Name: 개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: 배우세요 Drosophila 성체 뇌와 망막의 실시간 영상 및 면역조직화학을 위한 분리 기법을. 공명 스캐닝 공초점 현미경을 활용한 광수용체 세포 연구 방법을 익혀보세요.

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이 작품은 웰치 재단 (I - 1657)와 NIH (RO1EY18884)에서 보조금에 의해 지원되었다. PRH는 바이오 메디컬 연구에 유진 맥더멋 학자이다.

1. 소개 이 비디오에서는, 우리는 photoreceptor 세포에 초점을 라이브 영상과 immunohistochemistry를위한 Drosophila의 두뇌와 retinae를 준비하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 첫째, 뇌 해부를 위해 준비하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 살아있는 준비의 기초를 형성 일반적으로 immunohistochemistry에 사용되는 두 가지 기본적인 해부를 보여줄 것입니다. 이 두 준비는 성인 두뇌와 눈 해부하고 있습니다. 다음, 우리는 photoreceptors 라이브 영상 그들의 사용에 중점으로 성인과 개발 두뇌의 라이브 이미징에 사용되는 해부를 보여줄 것입니다. 마지막으로, 우리는 우리가 어떻게 이미지 사는 조직을 설명하고 공진 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 영상의 몇 가지 예입를 표시합니다. 2. 해부 준비 <ol><li> 좋은 해부 들어, 날카로운 집게가 필요합니다. 엔드 좋은 지점에서 만날 때까지 선명하게 차단하거나 매우 미세한 모래 종이 (&gt; 1500)를 사용하여, 부드럽게 양쪽에 앞뒤로 포셉을 전달합니다. 우리는 표준 선명하게 돌을 사용합니다. 우리는 여기에 선명하게 기술을 커버지만, 날카로운 집게가 사는 해부에 필수적인 유의하지 않습니다. 우리는 모든 해부하기 전에 포셉를 선명하게. </li><li> 성인 뇌 해부에 대한, 그들을 마취하고 원하는 유전자형을 정렬하는 CO 2 패드에 파리를 놓으십시오. pupal 해부 들어, 단순히 유리병에 도달하고 신중하게 pupal 사건을 깨는 않도록주의하고, 당신의 집게와 번데기를 제거합니다. </li><li> 물로 Kimwipe을 축축하게하다. 당신은 포셉에서 파편을 제거하기 위해 절개하는 동안 이것을 사용합니다. 입체경의 무대에서 해부 접시를 위치하고 HL3 솔루션 1을 입력합니다. 모든 해부는 조직의 해부 과정 중에 살아있는 건강한 상태를 유지하기 위해 HL3에서 실시됩니다. 또한, 우리는 해부 동안 포셉을 보호하기 위해 Sylgard의 하단 덮개를 가진 해부 접시를 사용합니다. </li><li> 이제, 당신이 immunohistochemistry을 수행하려는 경우 정착액 준비합니다. 500μL microcentrifuge 관에 HL3의 플레이스 180μL. 3.7 %의 포름 알데히드 용액을 얻기 위해 37 % 포름 알데히드의 20μL를 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 적절한 손의 위치는 좋은 해부 중요합니다. 좋은 손 위치와 함께, 당신의 집게는 안정 제어, 섬세한 움직임이 가능합니다. 첫째, 네 손가락의 측면에 포셉 놓으십시오. 그런 다음 바로 아래 손가락의 끝 위에 달려 이러한 색인 손가락을 가져다. 이제 가운데 손가락의 측면에 포셉의 측면을 휴식과 해부 요리로 이동합니다. 당신의 엄지와 가운데 손가락으로 음식과 신체 접촉을합니다. 접시에 엄지와 가운데 손가락을 쉬고 있지만, 현미경 스테이지에 손목을 공장. 이렇게하면 세 점은 해부 동안 단단히 표면에 심어져하고 포셉 매우 미묘한 조작을하기 위해 현재 가능합니다. 이 기술은 처음에는 조금 어색하게 느낄 수 있지만, 연습, 당신은 곧 뇌 해부의 주인이되는 것입니다. </li></ol> 3. 성인 뇌 <ol><li> CO 2 패드에서 동양 성인 떨어진 손에서 머리 복부 쪽을 날아. 바로 머리 아래의 흉부를 잡아. 정상적으로 완료하면, 다리와 코이 연장됩니다. 입체경 아래에서 보는 동안 머리를 제거하려면 집게로 확장 코를 잡아. 신체 및 잠수함 머리를 삭제. 서브 머 지드 머리에 집중할. 전체 해부는 솔루션에 따라 수행됩니다. 그것은 항상 집게로 머리를 지키고 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 머리가 부동하고 검색하기가 어렵습니다 것입니다. 머리가 절개 도중 초점 밖으로 이동하는 경우, 단순히 현미경을 조정하지 않고 초점 비행기로 다시 이동합니다. 이것은 겉보기에 간단한 작업은 처음에는 어려울 수 있지만, 초점에 머리를 유지하는 것은 시간이 지남에 따라 쉽게 될 것입니다. </li><li> 먼저 코와 눈 사이의 결합 조직을 찢어하여 절개를 시작합니다. 항상 적어도 하나의 집게로 단단히 누른 상태에서 눈에 눈물. 두뇌 아래의 손상을 방지하기 위해, 포셉의 발끝이 망막 또는 표피 아래에 그냥 ...임을 확신한다. 왼쪽 및 오른쪽 번갈아, 머리 뒤쪽 방향으로 노력하고, 망막을 떠날 귀하의 집게를 사용합니다. 망막 멀리 찢어하면 라미나이 절개를 통해 광 엽에 부착된 남아있는 가능성이 훨씬 높아지게됩니다. 길을 따라 표피를 찢어, 머리 뒤로 계속합니다. 다른 눈에 눈물과 멀리 표피를 당기 시작합니다. 오래 당신은 표피를 잡을 있으므로, 당신이 아는 당신은 머리를 분쇄하지 않습니다! 마음이로 두뇌가 드러났습 때까지 거리 표피와 망막을 당겨 계속. </li><li> 두뇌가 표시되면, 당신은기도의 두뇌 (그림 1A)에 첨부된 제거하실 수 있습니다. 두뇌가 격리 때까지기도하고 표피에 끌어 계속. 이 시점에서, 당신은 t을 위해 접시의 바닥에 집중할해야그는 단계 남아 있습니다. 머리가 달리 야간 항체 세척하는 동안 부동 수 있기 때문에 남아있는 기관을 제거합니다. photoreceptor 단말기의 영상을 위해, 그것은 얇은 판을 유지하는 것이 바람직하다,하지만 당신은 세포 기관 및 강력 autofluorescent 안료를 포함하는 망막을 삭제해야합니다. 이렇게하려면 신중하게 라미나을 손상없이 부쉬와 색소 세포의 유지에 당기십시오. 이것은 미세한 기술이며 연습이 필요. </li><li> 성인 두뇌는 우리가 섹션 6에서 설명합니다 조건을 사용하여 몇 시간 또는 며칠 동안 생명을 유지하실 수 있습니다. immunohistochemistry 들어, 성인 두뇌는 포름 알데히드에 이제 해결 될 준비가 된 것입니다. 2가 이미 준비했던 고정 솔루션에 어른 두뇌를 이동 5μL로 설정 P20 pipetteman을 사용합니다. 40-10 두뇌를 양보해야하는 20 분 동안 어른 머리를 해부 계속합니다. 추가 40 분 수정에 두뇌를 떠나, 그러나이 기간은 최적의 일차 항체 염색법에 따라 다를 수 있습니다. 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 이하 - 트라 이튼이라고 PBS와 0.4 % TritonX - 100을 포함하는 솔루션의 400μL 5 분 각 두뇌에게 3 회 씻는다. 완전히 해결책을 세척 후 일차 항체 솔루션을 추가할 수 있습니다. </li></ol> 4. 성인 눈 <ol><li> 성인 두뇌에 대한 설명으로 절개를 시작합니다. 머리를 잠수함이 잠수과 현미경주의를 환기 시켰을 뿐일세 후 코와 눈 사이의 결합 조직을 찢어하여 시작합니다. 코 위, 눈에서 표피를 구분한다. 자, 머리 뒤쪽 방향으로 노력하고, 눈 아래쪽에서 표피를 구분한다. 한 집게로 머리 뒤쪽의 중심을 잡아 야지. 다른과 함께 시선을 잡고 당기십시오. 눈이 (그림의 1B) 접시의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 라미나 아마 아직도 눈에 첨부되며,이 시간에 완벽하게 그대로 photoreceptor 세포의 터미널의 라이브 영상에 사용될 수 있습니다. photoreceptor 세포 기관의 라이브 영상을 계속하려면 섹션 4.5로 이동합니다. 다음 세 부분은 고정 눈 immunohistochemistry를 설명합니다. </li><li> immunohistochemistry 들어, 5μL로 설정 P20 pipetteman를 사용하여 솔루션을 해결하기 위해 눈에 이동합니다. 10 분 총 성인 눈 해부 계속합니다. 추가 30 분 수정에 눈을를 남겨주세요. 으로 성인 뇌 해부에 설명되어있는 해결책 및 실시 세척을 제거합니다. </li><li> 당신이 궁극적으로 이미지를 눈 ommatidial 구조를 원할 경우 라미나 지금 제거해야합니다. 귀하의 해부 접시에 고정 눈을 반환하고 그대로있을 수있는 기관이나 지방 세포를 제거합니다. 다음 한 포셉과 눈의 바깥쪽을 잡고 있지만, 다른과 라미나를 제거합니다. 그것은 (그림의 1B) 아래 cellbodies를 노출 한 조각으로 잘라야한다. 단지 얇은 판을 움켜주의! 그렇지 않으면, 당신은 망막에서 photoreceptors을 분리 위험. </li><li> P20의 pipetteman 사용 500uL 튜브 400uL PBS - 트리톤으로 눈을 이동합니다. 부드럽게 photoreceptors에서 autofluorescent 붉은 색소를 제거하는 야간 4 정도에 그들을 바위. 그 다음날, 당신은 씻어 솔루션을 버리고 기본 항체 솔루션을 추가할 수 있습니다. </li><li> 성인 눈 라이브 영상을 위해 우리는 pharate 성인 파리를 사용하여 바로 eclosion 전에 늦은 무대 pupae 즉. 이 단계에서는 해부 동안 라미나의 터미널에서 별도의 photoreceptor 세포 기관. </li><li> Pharate 성인 pupae는 잘 정의된 날개, 눈, 그리고 pupal 사건을 통해 보이는 표피 있습니다. 번데기를 선택하고 머리 영역을 노출 pupal 사건의 앞쪽에 부분을 제거합니다. 조심스럽게 추가 개발 파리를 encloses 얇은 막 내부를 제거합니다. 당신의 집게와 끌어와 머리 받침대를 잡아. 머리가 가라 앉 유지하면서 번데기의 나머지 부분을 삭제. </li><li> 로 immunohistochemistry에 대한 눈 해부에 시연 진행합니다. pharate 성인 단계에서는 그러나, photoreceptor 세포 기관은 이미지 망막에 자리잡고 세포 기관을 수 있도록, 얇은 판에서보다 쉽게​​ 분리됩니다. 또한, 얇은 판은 이미지 말초 라미나을 수 있도록 광 엽에 붙어 남아 있습니다. 이 이미지에 photoreceptor 터미널 카트리지 볼 수있는 근위 라미나을 원하시면, 다음 라미나가 더 강력하게 눈에에 첨부되어 성인 즉시 안과 절개를 수행합니다. </li></ol> 5. 눈 디스크 두뇌 단지를 개발 <ol><li> 비교적 큰 발전 세포의 단일 층이 쉽게 공촛점 현미경을 사용하여 관찰할 수 있기 때문에 20% pupal 개발 (P 20%)에서 개발 눈 디스크 우리가 실험실에서 살고 이미지에 대한 선호되고있다 3. </li><li> 20 % 번데기를 선택하려면, malpighian tubules,이 pupal 경우 아래 나타나는 녹색 지점을보고, &quot;어둠의 몸&quot;4를 갖고 pupae을 피하십시오. 귀하의 해부 접시에 HL3에서 P 20% 번데기, 잠수함을 선택한 후 조심스럽게 신중, pupal 자루의 앞쪽에 부분을 제거얇은 막 내부에 침투하지 않습니다. 당신의 집게와 내부 멤브레인을 파악하고 분열 시키려고. </li><li> 조심스럽게 (그림 1C) 꽤 유명한있는 개발 두뇌와 눈 디스크를 찾을 수있는 발표 내용을 통해 검색할 수 있습니다. 눈 디스크 두뇌 복잡한 쉽게 변태의이 단계에서 구분합니다. 해부 접시의 바닥에 머리를 분리. 조심스럽게 광학 엽의 중앙 두뇌를 구분한다. 광학 엽 / 눈 디스크는 라이브 이미징에 사용됩니다. </li></ol> 6. 이미징 라이브 : 현미경에서 <ol><li> 당신은 단 하나 또는 두 개의 솔루션의 짧은 기간에 대한 이미지를 원한다면, 당신은 유리 슬라이드에 이미지 귀하의 조직을 수 있습니다. 이 경우에는 먼저 코팅 제조 업체의 지침을 사용하여 Sylgard로 표면하여 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드 중간에 20μL HL3를 배치합니다. 슬라이드 HL3 20 추가 μL에서 해부하는 조직을 전송. 조직은 공기에 노출 절대해야합니다. 또한, 피펫 처리 또는 솔루션 표면 장력로부터 응력이나 변형을 피할 수 있어야합니다. </li><li> 라이브 이미징 들어, 조직은 확고 최소한의 핸들링과 연락처와 보안해야합니다. 우리는 안전 microelectrode를 통해 적용된 물 polymerizing 수술 아교 GluShield를 사용하여 두뇌 위치, 기술은 정기적으로 전기 생리학 5 배아 준비를 위해 사용됩니다. electrophysiological 레코딩을위한 뽑아 그 같은 유리 전극을 구합니다. 팁을 중지하고 GluShield이 입에 의해 생성된 부정적인 공기 압력을 이용하여 끝을 입력합니다. 단 정도 접착제가 입력할 수있는 전극의 중지. 지금 HL3의 드롭 아래 Sylgard에 접착제의 작은 금액을 적용하기 위해 긍정적인 압력을 사용합니다. 자, 빨리 라이브 영상에 원하는 방향을 유지, 접착제의 조직을 설정합니다. 물 침지 렌즈는 이제 이미지에 사용될 수 있습니다. 당신은 막 투과의 염료를 추가하려는 경우, 당신은 영상하면서 목욕탕에 추가할 수 있습니다. </li><li> 우리는 시간 또는 교환 솔루션을 오랜 기간 동안 이미지에 대한 photobleaching 감소 6. 완전히 또는 여러 번, 우리가 연동 펌프에 연결 재관류 챔버 (하버드 IC30 공촛점 영상 챔버)를 사용할 빠르게 이미지를 허용 공진 스캐닝 공촛점 현미경을 사용하여 그렇게 천천히 (그림 2A) 살아있는 조직을 통해 문화 솔루션을 perfuses. 지속적인 액체 교류와 최소한의 GluShield 문의 운동 시간이 7 이상 기간 동안 관찰되어 조직의 평평화을 줄일 수 있습니다. 발달 시간대의 영상을 위해, 눈을 디스크 두뇌 복잡한 그대로 유지하고 접착제로 최소한의 접촉을해야 필요합니다. </li><li> 그것이 얇고 평평 렌더링을 면도있다 Sylgard 한 방울로 코팅된 표지 전표를 사용하십시오. coverslip 및 접착제 Sylgard로 살아있는 조직의 중심에 20μL HL3 하는걸. 거품이 공기 (그림 2B)로 살아있는 조직을 노출하지 않고 챔버 통과 수있는 개스를 생성합니다. 가스켓은 조직 있지만 공촛점 현미경 렌즈에 가까운 조직을 제공할 정도로 얇은을 깔아 뭉 갠다고 피할 정도로 두께가 있어야합니다, 우리 설정에서 250μm 사용합니다. 완전히 항상 변할 조직을 유지하기 위해주의되는, 재관류 챔버를 조립. 연동 펌프를 사용하여 분당 요금 가까이 100μL 속도로 초기 재관류를 시작합니다. 이 속도는 상당히 빠른 챔버의 높이를 정의하는 근육의 두께에 따라 수 있습니다. 시간의 규모 이미징 들어, 20 hydroxyecdysone 및 항생하지만, antifungal하지를 추가하고, 분당 10μl 주변 훨씬 낮은 속도에서 재관류를 수행 할 수 있습니다. 재관류 챔버를 제공 문화 매체에 마지막으로, 우리는 거품 산소. </li></ol> 7. 대표 결과 : 우리의 비디오 프로토콜의 끝에 우리는 제 5에 표시되는 준비를 사용하여 개발 photoreceptor 세포에 살고 이미징에 대한 예를 보여줍니다. 이 준비는 세포 특별히 형광 기자를 표현하는 Drosophila transgenesis을 활용합니다. 멤브레인 - 태그 myrRFP 및 endosomal 마커 2xFYVE - GFP 9 표시된 예제에서는 두 개의 형광 기자는 photoreceptor 특정 GMR - Gal4 드라이버 8 통제하에 표현됩니다. 70x70x17.5μm의 경계 상자 137x137x700nm (512x512x26)의 voxel 크기가 2 채널 3 차원 데이터 세트는 매 1 분을 획득했다. 영화는 세포내 endosomal 인신 매매와 소포의 융합 이벤트의 역학 관계를 보여이 4D의 세트에서 시간이 지남에 따라 선택한 비행기를 보여줍니다. 눈과 얇은 판의 고정 조직 준비를위한 대표 이미지는 그림에 표시됩니다. 3.

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</ol>

이미징에 사용 형광 프로브 여기 세 가지 클래스에서 형광 프로브의 선택에 대한 Drosophila 영상 시스템 준비의 강점과 한계를 설명합니다 : exogenously 살아있는 조직을 준비에 추가됩니다 (1) 프로브, 유전자 살고 모두 인코딩됩니다 (2) 형광 단백질 고정 이미지, immunohistochemistry에 대한 고정 조직에 추가됩니다 (3) 형광 염료. 1. 외인성 프로브 : Lysotracker 그린 DND - 26 또는 DND - 99 레드 (Invitrogen, 주식 회사) 이들은 형광 막 - 투과 가장 눈에 띄게 세포, lysosomes에 강력히 산성 구획에 축적 화합물, 후반 endosomes, 그리고 autophagosomes 상용 사용할 수 있습니다. nanomolar 농도 (우리가 일반적으로 50 nm의 사용)에서 Lysotracker 완전​​히 미만 분 L3와 P 20% 아이 디스크를 투과해 들어갔던 것이다. Lysotracker은 지속적으로 축적하고 5 분 미만의 alkalizing 효과, 우리는 이미지를 미치는 때문에. 눈에 디스크와는 달리, Lysotracker은 조직의 파괴없이 머리를 침투하지 않습니다. 그러나, 외부 멤브레인의 찢어주의는 광 엽 몇 세포 직경의​​ 침투 수 있습니다. Lysosensor DND - 189 Lysotracker 대조적으로 (Invitrogen 주식 회사)가 Lysosensor은 산성의 구획에 축적되지 않지만, 전시 산성 산도에 형광 증가했다. Lysosensor는 Lysotracker 매우 유사 침투 특성이 있습니다. 우리는 1μM의 농도에 Lysosensor을 사용합니다. 2. 유전자 인코딩 프로브 : 많은 라이브 이미징 실험을 위해, 우리는 GFP, TagRFP 10 바이너리 Gal4/UAS 표현 시스템 12 통제 산도에 민감한 pHluorin 11 같은 다양한 형광 분자로 태그 유전자를 표현한다. 개발 photoreceptors의 표현 Gal4 - 라인 GMR - Gal4 (모든 photoreceptors) 8 mDelta0.5 - Gal4 (R4와 R7을 개발) 13가 포함되어 있습니다. 몇몇 subtype 특정 Gal4 - 드라이버 라인 사용하는 다른 Rhodopsin의 발기인 14 존재합니다. 라이브 영상에 특히 유용합니다 형광 프로브는 photoconvertible 단백질입니다. 우리는 성공적으로 Dendra2, monomeric 녹색 - 투 - 붉은 photoconvertable 단백질 15를 사용했습니다. Dendra2가 488nm 아르곤 레이저 라인을 사용하여 photoconvertible 수 있도록 설계됩니다. 그러나, 우리는 기존의 또는 공진 중 공촛점 스캔 모드에서의 설정을 사용하여 보이는 푸른 불빛을 사용하여 변환을 달성할 수 없습니다. 반면, 405nm UV 레이저로 변환 효율적입니다. 3. Immunohistochemistry : 고정 성인 아이에 대한, 우리는 자주 rhabdomeric 구조 (그림 1A)를 시각화하는 rhodamine phalloidin (Invitrogen 주식 회사) 또는 방지 Chaoptin (photoreceptor 특정 항체 16) 중 하나를 선택합니다. 라미나 카트리지 구조를 분석하는 좋은 방법은 안티 - chaoptin 16, glial 마커 방지 흑단 17 및 안티 sec6 18 일 (그림의 1B)를 결합하는 것입니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3 항체의 조합은 주요 presynaptic (chaoptin)와 postsynaptic (sec6) 프로세스뿐만 아니라 라미나 19 상피 glia (흑단)을 구별. 재관류 회의소 조립 라이브 영상을 위해, 우리는 조직 준비를 방해하지 않고 솔루션의 느린 교환을 허용하는 재관류 챔버를 사용합니다. 재관류 챔버 어셈블리의 행동은 동영상에 포함되어 있으며 간략하게 구조 그림 2에 표시됩니다. 재관류 챔버의 어셈블리 그림 그림입니다. 2A. 먼저 표본을 통해 근육을 마련함으로써 시작하고, 다음 그림과 같이 조립을 계속합니다. 가스켓의 목적은 챔버의 기본과 뚜껑, 조직 밀봉하고이를 통해 솔루션이 흐름되는 내부 공간 사이에 공간을 만드는 것입니다. 개스킷 내부 공간은 입구 (솔루션이 여기 입력), 조직 준비하고, 솔루션은 챔버 나뭇잎하는 통해 콘센트를 포함해야합니다. 가스켓의 두 기능은 중요합니다 : 첫째, 가스켓 아직 고해상도 렌즈 영상을 허용하도록 충분히 얇은 두뇌 정도 두께가되어야합니다. 이상적인 가스켓 두께가 설정 특정 매개 변수에 따라 달라집니다. 둘째, 근육에있는 노치가 거품이 시편 (그림 2B)를 문의하지 않고 통과하도록 허용하는 구획을 제공합니다. 현미경에서 이미징 우리는 직접 슬라이드에있는 문화 매체에 재관류 챔버 또는 63x 물 침지 렌즈를위한 63x (조리개 1.3) 글리세린 침지 렌즈를 사용합니다. 글리세린 렌즈는 석유 렌즈보다 작동 거리를 제공합니다. 우리는 종래의 스캐너 (8,000 Hz에서 1,400 Hz에서 비교, 각각)보다 훨씬 빠른 속도로 스캔 공진 스캔 공촛점 현미경을 사용합니다. 공진 스캔 빠르게에서 시간이 지남에 3 차원 녹음이 가능합니다어 프레임 속도. 또한, 빠른 스캔 속도는 상당히 살아있는 조직의 반복 검사에 대한 주요 관심사입니다 레이저 phototoxicity 6 줄일 수 있습니다. 레이저 강도와 PMT 전압 (이득)의 균형은 노이즈를 최소화하고 photobleaching하면서 신호를 최대화하기 위해 달성해야합니다. 중요한 추가 고려 사항 주어진 지역에 레이저에 미치는 영향의 크기는 해상도와 줌에 의해 결정됩니다 것입니다. 예를 들어, 선택의 지역은 512x512, 확대 1X에서와 같은 256x256, 확대 2X에서 동일한 해상도로 스캔, 아직 maximally 가능한 라이브 영상 속도는 256x256에서 줌 2 배 4 배 빠릅니다. 신속 세포내 구획을 이동의 활동을 기록하기 위해, 우리는 성공적으로 다음과 같은 설정으로 기록했습니다 : Z - 스택 당 5 프레임 하나의 속도로 8,000 Hz에서와 2X 라인 평균의 스캔 속도로 10초 당 Z - 스택. 시간의 규모에 긴 이미징 세션에, 우리는 종종 몇 분 당 한 프레임 속도를 줄이고 준비가 전환 될 가능성이 더욱 높아집니다로 큰 영역을 선택합니다. Drosophila 비주얼 시스템 해부학 그림 3은 Drosophila의 성인 아이 (그림 3A), 성인 뇌 (그림 3B), 그리고 20 % -25 % pupal 눈 디스크 / 두뇌 복합 (그림 3C)의 해부를 보여줍니다. 그림 3A 함께하고 얇은 판과 연결된 지방세포없이 모두 성인 눈을 보여줍니다. 성인 눈 해부 동안 photoreceptor 세포 기관 (왼쪽)에 의해 형성된 그릇에 자리잡고 눈의 중앙에있는 얇은 판은, (오른쪽) 아래 세포의 시체를 중단하지 않고 제거해야합니다. 성인 뇌 해부 들어, 하나는 photoreceptor 세포 기관, 얇은 판, 광 엽, 중앙 두뇌 및 기관 (그림 3B)를 구별할 수 있어야합니다. 광학 엽에 부착된 얇은 판을 떠나는 동안 photoreceptors과 기관이 해부를 위해 삭제해야합니다. 20-25% pupal 눈 디스크 / 두뇌 단지의 식별에 투입, 실제 이미지가 그림 3C에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="뇌, 시엽, 세포체를 보여주는 신경 해부학 다이어그램; 박판, 광수용체의 해부." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 1"> 그림 1. (A) 성인 뇌. (B) 성인 아이. (C) 20 % -25 % pupal eye-disc/brain 복합 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="시편 흐름, 대물 렌즈, 입구, 출구, 펌프, 개스킷, 베이스가 있는 미세유체 설정 다이어그램." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 2"> 그림 2. (A) 재관류 챔버 어셈블리 및 표본에 비해 (B) 개스킷 위치. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="형광 현미경 이미지; 세포 구조, 녹색/빨간색 마커, 실험 비교." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 방지 chaoptin를 사용하여 (A) 성인 rhabdomere 염색법. 안티 chaoptin (녹색, photoreceptors), 안티 - 백 (빨강, glia), 그리고 sec6 (파란색, interneurons)를 사용하여 (B) 성인 라미나의 얼룩.

특수 장비 : <ol><li> 절개 범위 : 디지털 카메라와 Leica Mz12.5 </li><li> 종래와 공진 스캔 Leica TCS SP5 공촛점 탄뎀 - 스캐너 현미경 라이브 블루 (488nm), 녹색 (561nm), 오렌지 (594nm)과 멀리 붉은 (633nm) 레이저뿐만 아니라 특별한 63x, 1.4 글리세린 및 63x, 1.3 물 침지 렌즈를 포함한 이미징 현미경. </li><li> 하버드 악기 공촛점 이미징 회의소 RC - 30과 연동 펌프 모델 720 </li><li> 서터 피펫 풀러 P - 97 </li><li> 소프트웨어 : Amira 5.2 비세 영상 </li></ol>

개발 및 성인의 준비 drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 retinae

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

<em&gt; Drosophila</em&gt; 두뇌와 시각 시스템의 연결을 광범위하게 개발, 기능과 퇴보를 공부하기 위해 모델 시스템을 이용하고 있습니다. 여기는 세 두뇌의 준비와 개발 pupae의 개발 눈을 디스크 뇌의 복잡한에서 파리 성충에서 각각의 안구와 뇌 해부 범위를 커버 영상 시스템을 보여줍니다. 모든 프로토콜은 준비 라이브 문화 최적화되어 있습니다. 그러나, 우리는 고정 조직 immunohistochemistry 어디에 적용을위한 조건을 제시한다. 마지막으로, 우리는 재관류 챔버에서 종래와 공진 4D 공촛점 라이브 이미지를 사용하여 이러한 준비에 대한 라이브 이미징 조건을 보여줍니다. 함께,이 프로토콜은 몇 시간의 규모 발달이나 퇴행성 프로세스 분 규모의 기능성 세포 assays에 이르기까지 다양한 시간 스케일에서 라이브 영상에 대한 기초를 제공합니다.

이 프로토콜은 세 설명<em&gt; Drosophila</em&gt; 준비 : 눈을 디스크 두뇌 단지의 절개를 개발 1) 성인 뇌 해부, 2) 성인 망막의 해부 3). 모든 준비가 고정 조직 immunohistochemistry 사용할 수 있지만 강조는 특별한 준비 기술과 라이브 영상을위한 조건 마련이다.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

초파리(Drosophila)의 뇌와 시각 시스템은 신경세포의 발달, 기능 및 퇴행을 연구하는 데 널리 활용되는 모델 시스템입니다. 본 영상에서는 세 가지...

안녕하세요, 이번 영상에서는 광수용체 세포에 중점을 두고 실시간 이미징 및 면역조직화학 염색을 위한 뇌와 망막 표본 제작 방법을 시연하겠습니다. 먼저 뇌 해부를 위한 준비 과정을 보여드리겠습니다. 이어서 성체 뇌, 성체 망막, 그리고 발달 중인 안구라는 세 가지 서로 다른 해부 과정을 시연하겠습니다.각각의 경우에 대해, 조직을 면역조직화학 염색을 위해 고정하거나 살아있는 상태로 이미징할 수 있습니다. 마지막으로, 살아있는 조직을 이미징하는 방법을 설명하고, 공명 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라이브 이미징의 몇 가지 사례를 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.Goodness Section을 위해서는 날카로운 핀셋이 필요합니다. 샤프닝 블록이나 매우 고운 사포를 사용하여, 끝부분이 맞닿을 때까지 핀셋의 양면을 부드럽게 앞뒤로 문지릅니다. 아주 정교한 끝부분을 만들기 위해 표준 샤프닝 스톤을 사용합니다.여기서 연마 기술에 대해 다루지는 않겠으나, 살아있는 상태의 해부에는 날카로운 핀셋이 필수적이라는 점을 말씀드리고 싶습니다. 저희는 성체 뇌 해부를 위해 매일 핀셋을 연마합니다. 초파리를 CO2 패드 위에 올려 마취시키고 원하는 유전자형을 분류하십시오.동공 해부를 위해, 바이알 안에 손을 넣어 포셉으로 동공을 조심스럽게 꺼내되, 동공 케이스가 파손되지 않도록 주의하십시오. 킴와이프(kim wipe)를 뭉쳐 물로 적셔 둡니다. 이는 해부 과정 중에 포셉에 묻은 이물질을 제거하는 데 사용됩니다.해부 접시를 실체 현미경의 스테이지 위에 놓고 HL three 용액을 채웁니다. 해부 과정 동안 조직이 살아있고 건강한 상태로 유지되도록 모든 해부는 HL three 내에서 수행합니다. 또한, 해부 중 포셉을 보호하기 위해 바닥면이 Syl guard로 덮인 해부 접시를 사용하는 것을 권장합니다.이제 고정액을 준비합니다. 면역조직화학염색을 수행할 계획이라면, 500 µL 마이크로 원심분리 튜브에 HL three 180 µL를 넣으십시오.3.7% formaldehyde 용액을 만들기 위해 37% formaldehyde 20 µL를 첨가합니다. 마지막으로, 성공적인 해부를 위해서는 올바른 손 위치가 중요합니다. 손 위치가 적절해야 핀셋을 안정적으로 유지하며 세밀하게 제어된 움직임을 수행할 수 있습니다.먼저 포셉을 엄지손가락 옆면에 놓고, 검지를 곧게 내려 손가락 끝이 포셉 상단에 닿게 합니다. 이제 포셉의 옆면을 중지 옆면에 기대고 해부 접시로 옮깁니다. 엄지와 중지를 접시 위에 올린 상태에서 엄지와 중지로 접시에 물리적 접촉을 유지합니다.손목을 현미경 스테이지 위에 고정하십시오. 이런 식으로 하시면 됩니다. 해부 과정 동안 세 지점을 표면에 단단히 고정하게 되며, 이제 핀셋을 이용해 매우 미세한 조작만 수행하는 것이 가능해집니다.CO2 패드 위에서 성체 초파리의 배면이 위로 향하게 하고 머리가 손 반대 방향이 되도록 배치합니다. 머리 바로 아래의 가슴 부위를 잡습니다.제대로 수행되었다면, 실체 현미경으로 관찰하는 동안 다리와 주둥이가 확장됩니다. 핀셋으로 확장된 주둥이를 잡아 머리를 분리한 뒤, 몸통은 버리고 머리를 용액에 담급니다. 담긴 머리에 초점을 다시 맞춥니다. 모든 해부 과정은 용액 속에서 진행됩니다.포셉으로 머리 부분을 항상 잡고 있는 것이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 머리가 떠오르게 됩니다. 떠오른 머리는 항상 회수하기 어렵다는 점을 기억하십시오.해부 중에 머리 부분이 초점에서 벗어나면, 현미경을 조정하지 말고 단순히 머리 부분을 다시 초점 평면으로 이동시키십시오. 이 작업이 처음에는 간단해 보이지만 어려울 수 있으나, 시간이 지나면 머리 부분의 초점을 맞추는 것이 더 쉬워질 것입니다. 먼저 주둥이와 눈 사이의 결합 조직을 찢어내어 해부를 시작하십시오.항상 최소 하나 이상의 포셉으로 단단히 고정한 상태에서 눈을 가로질러 찢어줍니다. 포셉의 끝이 망막이나 큐티클 바로 아래에만 위치하도록 주의하십시오. 아래쪽의 뇌가 손상되는 것을 방지하기 위해 왼쪽과 오른쪽을 번갈아 가며 수행합니다.포셉을 사용하여 머리 뒤쪽 방향으로 망막을 찢어 제거합니다. 망막을 제거하면 층판(lamina)이 시엽(optic lobe)에 부착된 상태로 유지될 가능성이 높아집니다. 해부 과정 전반에 걸쳐 머리 뒤쪽을 따라 이동하며 큐티클을 찢어내고, 반대편 눈의 큐티클까지 찢어낸 후 큐티클을 벗겨내기 시작합니다.큐티클을 잡고 있는 한, 뇌를 압착하지 않는다는 것을 알 수 있습니다. 이를 염두에 두고, 뇌가 드러날 때까지 큐티클과 망막을 계속해서 당겨 분리하십시오. 뇌가 보이면 뇌에 부착된 기관을 제거하기 시작하고, 뇌가 완전히 분리될 때까지 기관과 큐티클을 계속해서 당겨내십시오.이제 광수용체 말단을 이미징하기 위한 나머지 단계를 위해 디쉬의 바닥 부분으로 초점을 다시 맞추어야 합니다. 라미나(lamina)는 유지하는 것이 좋으나, 세포체와 강한 자가형광 색소를 포함하고 있는 망막은 제거해야 합니다. 이를 위해 라미나에 손상을 주지 않도록 주의하며 덤불 모양의 세포체 잔해를 조심스럽게 잡아당겨 제거하십시오.이 과정은 더 정교한 기술이 필요하며 연습이 필요합니다. 남은 기관을 제거하십시오. 야간 항체 세척 과정 중에 뇌가 떠오를 수 있으므로, 성체 뇌는 섹션 7에서 설명할 조건을 사용하여 수 시간 또는 밤새도록 생존 상태로 유지할 수 있습니다. 면역 조직 화학 염색을 위해, 이제 성체 뇌를 포름알데히드로 고정할 준비가 되었습니다.5 µL로 설정된 P 20 피펫을 사용하여 성체 뇌를 미리 준비한 고정액으로 옮깁니다. 성체 뇌 해부를 20분 동안 계속 진행하여 4~10개의 뇌를 확보합니다. 뇌를 고정액에 넣고 40분 동안 더 고정합니다.하지만 이 기간은 달라질 수 있습니다. 최적의 1차 항체 염색을 위해, 포름알데히드 용액을 제거하고 PBS와 0.4% TRITTON X 100을 포함하는 용액(이하 PBS Triton으로 지칭) 400 µL로 뇌를 5분씩 세 번 세척하십시오. 고정액을 완전히 세척한 후, 1차 항체 용액을 추가할 수 있습니다.성체 뇌에 대해 설명된 방법대로 해부를 시작하십시오. 머리를 침지시킨 후 현미경의 초점을 다시 맞추고, 먼저 probus 위쪽의 probus와 눈 사이의 결합 조직을 찢어내는 것부터 시작하십시오. 큐티클을 눈에서 분리하십시오. 이제 포셉 하나를 사용하여 머리 뒷부분을 향해 눈의 아래쪽에서 큐티클을 분리하십시오.이 해부를 위해 머리 뒷부분의 중앙을 잡으십시오. 다른 포셉으로 뇌를 눌러도 무방합니다. 눈을 잡고 양옆으로 벌려 당기십시오.안구가 접시 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 라미나(lamina)가 여전히 안구에 부착되어 있을 가능성이 높으며, 이를 통해 완전히 손상되지 않은 광수용기 세포의 광수용기 말단을 라이브 이미징(live imaging)하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 세 섹션에서는 면역조직화학 염색을 위해 안구를 준비하는 방법을 설명합니다.면역조직화학 염색을 위해 안구를 고정액으로 옮깁니다. 5 µL로 설정한 P 20 파이펫을 사용하여 성체 안구의 해부를 총 10분 동안 계속 진행합니다. 안구를 고정액에 30분 동안 더 방치하여 고정합니다.고정액을 제거하고 성체 뇌 해부 과정에서 설명한 대로 세척을 수행합니다. 최종적으로 눈의 물질적 구조를 이미징하려는 경우, 이를 제거해야 합니다. 이제 고정된 눈을 해부 접시로 옮기고, 여전히 부착되어 있을 수 있는 기관이나 지방 세포를 제거합니다.그런 다음 한쪽 포셉으로 안구 바깥쪽을 잡고, 다른 쪽 포셉으로 라미나(lamina)를 제거합니다. 라미나가 한 조각으로 떨어져 나오면서 그 아래의 세포체가 노출되어야 합니다. 이때 라미나만 잡도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 세포체가 망막에서 분리될 위험이 있습니다.P 20 파이펫을 사용하여, 눈을 500 µL 튜브에 담긴 400 µL의 PBS Triton으로 옮깁니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어주어 광수용체로부터 자가형광 적색 색소를 제거합니다. 다음 날, 세척액을 버리고 라미나(lamina)가 없는 성체 눈의 라이브 이미징을 위한 1차 항체를 첨가합니다.우리는 eclosion 직전의 후기 pupae 단계인 ferret 성체 파리만을 사용합니다. 이 단계에서는 해부 과정 중 lamina의 terminals에서 광수용체 세포체가 분리됩니다. 성체 pupae는 puparium case를 통해 확인할 수 있는 뚜렷한 날개, 눈 및 큐티클을 가지고 있습니다.번데기 하나를 선택하여 HL three에 담급니다. 머리 부위가 드러나도록 번데기 껍질의 앞부분을 제거합니다. 발달 중인 파리를 추가적으로 둘러싸고 있는 얇은 내막을 조심스럽게 제거합니다.포셉으로 머리의 기부를 잡고 당깁니다. 머리가 잠긴 상태를 유지하며 번데기의 나머지 부분은 폐기합니다. 성체 단계의 면역조직화학 염색을 위한 안구 해부법에 설명된 대로 진행하십시오.하지만 광수용기 세포체는 라미나(lamina)로부터 더 쉽게 분리되므로, 망막에 자리 잡은 세포체를 이미징할 수 있습니다. 또한, 라미나는 시엽(optic lobe)에 부착된 상태로 유지되므로 원위부 라미나를 이미징할 수 있습니다. 광수용기 말단 카트리지(terminal cartridges)가 관찰되는 근위부 라미나를 이미징하고자 한다면, 라미나가 눈에 더 강력하게 부착되어 있는 성체 초파리를 사용하여 눈 해부 과정을 수행하십시오.pupil 발달 20% 단계의 발달 중인 안구 Disc는 우리 실험실에서 라이브 이미징을 위해 즐겨 사용하는 표본입니다. 상대적으로 크기가 큰 발달 중인 세포들이 단일 층을 이루고 있어 공초점 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있기 때문입니다. 20% pupa를 선택하려면 pupil case 아래에 나타나는 녹색 반점인 Ian tubules를 확인하고, 20% pupil 발달 이후에 형성되는 어두운 색의 몸체를 가진 pupi는 피하십시오.번데기를 선택한 후, 해부 접시에 담긴 HL three에 담그고 번데기 껍질의 앞부분을 조심스럽게 제거하십시오. 이때 얇은 내막을 뚫지 않도록 주의하십시오. 핀셋으로 내막을 잡고 양옆으로 벌려 당기십시오.방출된 내용물을 주의 깊게 살펴보고, 상당히 두드러지게 보이는 발달 중인 뇌와 안구 디스크를 찾으십시오. 해부 접시 바닥에 있는 뇌를 분리하십시오. 중앙 뇌를 시엽으로부터 조심스럽게 분리하십시오.시각엽 I 디스크 복합체는 라이브 이미징에 사용됩니다. 한두 가지 용액에서만 짧은 시간 동안 이미징하고자 하는 경우에는 유리 슬라이드 위에서 조직을 이미징할 수 있습니다. 이 경우, 제조사의 지침에 따라 슬라이드 표면을 Sylgard로 먼저 코팅하여 슬라이드를 준비하십시오.슬라이드 중앙에 HL three 20 µL를 넣습니다. 분리한 조직을 추가적인 HL three 20 µL에 담아 슬라이드로 옮깁니다. 조직이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오.또한, 피펫 조작으로 인한 스트레스나 변형이 발생하지 않도록 주의해야 합니다. 라이브 이미징을 위해서는 조직을 단단히 고정해야 합니다. 전기생리학적 기록을 위해 풀링(pulling)한 것과 같은 유리 전극을 준비하십시오.팁 끝부분을 떼어내고 입으로 생성한 음압을 이용하여 끝부분을 glue stitch로 채웁니다. 이때 접착제가 들어갈 수 있을 정도만 전극을 떼어내십시오. 이제 양압을 사용하여 HL three 한 방울 아래의 sill guard에 소량의 접착제를 도포합니다. 그런 다음, 라이브 이미징을 위해 원하는 방향을 유지하며 접착제 위에 조직을 빠르게 고정합니다.이제 이미징을 위해 수침 렌즈를 사용할 수 있습니다. 막 투과성 염료를 추가하려면 배스에 넣어주십시오. 장시간 이미징을 수행하거나 용액을 완전히 또는 여러 번 교체해야 하는 경우에는, 살아있는 조직 위로 배양액을 천천히 흘려보내 주는 연동 펌프에 연결된 퍼퓨전 챔버를 사용합니다.얇고 평평하게 깎아낸 Sylgard 한 방울이 코팅된 커버슬립을 사용하십시오. 커버 중앙에 HL three 20 µL를 분주합니다. 생체 조직을 Sylgard 위에 올리고 고정합니다.생체 조직이 공기에 노출되지 않으면서 기포는 챔버를 통과할 수 있게 하는 가스켓을 제작하십시오. 가스켓은 조직이 눌리지 않을 만큼 충분히 두꺼워야 하지만, 동시에 조직이 공초점 현미경 렌즈에 충분히 가까워질 수 있도록 적당히 얇아야 합니다. 조직이 항상 완전히 잠겨 있도록 주의하며 관류 챔버를 조립하십시오.따라서 용액 교체는 분당 최대 100 µL의 속도로 수행할 수 있습니다. 시간 단위의 이미징을 위해서는 20 hydroxy Dyson과 항생제를 추가해야 할 수도 있으나, 항진균제는 추가하지 않으며 분당 약 10 µL의 훨씬 느린 속도로 관류를 수행합니다. 또한, 연동 펌프에 공급되는 배양 배지에 산소를 버블링합니다.이제 초파리 뇌와 망막을 성공적으로 해부하는 데 필요한 모든 기술을 습득하셨습니다. 또한, 발달 중인 살아있는 안구 원판이나 성체 광수용체를 이미징할 수도 있습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

라이브 영상 분석을위한 Drosophila의 배아를 준비, 간단한 저렴하고 효과적인 방법이 제공됩니다. 우리 프로토콜은 습도와 가스 교환을 제공하고 Drosophila의 배아를 압축하지 않습니다. 이 방법은 stereomicroscope 또는 수직 복합 현미경을 사용하여 Drosophila의 배아의 GFP 기반의 라이브 영상에 적합합니다.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

이 비디오는 성체 파리의 온전한 뇌를 다리 슬라이드 아래에 장착하는 방법을 설명하고 형광 현미경 검사를 위해 면역 염색된 뇌에 수행되는 프로토콜을 보여줍니다.

성인 초파리 뇌 장착: 컨포칼 이미징을 위한 슬라이드를 준비하는 방법

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

우리는 행동 도중 그리고 자극에 응하여 성인 Drosophila의 전체 두뇌를 이미지하기 위하여 특별히 조정된 방법을 제시합니다. 머리는 전체 뇌에 광학 액세스를 허용하기 위해 배치되며, 비행은 다리와 안테나, 프로보시스의 끝을 움직일 수 있으며 눈은 감각 자극을받을 수 있습니다.

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

배우세요 Drosophila 성체 뇌와 망막의 실시간 영상 및 면역조직화학을 위한 분리 기법을. 공명 스캐닝 공초점 현미경을 활용한 광수용체 세포 연구 방법을 익혀보세요.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

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