2010년 4월 9일
세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.
안녕하세요, 제 이름은 버지니아 커먼웰스 대학교 화학 및 생명과학과의 줄기세포 공학 연구실 학생인 릭 파스쿠아입니다. 이 비디오에서는 우리 실험실에서 저렴하고 자체 제작한 STO 스핀 장치를 사용하여 세포 표면 마커의 정량화를 위해 관찰 가능한 인간 만능 줄기 세포의 단층을 만드는 방법을 시연할 것입니다. 많은 면역화학 프로토콜이 챔버 슬라이드에서 성장한 h PSC에 대해 콜로니로 조정된다는 점을 감안할 때 개별 세포 수준에서 바이오마커의 발현을 특성화하는 데 문제가 발생할 수 있습니다.
세포를 단층에 두면 세포의 시각적 분석뿐만 아니라 발현을 정량화하는 데에도 도움이 될 수 있으며, 우리 실험실에서 사용하는 부비동 스핀 장치는 대부분의 실험실에서 발견되는 재료를 사용하여 구성할 수 있으며 작은 세포 샘플만 필요하며 어떤 유형의 특정 시약도 필요하지 않습니다. 그리고 더 중요한 것은 관찰을 위해 단일 세포의 확산을 안정적으로 재현할 수 있다는 것입니다. 다음은 시토신 장치를 구성하는 데 필요한 몇 가지 사항입니다.
플라스틱 슬라이드가 반드시 깨끗할 필요는 없기 때문에 원하는 경우 오래된 챔버 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 미리 청소된 유리 슬라이드. 이것들은 세포 단층이 생성되는 곳이기 때문에 청소해야 합니다.
여과지, 모든 종류가해야 하며 마이크로 피펫 팁이 있습니다. 1-10 마이크로 리터 팁은 건설이 시작되기 전에 우리 실험실에서 사용하는 것입니다. 먼저 플라스틱 슬라이드에 구멍을 뚫어야 합니다.
이것은 드릴 프레스를 사용하여 수행할 수 있습니다. 구멍의 직경은 마이크로 피펫 팁의 크기에 따라 다르며 표준 1-10 마이크로 피펫 팁에 사용되는 팁의 가장 넓은 부분의 너비 정도여야 합니다. 이것은 약 7mm여야 합니다.
플라스틱 슬라이드에 만드는 구멍의 양은 전적으로 용도에 따라 다릅니다. 예를 들어, 실험실의 면역화학 염색의 경우 일반적으로 두 개의 구멍을 사용하는데, 하나는 양성 염색용이고 다른 하나는 음성 배경 대조군용입니다. 이 슬라이드는 무기한으로 재사용할 수 있습니다.
여과지의 경우 플라스틱 슬라이드의 매개 변수에 맞게 조각을 잘라냅니다. 슬라이드의 구멍을 필터 용지에 구멍을 뚫기 위한 기준으로 사용하십시오. 여과지의 구멍 크기는 여기에 표시된 것처럼 마이크로 피펫 팁이 꼭 맞을 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다.
그런 다음 각 구멍에 대해 약 절반 길이의 적절한 수의 마이크로 피펫 팁을 잘라내야 합니다. 이것은 셀룰러 모노 레이어가 생성될 유리 슬라이드의 기초 역할을 합니다. 다음으로, 여과지가 그 위에 놓일 것입니다.
여과지는 현탁액 염색에서 과잉 매체를 흡수하는 역할을 합니다. 그런 다음 장치의 견고한 지지대 역할을 할 플라스틱 슬라이드로 마무리됩니다. 그런 다음 일반 가정용 테이프로 4면 모두를 밀봉할 수 있습니다.
마지막으로, 전체 마이크로피펫 팁이 장치의 절단 팁에 삽입됩니다. 이것은 현탁액 염색 후 세포 샘플이 배치되는 곳입니다. 보다 편리한 인식을 위해 유리 슬라이드에서 절단 팁이 있는 위치를 처음에 표시하는 것도 도움이 될 수 있습니다.
우리 연구실에서 사용하는 면역화학 현탁액 염색 프로토콜은 먼저 줄기세포를 단일 세포 현탁액으로 채취하는 것으로, 일반적으로 트립신 또는 비효소 EDTA 기반 세포 해리 완충액을 사용하여 효소를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 세포는 1ml로 옮겨져 2ml의 마이크로 원심분리기 튜브와 표준 성장 배지로 옮겨집니다. 그런 다음 200G에서 4분 동안 원심분리기를 합니다.
모든 후속 세척 및 스핀 다운 단계에 동일한 원심분리 속도가 사용됩니다. 그런 다음 배지를 수동으로 흡인하며, 세포 펠릿이 방해받지 않도록 흡인하는 동안 각별히 주의하십시오. 그런 다음 PBS 1ml로 두 번 회전하고 매번 흡입하여 세척합니다.
다음 단계는 이를 만드는 데 필요하거나 이 비디오의 첨부 글에 나열된 4%쌍의 포름알데히드 또는 PFA 시약을 사용하여 세포를 고정하는 것입니다. 세포를 4%쌍의 포름알데히드 용액에서 배양하고 실온에서 10분 동안 방치합니다. 이 단계는 세포외 현탁액, cyto spin 장치의 사용을 위한 염색 전에 수행하는 것이 좋습니다.
그 후, PFA의 흔적을 제거하기 위해 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 비특이적 염색을 방지하기 위해 세포를 차단해야 합니다. 이전 단계에서 PBS 세척 후 세척을 흡인하고 차단 용액 1ml를 추가합니다.
그런 다음 약 45분 동안 실온에 그대로 두어야 합니다. 차단 용액을 기다리는 동안 권장 희석 및 차단 용액으로 희석하여 1차 항체를 준비할 수 있습니다. 이것을 섭씨 4도에서 보관하십시오.
세포가 차단 용액에 약 45분 동안 있었던 후, 스핀다운하고 이를 흡인하고 1차 항체 용액에 세포를 재현탁시킵니다. 비특이적 결합 및 백그라운드 제어를 검출하기 위해서는 하나 이상의 샘플을 negative로 유지하는 것이 가장 좋습니다. 적용된 1 차 항체가 없었으며 PBS에 단순히 소생되었습니다.
모든 샘플은 약 1시간 동안 실온에 둡니다. 원하는 경우, 고정된 세포를 1차 항체 용액에 하룻밤 동안 현탁액으로 방치하고 차단 용액으로 두 번 세척할 수 있습니다. 2차 항체 용액은 세척이 완료된 상태에서 만들 수 있습니다.
2차 항체는 일반적으로 빛에 민감하므로 가능하면 실험실 조명을 어둡게 하고 알루미늄 호일이 사용된 용기를 덮으면 형광 표백을 방지할 수 있습니다. Antifa 시약은 프로토콜에 통합될 수 있지만, 차단 용액에서 권장 농도로 희석된 1차 항체와 같은 더 높은 백그라운드를 초래할 수 있으므로 사용에 주의해야 합니다. 세척이 완료된 후 1차가 추가되었는지 여부에 관계없이 모든 샘플에 하나의 vis를 적용합니다.
항아리 안과 같은 어두운 곳에 약 한 시간 동안 그대로 두십시오. 1ml의 차단 용액으로 세포를 두 번 씻으십시오. 이제 세포는 DPI 염료로 핵 염색할 준비가 되었습니다.
DPI 해결책을 1개에서 10, PBS에 있는 000 희석에 처음에 준비하고, PBS의 1 ml에 있는 세포를 한 번 세척하고, 그 후에 resus, dpi에서 중단하고, 대략 5 10 분 동안 실내 온도에서 서 있게 하십시오. 2 차 항체와 마찬가지로 DAPI는 빛에 민감하므로 형광, 표백을 방지하기 위해 필요한 조정을하십시오. PBS 1ml로 한 번 씻고 마지막으로 reus로 씻으십시오.
1ml PBS에 다시 현탁하십시오. 그런 다음 cyto spin 장치와 함께 사용할 준비가 되어야 합니다. 최대 100마이크로리터의 단일 셀 용액을 optimize를 마이크로 피펫 팁 상단에 놓습니다.
그러나 불필요한 오버플로나 물방울을 방지하기 위해 더 적은 양을 사용하는 것이 좋습니다. 나중. cyto spin 장치와 카운터밸런스를 책상 원심분리기에 놓고 4분 동안 1000RPM으로 스핀다운합니다. 그 후, 유리 슬라이드에서 세포가 이탈할 가능성을 최소화하는 방식으로 cyto spin 장치를 조심스럽게 분해합니다.
장착하기 전에 형광 현미경 아래에서 서있는 것이 이루어졌는지 확인하십시오. 이것은 cyto spin apparatus의 SSCA 4 세포 표면 마커로 염색된 BG one V 세포의 단층을 촬영한 사진입니다. 세포가 서로 얼마나 격리되어 있어 단일 세포 관찰 및 기록이 가능한지 주목하십시오.
이 프로토콜의 좋은 점은 실현 가능하고 비용 효율적이며 줄기 세포 배양의 일상적인 분석에 쉽게 적용할 수 있는 단층 세포를 재현할 수 있다는 것입니다. 그래서 이것으로 이 비디오를 그리고 자신의 연구에 사용되는 프로토콜을 찾기를 바랍니다.
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이 기사는 인간 다분화능 줄기세포(hPSCs)의 면역세포화학적 염색을 위한 자가 제작된 cytospin 장치의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 세포의 단층을 만들어 세포 표면 마커의 관찰과 정량화를 용이하게 합니다.
Characterizing human pluripotent stem cells at single-cell resolution is critical for target validation and assay development in early discovery. This self-made cytospin method enables reproducible monolayer preparation, supporting quantitative immunocytochemical analysis of surface markers like SSEA-3/SSEA-4. The approach reduces technical variability and enhances predictive confidence in stem cell-based models used for mechanistic de-risking and lead identification.
The method integrates into early discovery workflows by enabling reliable preparation of hPSCs for immunocytochemical analysis, bridging colony-based culture and single-cell resolution assays.