Name: 자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 자수성가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 만능 줄기 세포의 면역세포화학적 분석 방법을. 단일세포층을 만들어 세포 표면 마커를 정량화하고 시각적 분석의 정확성을 높이는 비용 효율적인 기술입니다.

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이 작품에 대한 부분적인 자금은 NSF - 경력 0,744,556 (라오)와 VCU - HHMI 과학 교육 및 연구 프로그램 (파스쿠알)을 통해 장학금에 의해 제공되었다.

1 부 : 서스펜션 Immunocytochemical 스테 이닝 <ol><li> 세포는 단일 세포 현탁액에 수확하고 있습니다. </li><li> 세포는 다음 1.5 2mL microcentrifuge 튜브로 옮겨 4 분 200g에 centrifuged 있습니다. </li><li> 세포 표면에 뜨는을 aspirating에 의해 씻겨 있으며, PBS의 1mL에 다시 일시 중지 - (MG이없는 + 및 CA 2 +) 4 분 200g에서 다시 centrifuged 다음합니다. 이것은 두 번 수행되어야합니다. </li><li> 세척 후, 세포를 그 다음 10 분 동안 상온에서 1mL 4 %의 paraformaldehyde (PFA)에 다시 보류 그들에 의해 해결됩니다. </li><li> 전지는 PBS의 1mL와 함께 두 번 다시 씻어 ​​있습니다 -. </li><li> 로 세척, 블록 전지 후 다시 정지 차단 솔루션 1mL (6 % serum/94 % PBS -)에 있습니다. 45 분 동안 실온에서 이들을 품어. </li><li> 후, 4 분 200g에 튜브를 원심 분리기 및 차단 솔루션을 대기음. 기본 항체 용액 (권장 희석에서 차단 솔루션으로 만들어진)의 1mL의 세포를 다시 일시 중지합니다. 세포 중 1 시간 또는 4 ° C 하룻밤 다음 단계를 진행하기 전에 실온에서 incubated 수 있습니다. </li><li> 전지는 다음 블록 솔루션 1mL로 두 번 씻어 있습니다. </li><li> 차 항체 용액 (권장 희석에서 차단 솔루션을 만든)과 1 시간 동안 실온에서 품어의 1mL에 다시 정지 세포, 후. </li><li> 일시간 후, 세포를 그 다음 블록 솔루션 1mL와 함께 두 번 다시 세탁해야합니다. </li><li> 차단 솔루션과 함께 세척 후, PBS의 1mL로 다시 세포를 씻어 -. </li><li> 다양한 세척 후의 1mL의 세포를 다시 중단 DAPI 핵 얼룩 (PBS에서 DAPI의 1:10,000 희석 -) 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 5 분 후에, 4 분 200g에 튜브를 원심 분리기. - PBS의 1mL의 DAPI 핵 얼룩 솔루션과 다시 중단 세포를 대기음. </li></ol> 2 부 : cytospin 장치를 통해 생성된 슬라이드의 hPSCs의 설립 <ol><li> 플라스틱 슬라이드는 드릴 프레스와 그들의 구멍에서 원하는 금액을하여 준비가되어 있습니다. 직경 사용할 micropipette 팁 (들)의 넓은 직경보다 가장 큰 1mm에서해야합니다. </li><li> 필터 페이퍼는 가위로 플라스틱 슬라이드의 매개 변수로 절단됩니다. </li><li> 구멍은 다음 여과지에 만들어집니다. 구멍의 크기 (들) micropipette 팁 (S)는 그것을 통해 snuggly 맞는 충분히 커야합니다. </li><li> 후 준비 플라스틱 슬라이드 중 하나는 상단과 컷 필터 용지 (그림 1)의 하단에 위치에있는 유리 슬라이드에 배치됩니다. 레이어는 테이프로 안전하고 있습니다. </li><li> 파트 1에서 스테인드 세포 현탁액의 100μL의 최대 (원하는 monolayer 밀도에 따라 다름) 다음 micropipette 팁 (들)의 상단에 배치됩니다. </li><li> 필요한 경우, 셀 솔루션기구는 무게와 유사한 체중의 카운터 - 균형을 만들 수 있습니다. </li><li> cytospin 장치 및 카운터 - 균형은 다음 바탕 화면 원심 분리기에 배치 4 분 200g에 centrifuged 아르 수 있습니다. </li><li> 원심 분리 후, cytospin 장치는 신중하게 유리 슬라이드에서 세포를 이동시키다 나던 방법으로 분해됩니다. </li><li> 필요한 경우, 초과 주변 PBS - 유리쪽에에 밖으로 aspirated. </li><li> 세포는 다음 원하는 세포 monolayer가 달성되었는지 확인하기 위해 형광 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 슬라이드 마운트 <ol><li> 원하는 설치 미디어의 방울이 세포를 포함하는 각 지역의 중심에 직접 저장됩니다. </li><li> 후 커버 슬립이 부드럽게 가능한 경우 기포를 피하려고 슬라이드로 저하됩니다. </li><li> 초과 설치 미디어는 다음 슬라이드에서 제거됩니다. </li><li> 후, 커버 전표의 측면​​은 손톱 바니와 함께 봉인하고 있습니다. </li><li> 결과가 관찰하고 설명하는 때까지 슬라이드는 어두운 저장 영역에 보관하실 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리 연구소의 목적을 위해, 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 성장 줄기 세포 문화 35mm 요리가 cytospin 장치와 함께 사용하기위한 immunocytochemical 얼룩 절차에 할당된 것입니다. 세포는 다음 단일 세포 현탁액에, 가능한 한 MEF 층의 제거, passaging 효소에 의해 수집됩니다. MEF 계층에서 더 효과적으로 줄기 세포 격리가 필요한 경우, 식민지를 수동으로 정지에 소화 다음 포착 수 있습니다. 피더 무료 조건은 줄기 세포의 문화를 성장에서 사용하는 경우, 식민지 단순히 긁어 냈 및 정지로 소화 수 있습니다. 초기 단일 세포 현탁액 이상적이지만, 모든 세포 대단히 짧은 시간은 효과적으로 immunocytochemical 얼룩 프로 시저에 대한 호출 수많은 세탁 다시 정지 단계에 걸쳐 분해해야합니다. 동영상은 얼룩의 hPSCs에 대한 세포 마커의 사용에 초점을 맞추었습니다. hPSCs의 세포내 얼룩이 원하는 경우, 차단 솔루션의 추가하기 ...

<table><tbody><tr><td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>재사용 플라스틱 슬라이드용 재료</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10&amp;mu;L 필터 팁</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>마운팅 매질</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>SSEA-4 염색용 1차 항체</td></tr><tr><td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>SSEA-3 염색용 1차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>SSEA-4 염색용 2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>SSEA-3 염색용 2차 항체</td></tr><tr><td>DAPI, Dihydrochloride</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

자수 성 가한 cytospin 장치를 사용하여 인간 pluripotent 줄기 세포의 immunocytochemical 분석

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함 인간 pluripotent 줄기 세포 (hPSCs)은 무한한 자기 갱신 기능 및 여러 세포 유형으로 구별하기 위해 잠재적으로 인해 흥미로운 셀 소스입니다. hPSCs의 pluripotent 상태는 일반적 qPCR, immunocytochemistry 같은 방법으로 평가, 그리고 기타로<em&gt; 체외에서</em&gt;과<em&gt; 생체내에</em여러 세포 유형으로&gt; 차별화 전략. 이러한 가운데, immunocytochemical 기법 후보 세포 및 세포 - 표면 생체 분석을 바탕으로 hPSCs의 undifferentiated 상태를 일상적인 특성화를 위해 개발되었습니다. 식민지 문제는 일상적인 기준으로 개별 세포 수준에서 이러한 마커의 표현을 quantifying의 발생으로 hPSCs 성장했다는 사실 감안할 때. 유동세포계측법 분석이 문제를 해결하지만, 필요 셀 번호 및 hPSC 문화의 일상적인 품질 관리 평가 정상적으로 도움이되는 없습니다 시약의 사용에 제공하고 있습니다. 따라서, 마커 평가에 대한 보존 무결성과 monolayer 세포 샘플을 만드는 실용적이고 재현할 방법의 개발은 줄기 세포 연구에 많은 장점이 있습니다. monolayer에서 개별 세포를 쉽게 관찰 및 특정 마커의 표현에 대한 계량 수 있기 때문에 이것은 크게 immunocytochemical 분석 혜택을 제공합니다. 이 목표는 자수 성 가한 cytospin 장치가 건설되었으며 immunocytochemical 얼룩와 함께 사용하기위한 최적화된. 두 세포 표면 마커 (SSEA3/SSEA4) 표현이 프로토콜의 목적을 위해 변형 BG01의 줄기 세포 라인에서 분석했다.

세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.

자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석

인간 배아줄기세포(hESCs)와 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)를 포함하는 인간 만능줄기세포(hPSCs)는 흥미로운 세포...

안녕하세요, 저는 버지니아 커먼웰스 대학교 화학 및 생명과학과의 줄기세포 공학 연구실 학생인 Rick Pasqua입니다. 본 영상에서는 세포 표면 마커의 정량화를 위해 관찰 가능한 인간 다능성 줄기세포의 단층을 형성하는 저비용의 자제 제작 STO 스핀 장치 사용법을 시연하겠습니다. 많은 면역화학 프로토콜이 챔버 슬라이드에서 콜로니 형태로 배양된 hPSC에 맞춰 조정되어 있기 때문에, 개별 세포 수준에서 바이오마커의 발현을 특성화하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다.세포를 단층으로 형성하면 시각적 분석뿐만 아니라 발현량 정량화에도 도움이 될 수 있습니다. 저희 연구실에서 사용하는 시누스 스핀 장치(sinus spin apparatus)는 대부분의 실험실에서 흔히 볼 수 있는 재료로 제작할 수 있으며, 적은 양의 세포 샘플만 필요로 하고 특정 시약이 전혀 필요하지 않습니다. 더욱 중요한 점은, 관찰을 위해 단일 세포들을 안정적으로 넓게 퍼뜨려 재현할 수 있다는 것입니다. 다음은 사이토신 장치를 제작하는 데 필요한 준비물입니다.플라스틱 슬라이드는 반드시 깨끗할 필요가 없으므로, 원하신다면 사용한 챔버 슬라이드를 사용하셔도 됩니다. 사전 세척된 유리 슬라이드는 반드시 세척해야 하는데, 이곳에 세포 단일층이 형성되기 때문입니다.종류에 상관없는 여과지와 마이크로 파이펫 팁을 준비합니다. 저희 실험실에서는 제작을 시작하기 전 1~10 µL 팁을 사용합니다. 먼저 플라스틱 슬라이드에 구멍을 뚫어야 합니다.이 작업은 드릴 프레스를 사용하여 수행할 수 있습니다. 구멍의 직경은 마이크로 파이펫 팁의 크기에 따라 달라지며, 표준 1-10 µL 마이크로 파이펫 팁의 경우 팁의 가장 넓은 부분의 너비와 비슷해야 합니다. 이는 약 7 mm 정도여야 합니다.플라스틱 슬라이드에 만드는 구멍의 수는 사용 목적에 따라 완전히 달라집니다. 예를 들어, 본 실험실의 면역화학 염색의 경우, 일반적으로 양성 염색용과 음성 배경 대조군용으로 각각 하나씩, 총 두 개의 구멍을 사용합니다. 이러한 슬라이드는 횟수 제한 없이 재사용할 수 있습니다.거름종이의 경우, 플라스틱 슬라이드의 규격에 맞게 조각을 잘라냅니다. 슬라이드의 구멍을 기준으로 거름종이에 구멍을 뚫습니다. 거름종이에 뚫린 구멍의 크기는 여기에 표시된 것처럼 마이크로 피펫 팁이 딱 맞게 들어갈 수 있을 정도로 충분히 커야 합니다.그 다음, 각 구멍에 하나씩 사용할 수 있도록 마이크로 피펫 팁을 약

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Immunocytochemistry은 존재, subcellular 지방화 및 교양 세포에 대한 관심의 항원의 상대적인 풍부를 결정하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 선물 쉬운 따라 하나가 항체를 절약 하나의 얼룩을 최대한 활용 수있게 단계 시리즈.

Immunocytochemistry : 인간 신경 줄기 세포

정지 성장 Pluripotent 줄기 세포가 embryoid기구 (EBS)에 구별. 집합체로 조직을 보존하면서 여기에서 우리는 embryogenesis의 세포 및 분자 측면을 연구하는 데 유용 고품질 EB의 cryosections를 얻는 방법을 보여줍니다.

Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 프로토콜은 추가적인 외인성 보충 또는 hPSC 특이적 합성 하층(hPSC) 없이 젤라틴으로 코팅된 접시에 담긴 인간 태반에서 유래한 조건화된 배지만을 사용하여 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 증식시키는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

유도만능줄기세포(iPSC)의 유지를 확인하기 위한 정기적인 특성화는 이러한 세포가 다른 응용 분야에 사용되기 전에 중요한 단계입니다. 여기에서는 면역세포화학을 통해 쉽고 일상적인 특성 분석을 가능하게 하도록 특별히 설계된 인간 iPSC의 소규모 증식 방법에 대해 설명합니다.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산...

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기서는 자동화된 세포 배양 시스템을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 자동 배양 시스템은 iPS 세포의 유지에서 다양한 유형의 세포로의 분화에 이르기까지 유도만능줄기세포(iPS) 세포 취급에 익숙하지 않은 연구자를 포함하여 노동력을 줄이고 사용자에게 이점을 제공합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

배우세요 자수성가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 만능 줄기 세포의 면역세포화학적 분석 방법을. 단일세포층을 만들어 세포 표면 마커를 정량화하고 시각적 분석의 정확성을 높이는 비용 효율적인 기술입니다.

자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석

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