는 경우 유리 슬라이드에 조직을 이미지화할 수 있습니다. 이 경우 제조업체의 지침에 따라 먼저 실을 가드로 표면을 코팅하여 슬라이드를 준비하십시오.

20마이크로리터 HL 3을 놓습니다. 슬라이드 중간에서 절개된 조직을 20마이크로리터의 HL 3에 추가로 담아 슬라이드로 운반합니다. 조직은 절대 공기에 노출되어서는 안 됩니다.

또한 피펫 취급으로 인한 스트레스나 변형을 피해야 합니다. 라이브 이미징의 경우 조직이 단단히 고정되어야 합니다. 전기 생리학적 기록을 위해 당기는 것과 같은 유리 전극을 구하십시오.

팁을 부수고 입에서 발생하는 음의 기압을 사용하여 끝을 접착제 스티치로 채우고 접착제가 들어갈 수 있을 만큼만 전극을 끊습니다. 이제 양압을 사용하여 HL 3 방울 아래에서 창틀 가드에 소량의 접착제를 바르십시오. 이제 글루에 조직을 빠르게 설정하여 라이브 이미징을 위해 원하는 방향을 유지합니다.

이제 침수 렌즈를 이미징에 사용할 수 있습니다. 멤브레인 투과성 염료를 첨가하고 싶다면 욕조에 첨가 할 수 있습니다. 장기간에 걸친 이미징을 위한 이미징 또는 용액을 완전히 또는 여러 번 교환하는 경우, 당사는 살아있는 조직에서 배양 용액을 천천히 정독하는 연동 펌프에 연결되는 관류 챔버를 사용합니다.

얇고 평평하게 만들기 위해 면도한 실 가드 한 방울로 코팅된 커버 슬립을 사용하십시오. 20마이크로리터 HL 3을 커버 중앙에 분배합니다. 살아있는 조직을 씰 가드에 밀어 붙입니다.

생성: 살아있는 조직을 공기에 노출시키지 않고 기포가 챔버를 통과할 수 있도록 하는 개스킷. 개스킷은 조직이 부서지지 않을 만큼 충분히 두꺼워야 하지만 조직을 컨포칼 현미경 렌즈에 가깝게 만들 수 있을 만큼 얇아야 합니다. 풍력 챔버를 조립하고 조직이 항상 완전히 잠기지 않도록 주의하십시오.

따라서 용액 교환은 분당 최대 100마이크로리터의 속도로 수행될 수 있습니다. 시간 단위의 이미징을 위해 20개의 하이드록시 다이슨과 항생제를 추가해야 할 수 있지만 항진균제는 추가하지 않고 분당 약 10마이크로리터의 훨씬 느린 속도로 풍부하게 수행해야 합니다. 또한 연동 펌프에 산소를 공급하는 배양 배지에 산소를 버블링합니다.

이제 초파리의 뇌와 망막을 성공적으로 해부하는 데 필요한 모든 기술을 갖추게 되었습니다. 또한 발달 중인 안구 디스크 또는 성인 광수용체를 실시간으로 이미지화할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.