만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

본 실험 절차의 전반적인 목표는 만성 살모넬라 감염 마우스 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 우선 살모넬라 용액을 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 마우스에게 스트렙토마이신을 가바주(gavage)한 후 살모넬라를 투여하거나, 스트렙토마이신만 단독으로 투여하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 생쥐의 분변에서 salmonella를 분리하고, BL chroma 플레이트를 사용하여 생쥐 장 내의 salmonella 감염을 검출하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 생쥐의 체질량을 관찰 및 기록하고, salmonella 감염 후 활성도의 변화를 확인하는 것입니다. 최종적으로, salmonella를 경구 투여한 생쥐의 장 내에 salmonella 감염이 형성될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 로체스터 대학교 의과대학 Johnson 박사님 연구실의 Michelle P입니다. 저는 Sun Lab 소속이며, 여기 Sun Lab의 Y님과 함께합니다. 오늘은 Alytic Lennar 감염 질량 모델을 구축하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 연구실에서는 숙주-박테리아 상호작용 신호 전달 및 종양 발생을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 실험 전, 각 살모넬라 균주에 대해 실험 전체 과정에서 사용할 충분한 양의 Luria-Bertani 또는 LB 배지 플레이트를 준비하십시오.

플레이트는 냉장 보관하여 수개월 동안 저장할 수 있습니다. 다음으로, 살모넬라 배양액을 준비합니다. -80 °C에서 냉동 보관된 살모넬라 stock 바이알을 꺼내어, 살모넬라를 플레이트에 도말할 수 있도록 실험대 위에서 해동합니다.

분젠 버너로 백금이를 가열한 후 해동된 박테리아 스톡에 담급니다. LB 플레이트의 상단 3분의 1 영역에 백금이를 지그재그 모양으로 획선 도말합니다. 백금이를 다시 화염 멸균하고 플레이트를 회전시킵니다.

루프를 지그재그로 움직여 이전 도말선을 가로지르며 플레이트의 두 번째 3분의 1 영역에 박테리아를 도말합니다. 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 루프를 다시 화염 멸균합니다.

루프가 한천(agar) 내부로 파고들지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 보관하여 콜로니를 배양합니다. 올바르게 수행되었다면, salmonella 플레이트의 최소 한 구역에서는 개별 콜로니가 형성되어야 합니다.

다음 날, 멸균된 이쑤시개나 박테리아 루프를 사용하여 LB 플레이트에서 클론을 선택하고 12 mL 튜브에 담긴 7 mL의 LB 배지에 접종합니다. 튜브를 37 °C에서 약 5시간 동안 흔들어 배양합니다.

이 배양액 0.05 milliliters를 사용하여 Falcon 튜브에 담긴 50 milliliters의 LB에 접종하십시오. 37 °C에서 약 18시간 동안 흔들지 않고 배양하십시오.

50 mL의 박테리아 하룻밤 배양액을 상온에서 5,000 RPM으로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 다음으로, 튜브에 1.5 mL의 Hank's buffered salt solution(HBSS)을 가하여 박테리아를 재부유시키거나, LB와 HBSS를 100:3 비율로 혼합합니다. 그 후 HBSS를 사용하여 총 부피를 15 mL로 맞추거나, LB와 HBSS를 1:10 비율로 혼합합니다.

각 마우스에는 100 µL의 희석된 살모넬라 배양액, 즉 1 × 10⁶에서 1 × 10⁸ CFU가 필요하며, 실험 시작 4시간 전에 마우스의 물과 사료 공급을 중단합니다. 그런 다음, 7.5 mg의 스트렙토마이신 분말을 100 µL의 HBSS에 희석하여 가바지(gavage) 직전에 스트렙토마이신 용액을 준비합니다. 주입할 마우스마다 가바지 과정에서 발생할 수 있는 손실분을 고려하여 여유분의 용량을 준비하십시오.

먼저, feeding needle에 streptomycin 용액 100 µL를 준비합니다. 가바지(gavage)를 실시하기 위해 케이지에서 첫 번째 마우스를 꺼내 벤치 상단을 향하게 잡습니다. 엄지와 중지로 마우스 어깨 위의 피부를 단단히 잡고, 검지로 머리와 목을 늘려 식도를 일직선으로 만듭니다.

피딩 니들의 볼 팁을 입천장을 따라 인후 뒷부분의 오른쪽 방향으로 유도합니다. 그런 다음 식도로 조심스럽게 통과시켜 100 µL의 streptomycin 용액을 주입합니다. 이때 저항감이 느껴지지 않아야 합니다.

실험군과 대조군의 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. streptomycin 및 gavage 투여 후 약 20시간이 지나고 salmonella gavage 투여 4시간 전에, 경구로 salmonella gavage를 투여받을 마우스의 물과 사료를 제거합니다. HBSS에 희석된 100 µL의 salmonella 용액을 사용하여 이전과 동일한 방식으로 각 마우스에 gavage를 실시합니다.

경구 투여 후, 각 마우스를 새 케이지로 옮겨 분변 수집을 시작합니다. 투여 후 약 8시간부터, 분변이 배출되는 즉시 케이지에서 제거합니다. 실험 시료로 사용할 마우스 분변 100 mg을 수집합니다.

분변 살모넬라 분석을 위해 연구 기간에 따라 매일 또는 매주 샘플을 수집하십시오. 분변 샘플을 1 mL의 PBS가 들어있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 격렬하게 볼텍싱한 후 800 RPM에서 10분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮겨 6,000 RPM에서 5분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 제거하고 200 µL의 PBS를 펠렛에 추가한 후, 볼텍스하여 재현탁합니다. 다음으로, BB l roag 플레이트를 사용하여 살모넬라를 검출합니다. 플레이트당 10~100 µL의 분변 용액을 사용하며, 섹션 2에 표시된 대로 플레이트에 도말합니다.

선택된 발색제 존재 하에서 대사 차이로 인해 살모넬라 종은 적갈색으로 나타납니다. 플레이트 위의 살모넬라 콜로니 수를 측정하여 개별 마우스 간의 감염 수준을 비교하십시오. 본 실험 절차에서는 6~7주령의 특정 병원균 없는(SPF) 암컷 C 57 black six 마우스를 사용하였습니다.

마우스를 salmonella와 streptomycin 및 HBSS로 감염시켰습니다. 대조군 마우스에는 streptomycin만 투여하였습니다. 사용된 salmonella 균주는 salmonella typhimurium 야생형 균주 A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, 비병원성 salmonella 돌연변이 균주, 그리고 low copy 플라스미드인 PSKW 29에 병원성과 관련된 AAV R age 유전자를 포함하는 Dr. James Madera 실험실의 세 가지 FPC 균주입니다. 이 프로토콜을 사용하여 마우스 장 내의 salmonella tyrian 군락 형성을 검출할 수 있습니다.

만성 살모넬라 감염은 분변 분석을 통해 측정되었으며, 면역형광 염색을 위해 체중 및 장 조직 샘플을 수집하였습니다. 일반적으로 감염 후 4주 이내에 체중 감소와 사망이 발생합니다. 여기에는 감염 후 4주 시점의 생존율이 표시되어 있습니다.

감염 후 4주 동안 생존한 마우스는 이후 23주 동안 체중이 증가하고 사망률이 감소합니다. 전반적으로 salmonella 균주 FSY fsy, A VRA null 또는 fsy. A VRA 이형접합체에 감염된 마우스의 65% 이상이 장내에 지속적인 salmonella 감염이 있는 상태로 6개월 이상 생존할 수 있습니다.

급성 감염 이후에도 생존 개체들은 여전히 살모넬라를 보유하고 있었으며, 이는 본 프로토콜에 기술된 방법을 사용하여 감염 6개월 후에 검출될 수 있었습니다. 마우스 장 조직 샘플의 면역형광 분석 결과, 감염 27주 후에 장 점막으로 살모넬라가 침입한 것이 확인되었습니다. 이 이미지에서 핵은 파란색으로 염색되었으며, 살모넬라 감염 부위는 녹색으로 표시되었습니다.

대조군에서 나타나듯이 밝은 녹색 염색이 관찰되지 않으며, 이는 살모넬라 균집 형성(colonization)이 일어나지 않았음을 나타냅니다. 반면, 감염 후 27주가 경과한 살모넬라 감염 쥐의 장점막에서는 밝은 녹색 염색이 관찰됩니다. 이는 streptomycin으로 전처치한 쥐에서 살모넬라 감염이 지속됨을 보여줍니다.

지금까지 마우스 모델에서 일부의 만성 감염을 유도하는 방법을 보여드렸습니다. 이 실험 절차를 수행할 때, 접종을 위해 배양물을 신선하게 준비하고, 올바른 접종 기술을 구사하며, 실험 모델이 제대로 작동하고 있는지 확인하기 위해 ANA의 존재를 검출하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.