자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석

안녕하세요, 저는 버지니아 커먼웰스 대학교 화학 및 생명과학과의 줄기세포 공학 연구실 학생인 Rick Pasqua입니다. 본 영상에서는 세포 표면 마커의 정량화를 위해 관찰 가능한 인간 다능성 줄기세포의 단층을 형성하는 저비용의 자제 제작 STO 스핀 장치 사용법을 시연하겠습니다. 많은 면역화학 프로토콜이 챔버 슬라이드에서 콜로니 형태로 배양된 hPSC에 맞춰 조정되어 있기 때문에, 개별 세포 수준에서 바이오마커의 발현을 특성화하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다.

세포를 단층으로 형성하면 시각적 분석뿐만 아니라 발현량 정량화에도 도움이 될 수 있습니다. 저희 연구실에서 사용하는 시누스 스핀 장치(sinus spin apparatus)는 대부분의 실험실에서 흔히 볼 수 있는 재료로 제작할 수 있으며, 적은 양의 세포 샘플만 필요로 하고 특정 시약이 전혀 필요하지 않습니다. 더욱 중요한 점은, 관찰을 위해 단일 세포들을 안정적으로 넓게 퍼뜨려 재현할 수 있다는 것입니다. 다음은 사이토신 장치를 제작하는 데 필요한 준비물입니다.

플라스틱 슬라이드는 반드시 깨끗할 필요가 없으므로, 원하신다면 사용한 챔버 슬라이드를 사용하셔도 됩니다. 사전 세척된 유리 슬라이드는 반드시 세척해야 하는데, 이곳에 세포 단일층이 형성되기 때문입니다.

종류에 상관없는 여과지와 마이크로 파이펫 팁을 준비합니다. 저희 실험실에서는 제작을 시작하기 전 1~10 µL 팁을 사용합니다. 먼저 플라스틱 슬라이드에 구멍을 뚫어야 합니다.

이 작업은 드릴 프레스를 사용하여 수행할 수 있습니다. 구멍의 직경은 마이크로 파이펫 팁의 크기에 따라 달라지며, 표준 1-10 µL 마이크로 파이펫 팁의 경우 팁의 가장 넓은 부분의 너비와 비슷해야 합니다. 이는 약 7 mm 정도여야 합니다.

플라스틱 슬라이드에 만드는 구멍의 수는 사용 목적에 따라 완전히 달라집니다. 예를 들어, 본 실험실의 면역화학 염색의 경우, 일반적으로 양성 염색용과 음성 배경 대조군용으로 각각 하나씩, 총 두 개의 구멍을 사용합니다. 이러한 슬라이드는 횟수 제한 없이 재사용할 수 있습니다.

거름종이의 경우, 플라스틱 슬라이드의 규격에 맞게 조각을 잘라냅니다. 슬라이드의 구멍을 기준으로 거름종이에 구멍을 뚫습니다. 거름종이에 뚫린 구멍의 크기는 여기에 표시된 것처럼 마이크로 피펫 팁이 딱 맞게 들어갈 수 있을 정도로 충분히 커야 합니다.

그 다음, 각 구멍에 하나씩 사용할 수 있도록 마이크로 피펫 팁을 약 절반 길이로 적절한 개수만큼 자릅니다. 이것은 세포 단일층이 형성될 유리 슬라이드의 지지대 역할을 하게 됩니다. 그다음, 그 위에 거름종이를 올립니다.

거름종이는 현탁 염색 과정에서 발생하는 과잉 배지를 흡수하는 역할을 합니다. 그 위에 플라스틱 슬라이드를 덮어 장치의 견고한 지지대로 사용합니다. 이후 일반 가정용 테이프를 사용하여 네 면을 모두 밀봉합니다.

마지막으로, 장치의 절단된 팁 부분에 마이크로피펫 팁 전체를 삽입합니다. 이곳은 현탁 염색 후 세포 샘플이 배치될 위치입니다. 또한, 나중에 더 쉽게 식별할 수 있도록 유리 슬라이드의 어느 부분에 절단된 팁이 있는지 미리 표시해 두는 것이 도움이 될 수 있습니다.

본 실험실에서 사용하는 면역화학적 현탁 염색 프로토콜은 먼저 줄기세포를 단일 세포 현탁액으로 수확하는 과정을 포함하며, 이는 보통 trypsin을 이용한 효소 처리 또는 비효소성 EDTA 기반 세포 해리 버퍼를 사용하여 수행됩니다. 그 후 세포를 1 mL 또는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 표준 배양 배지와 함께 옮깁니다. 이를 200 Gs에서 4분 동안 원심분리합니다.

이후의 모든 세척 및 원심분리 단계에서는 동일한 원심분리 속도를 사용합니다. 그런 다음 배지를 수동으로 흡입하여 제거하는데, 이때 세포 펠렛이 손상되지 않도록 주의해서 흡입하십시오. 이어서 1 ml의 PBS로 두 번 세척하며, 매회 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.

다음 단계는 4% 파라포름알데히드(formaldehyde) 또는 PFA를 사용하여 세포를 고정하는 것이며, 이에 필요한 시약은 이 용액을 제조하는 데 필요하거나 본 영상의 부수 설명서에 기재되어 있습니다. 세포를 4% 파라포름알데히드 용액에 넣어 상온에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계는 세포외 현탁액 준비 및 사이토스핀(cytospin) 장치를 이용한 염색 전에 수행하는 것을 권장합니다.

그 후, PFA의 잔여물을 제거하기 위해 세포를 PBS로 두 번 세척합니다. 그런 다음 비특이적 염색을 방지하기 위해 세포를 블로킹해야 합니다. 이전 단계의 PBS 세척 후, 세척액을 흡입하여 제거하고 블로킹 용액 1 ml를 첨가합니다.

그런 다음 이를 실온에서 약 45분 동안 유지합니다. 블로킹 용액이 처리되는 동안, 1차 항체를 권장 희석 배수로 블로킹 용액에 희석하여 준비할 수 있습니다. 이를 4°C에서 보관하십시오.

세포를 블로킹 용액에 약 45분 동안 둔 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고 1차 항체 용액에 다시 현탁합니다. 비특이적 결합 및 배경 대조군을 검출하기 위해, 적어도 하나의 샘플은 음성 대조군으로 유지하는 것이 좋습니다. 음성 대조군은 1차 항체를 처리하지 않고 단순히 PBS에 다시 현탁한 샘플입니다.

모든 샘플을 실온에서 약 1시간 동안 둡니다. 필요한 경우, 고정된 세포를 1차 항체 용액 내 현탁 상태로 하룻밤 동안 두고 블로킹 용액으로 두 번 세척할 수 있습니다. 세척하는 동안 2차 항체 용액을 준비할 수 있습니다.

2차 항체는 대개 빛에 민감하므로, 가능하면 실험실 조명을 낮추고 사용하는 모든 용기를 알루미늄 호일로 감싸야 하며, 이는 형광 퇴색을 방지하기 위한 조치입니다. Antifa 시약을 프로토콜에 포함할 수 있으나, 블로킹 용액에 권장 농도로 희석된 1차 항체와 마찬가지로 배경 신호가 높아질 수 있으므로 사용 시 주의가 필요합니다. 세척이 완료된 후, 1차 항체 첨가 여부와 관계없이 모든 시료에 vis를 적용하십시오.

이를 병 내부와 같이 어두운 곳에 약 한 시간 동안 둡니다. 1 ml의 블로킹 용액으로 세포를 두 번 세척합니다. 이제 세포는 DPI 염료를 이용한 핵 염색 준비가 완료되었습니다.

먼저 PBS에서 DPI 용액을 1:10,000 비율로 희석하여 준비하고, 세포를 1 ml의 PBS로 한 번 세척한 다음, DPI 용액에 다시 현탁하여 실온에서 약 5~10분 동안 방치합니다. 2차 항체와 마찬가지로 DAPI는 빛에 민감하므로, 형광 퇴색을 방지하기 위해 필요한 조치를 취하십시오. 1 ml의 PBS로 한 번 세척한 후, 마지막으로 다시 현탁합니다.

1 ml PBS에 다시 현탁합니다. 이렇게 하면 사이토스핀(cyto spin) 장치에서 사용할 준비가 됩니다. 단일 세포 용액을 최대 100 µL까지 마이크로 피펫 팁 상단에 넣습니다.

불필요한 넘침이나 흘러내림을 방지하기 위해 더 적은 양을 사용하는 것이 권장됩니다. 그 후, 사이토스핀 장치와 균형추를 벤치탑 원심분리기에 넣고 1000 RPM에서 4분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드에서 세포가 이탈할 가능성을 최소화하는 방식으로 사이토스핀 장치를 조심스럽게 분해하십시오.

마운팅 전 형광 현미경을 통해 세포가 안착되었는지 확인하십시오. 이 사진들은 cyto spin 장치를 통해 SSCA 4 세포 표면 마커로 염색된 BG 1 V 세포 단층을 촬영한 것입니다. 세포들이 서로 얼마나 잘 분리되어 있어, 단일 세포 관찰 및 기록이 가능한지 확인하십시오.

이 프로토콜의 장점은 실행 가능하고 비용 효율적이며, 줄기세포 배양의 모든 일상적인 분석에 쉽게 적용할 수 있는 세포 단층을 재현할 수 있다는 점입니다. 따라서 이 영상이 도움이 되었기를 바라며, 여러분의 연구에서도 이 프로토콜을 유용하게 활용하시길 바랍니다.