Name: 실험 전이 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 학습하세요 실험 전이 분석법으로 인간 암세포의 전이 능력을 평가하는 방법을 배우세요. 면역결핍 마우스 꼬리 정맥 주입을 통해 폐 전이를 유도하고 정량화하여 암세포의 전이 잠재력을 연구합니다.

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이 프로토콜은 테스트 및 박사 리차드 하인즈 (MIT)의 실험실에서 처음에 최적화되었습니다. 기금은 NYSTEM 아이디어 수상 (LX)을하고 루트 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (LX)를 제공합니다.

1. 샘플 준비 <ol><li> 성장 요인 또는 FBS 그들의 특정 미디어에 ~ 70 % 합류 (예 : MC - 1 세포를 10 % FBS와 DMEM)에 세포를 성장. 접시에서 미디어를 대기음 부드럽게 1 X PBS (나 2 HPO 4 NaCl 8 G / L, KCl의 0.2 g / L, 1.15 g / L 0.7 H 2 O, KH 2 PO의 0.2 g / L로 여러 번 씻어 4, 산도 7.3). </li><li> 대기음 PBS가와 versene에서 0.05 %의 트립신 (0.014 g / 페놀 빨간색과 1 X PBS, pH를 7.2에서 0.2의 G / L EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 나의 L) 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 접시에서 세포 분리를 촉진하기 위해 플레이트를 바위. 현미경 세포를 관찰합니다. 그것은 일반적으로 분리하는 세포에 대한 2-5분 걸립니다. </li><li> 트립신 활동을 담금질하고 50mL 팔콘 튜브에 세포를 수집하는 FBS (또는 대두 트립신 억제제)가 포함된 미디어의 충분한 볼륨을 추가합니다. hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 깨끗한 hemacytometer에 세포 현탁액의 10μL를로드합니다. ML 당 세포의 숫자는 10 4 곱한 다섯 제곱의 각 # 세포의 평균 같습니다. </li><li> 1000 세포를 원심 RPM (또는 ~ 200 XG) 3 분 benchtop 원심 분리기 인치 </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 미디어를 제거합니다. ~ 5 × 10 6 세포 / ML의 최종 농도에 도달하는 행크스 밸런스드 버퍼 솔루션 (HBSS)의 적절한 볼륨으로 세포를 Resuspend. </li><li> 팰컨 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포는 큰 세포 집계를 제외합니다. 표시 5mL 팰컨 문화 관을 통해 직접 필터에 피펫의 끝에 놓습니다. 신속 문화 튜브에 필터를 통해 중지를 꺼냅니다. </li><li> hemacytometer를 사용하여 다시 셀을 카운트 및 2.5 × 10 6 / ML의 최종 농도로 희석. 얼음 세포 보관하십시오. </li><li> 세포의 생존을 결정합니다. trypan 파랑 몇 가지 세포를 혼합하고 hemacytometer를 사용하여 총 전지를 통해 죽은 (파란색) 세포의 백분율을 측정합니다. 세포의 생존 능력은 주사하기 전에 ≥ 90%되어야합니다. </li></ol> 2. 정맥 주사 <ol><li> 장갑을 변경합니다. 부드럽게 immunodeficient 마우스 (누드, NOD - SCID, 또는 NSG, 잭슨 연구소)의 꼬리를 잡고 restrainer 뒤쪽에있는 작은 오프닝 바깥으로 튀어나와있는 슬릿과 꼬리 상대로 다시와 마우스 restrainer으로 당겨 . </li><li> 반지는 마우스의 입을 잡는다 한번 천천히 슬릿을 따라 안쪽 링 슬라이드 및 장소에 잠금. 마우스가 자유롭게 이동 할 수있는 거 아니지만, 호흡의 정상적인 비율이 있어야합니다. </li><li> 주요 꼬리 정맥을 찾아보십시오. 네 개의 주요 혈관은 마우스 꼬리에 존재한다. 꼬리 지느러미 및 복부 양쪽에 혈관이 동맥 있습니다. 정맥 꼬리의 측면 측면에 있습니다. </li><li> 1mL 주사기에 준비 세포의 200 명 이상 μL을 그립니다. 30 G1 / 2 인치 바늘을 부착하고있을 수있는 공기 방울을 밀어. 주사기의 세포의 최종 부피는 200 μL (즉, 5 총 X 10 5 세포)해야합니다. </li><li> 꼬리 정맥에 세포를 주입. <ol class="lalpha"><li> 첫 번째 재판이 실패한다면, 꼬리보다 근위 영역이 두 번째 시도에 사용될 수 꼬리의 말초 월말부터 시작합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 꼬리를 닦아주십시오. 바로 꼬리를 당겨. 엄지와 꼬리의 끝을 잡고 검지로 주입을위한 지점을 지원합니다. </li><li> 정맥에 바늘을 넣고 세포를 주입. 바늘과 주사기가 주사시 정맥에 병렬로되어 있는지 확인하십시오, 그렇지 않으면 바늘이 혈관 벽을 통해 찌를와 인접한 꼬리 조직에 세포를 주입합니다. </li><li> 주사 후 바늘을 철회. 피가 분사가 성공적으로 간 경우 주사 사이트에서 넘치도록해야합니다. 응고 촉진 사출 사이트에 종이 타월이나 면봉의 깨끗한 부분을 누르면, 유통 정맥에 잔류 시료를 밀어 꼬리 위쪽을 촉진하다. </li><li> restrainer에서 마우스를 해제하고 감옥에 돌아갑니다. 연구실 노트 (예를 들어, 얼마나 많은 시련이 세포를 주입하는 데리고 얼마나 세포 주입되었다) 사출 과정을 기록합니다. </li><li> 로 샘플 준비 섹션에서 설명한 주입 후 세포의 생존을 결정, 9 단계. 이 단계는 세포가 사출 과정에서 살아남는 것을 안심을 제공합니다. 주사 실험의 끝에, 세포의 생존 능력은 감소되지만 80% 이상이어야합니다. </li><li> (옵션) 남은 세포를 스핀 다운하여 한 번 PBS로 알약을 씻어. 미래의 분석 (예를 들어, 유전자 발현이나 knockdowns 확인을 위해 서부 blots)를 -80 OC에서 알약을 고정. </li></ol></li><li> 일반적으로 1 ~ 2 개월 후, 생쥐 해부되며 metastases의 위치는 조잡한 결정됩니다. 그것은 세포가 그들이 이후에 발생되는 최초의 모세관 침대 포함되어 있으므로 폐암이 전이의 기본 사이트입니다순환을 입력합니다. </li><li> PBS, 폐 (또는 metastases을 포함한 다른 조직)의 각 엽과 rinsing 후 해부 현미경 (그림 1)에서 관찰됩니다. 폐 metastases의 총 개수로 폐 양쪽에 감지 metastases의 수를 계산하고 모든 네 개의 엽 (叶)에 폐 metastases의 숫자가 함께 추가됩니다. 폐가가 포르말린 하룻밤에 수정하는 경우 한 폐에 metastases 더 쉽게 감지 , metastases는 인접한 어두운 갈색 폐 조직에 대조적으로 약간 흰 반점으로 apppear 때문에. </li></ol> 3. 룽 Metastases에서 Culturing 셀 <ol><li> 룽 metastases는 주입 생쥐에서 격리됩니다. 각각은 별도 양식되어야합니다. </li><li> 각 전이는 70 μm의 셀 스트레이너에 주사 바늘 뚜껑 (멸균)의 말까지 다진 것입니다. </li><li> 매체 및 문화 접시에있는 필터를 통과 수집된 세포의 여러 MLS와 셀 스트레이너 린스. </li><li> 방해하지 않고 적어도 나흘 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> PBS와 함께 접시에 혈액이나 조직 파편을 멀리 씻으십시오. </li><li> 신선한 매체를 추가하십시오. 처음에는, 암 세포 fibroblast 세포 모두 접시에 성장하지만, 점차, fibroblast 세포 밖으로 죽을 암 세포로 대체됩니다. 암 세포가 어떠한 약물 모성 유전자를 가지고있다면, 해당 항생제로 셀을 선택합니다. </li><li> 파생 세포의 순도는 인간 특정 단백질에 대한 항체를 사용 immunostaining에 의해 평가됩니다. 우리는 안티 인간 vimentin 항체 (NCL - VIM - V9, Novocastra)를 사용합니다. 우리가 파생된 세포도 약물 선택의 부재에서 인간 세포의 99 % 이상 일반적으로 포함되어 있습니다. 새로 파생된 세포는 위에서 설명한 바와 같이, 그들의 전이성 능력을 테스트하기 위해 immunodeficient 생쥐에 다시 주입 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <ol><li> 거의 폐 metastases가 저조한 전이성 암 세포 라인에서 올 때이 분석의 끝에, 높은 전이성 암 세포 라인은 일반적으로 많은 폐 metastases (그림 1), 1 상승을 제공합니다. </li><li> 이 방법을 사용하여 파생된 세포는 일반적으로 그들이 다시 분석을 사용하여 테스트하는 부모의 라인보다 metastases을 일으키다. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 암 세포의 꼬리 정맥 주사 후 마우스 폐 그림 1. 대표 이미지. 전이성 인간 흑색증 셀 라인, SM 세포 4 5 X 10 5 immunodeficient 생쥐의 꼬리 정맥에 주입했다. 두 달 후 폐는 고립되었고 metastases은 정상적인 폐 조직 간의 분산 발견되었습니다.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

전이는 암 환자에서 사망의 주요 원인입니다. 그들의 주요 loci, 유통에 자신의 항목 (intravasation), 순환 (넘쳐 흐름)에서 ​​자신의 종료, 그리고 먼 장기에 생존과 성장에서 암 세포의 분리 : 그것은 네 개의 주요 단계를 포함한다. 인간의 전이는 느린 과정으로 간주하고 종종 지연 년 이후 각성입니다. 적시에 자사의 진행을 연구하기 위해 위의 비교적 신속하게 실험적인 분석은 immunodeficient 생쥐에서 설립되었습니다. 4 설립 이래, 그것이 다른 전이성 능력을 가진 세포를 분리하기 위해 효과적으로 사용되고 있습니다, 최대 - 아래 - 규제하는 동안 아르 유전자를 식별 전이 1,2,5, 그리고 전이 동안 이러한 유전자의 인과 관계 역할을 테스트 3. 이 분석에서 가장 어려운 단계는 꼬리 정맥에 세포를 주입하는 것입니다. 그것은 주입 기술을 마스터하는 방법을 걸립니다. 비록 경험이 연구자를위한,...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2.5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 튜브</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리 튜브</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70&amp;mu;m 세포 스트레이너</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5ml Falcon 배양 튜브</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>혈구계수기</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;frac12; 게이지 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>마우스 보정기</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

실험 전이 분석

Experimental Metastasis Assay

전이는 암 환자에서 사망의 주요 원인입니다. 전이의 메커니즘을 이해하기 위해서, 실험적인 전이 분석은 immunodeficient 마우스를 사용하여 설립되었습니다. 이 문서는 샘플 준비, 정맥 주사, 그리고 폐 metastases에서 culturing 세포를 포함하여이 분석에 관련된 절차를 delineates. 간단히, 인간의 암 세포의 미리 정해진 숫자는 준비가되어있다<em&gt; 체외에서</em&gt; 직접 자신의 꼬리 정맥을 통해 immunodeficient 생쥐의 순환에 주입. 세포의 소수의 순환에 난기류를 생존과 같은 폐 등 내부 장기에 metastases로 성장합니다. 주입 생쥐는 일정 기간 후 해부를하고 있습니다. metastases의 조직 분포는 해부 현미경으로 결정됩니다. 특정 조직에 metastases의 수를 계산하고 직접 주입 암 세포의 전이성 능력을 상호 있습니다. 일어 metastases는 절연 및 양식 아르<em&gt; 체외에서</em&gt;로 immunodeficient 생쥐에 다시 주입했을 때 종종 부모의 라인보다 더 향상된 능력을 보여주 전이성 세포 라인. 이러한 높은 전이성 파생 상품은 전이성 진행을 조절 유전자 또는 분자 경로를 확인하는 유용한 도구가됩니다.

이 문서는 인간의 암 세포 라인의 전이성 잠재력을 결정하는 데 사용되는 실험적인 전이 분석의 절차를 설명합니다.

전이는 암 환자의 주요 사망 원인입니다. 전이 기전을 이해하기 위해, 실험적 전이 분석법이 수립되었습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 꼬리정맥 주입을 통해 인간 암세포의 전이 능력을 테스트하는 것입니다. 먼저 면역결핍 마우스에 주입할 세포를 준비합니다. 그 다음, 준비된 세포를 면역결핍 마우스에 주입하며, 주입 후 1~2개월이 지나면 폐 전이가 발생하게 됩니다.마우스를 해부하여 폐 전이를 정량화하고 배양합니다. 이러한 유형의 분석 결과는 특정 유형의 암세포의 전이 정도를 나타냅니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 생의학 유전학과의 Dr.LE 연구실 소속 Sonali Mohanty입니다.오늘은 실험적 전이 분석을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 암 전이를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.약 70% 밀도로 배양된 세포에서 시작하여 플레이트의 배지를 흡입하고 1X PBS로 한 번 가볍게 세척합니다. 다음으로 0.05% Trypsin을 2 mL 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 세포 분리를 촉진합니다.현미경으로 세포가 떨어지는 것을 관찰하십시오. 트립신 활성을 중단시키기 위해 FBS가 포함된 배지를 충분한 양으로 첨가하십시오. 그런 다음 50 milliliter 튜브로 옮기십시오.혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 농도가 결정되면, 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 약 200 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 배지를 조심스럽게 제거한 후, 적절한 부피의 Hank's balance buffer solution 또는 HBSS를 가해 최종 농도가 약 5 × 10⁶ cells/mL가 되도록 재현탁합니다.다음으로, Falcon사의 70 µm 셀 스트레이너로 여과합니다. 커다란 세포 응집체를 제거하기 위해, 5 mL 배양 튜브 위에 놓인 필터 위에 피펫 팁을 직접 댑니다. 현탁액을 필터를 통해 튜브 속으로 빠르게 배출합니다.트리판 블루(trypan blue)를 사용하여 세포 수를 다시 측정하여 생존율을 결정합니다. 주입 전 생존율은 90% 이상이어야 합니다. 그 후 최종 농도가 2.5 × 10⁶ cells/mL가 되도록 희석합니다.얼음 위에 보관하십시오. 면역결핍 마우스의 꼬리를 살며시 잡고, 마우스의 등이 슬릿에 닿게 하여 꼬리가 뒤쪽의 작은 구멍 밖으로 나오도록 마우스 보정기에 넣습니다. 슬릿을 따라 링을 천천히 안쪽으로 밉니다.링이 마우스의 입 부분을 잡으면 고정시킵니다. 마우스가 자유롭게 움직이지 못해야 하며, 호흡률은 정상이어야 합니다. 주요 꼬리 정맥을 찾습니다.

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꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

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