Name: 의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis thaliana의 꽃봉오리 침지법을 이용한 유전자 변형 기술과 pTSO2::GUS 리포터 유전자 발현 검출 방법을. 이 기술은 식물 유전 공학 및 생명공학 연구에 활용됩니다.

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도움이 의견을 거스 - 절대 안전한 프로토콜 Paja Sijacic과 코트니 Hollender를 공유하기위한 거스와 그림 1, Detlef 위겔의 사진을 : 우리는 pTSO2 구축을위한 Chunxin 왕 감사합니다. Z. L S 실험실에서 연구는 미국 국립 과학 재단 (IOB0616096 및 MCB0744752)에 의해 지원됩니다. ZL는 부분적으로 메릴랜드 농업 실험 역 대학에 의해 지원됩니다.

I. 꽃 - 물놀이 Arabidopsis thaliana의 변화 <ol><li> 이전 변환에 약 1 개월, 냄비에 약 10-15 식물 4-8 냄비 (5 인치 사각형 냄비)에 Arabidopsis 씨를 뿌리다. 정상 다산과 식물, 플라스미드 구조마다 식물의 4 냄비는 충분합니다. 하나는 감소 다산과 돌연변이 Arabidopsis를 변환하는 경우, 그에 따라 냄비의 수를 증가시킵니다. </li><li> 식물은 표준 약관 (22 16 시간 조명과 어두운 8 시간 ° C)에서 재배하고 있습니다. 식물은 짧은 하루 더 낮은 온도 하에서 재배하는 경우, 그들은 변화를 위해 준비하는 꽃 이상으로 오래 걸립니다. 좋은 식물 관리는 성공적인 변화를위한 필수적인 건강한 식물을 보장합니다. </li><li> 식물은 나올와 꽃으로 시작하는 경우. 그들은 지금 변화를위한 준비가되어 있습니다. 변환 효율을 향상시키기 위해, 3-4일 변환하기 전에, 곧 그들은 더 많은 보조 촬영 형성을 장려하기 위해 나올 필요로 메인 꽃이 핌 골인을 잘라. 식물 변환 전날 물. 이것은 토양이 꽃의 수영하는 동안 너무 많이 침투 미디어를 흡수하지 않을 보장합니다. </li><li> Agrobacterium tumefaciens 변형 GV3101은 pTSO2를 들고와 (거스, 50 μg / ML Kanamycin : pTSO2의 경우) : 이틀 전에 변환하기 위해, 적절한 항생제를 포함한 40ml LB의 예방 : 거스는 건설. pTSO2 : : 거스는 Kanamycin 3 저항을 수여 NPTII 유전자를 가지고 pBIN20 벡터에 복제됩니다. 28-30 ° C.에 떨고 배양기에서 하룻밤 성장 </li><li> 그 다음날, 50 μg / ML Kanamycin이 포함된 LB의 400ml에 밤새 문화의 전송 8ml. 28-30 ° C.에 떨고 배양기에서 하룻밤 성장 </li><li> 변화의 날, Agrobacterium 문화의 OD 600 약 0.8 (0.5 to1 사이 OD 600 허용된다)에 도달하면, 5000rpm 8 분에서 Agrobacterium 야간 문화를 스핀 다운. </li><li> 침투 미디어 1 L에있는 Agrobacterium 펠렛을 (리터) (10mM MgCl 2, 5 %의 자당, 0.44mM 6 benzyladenine (BA), 0.3 % silwet L - 77, 1X Gamborg의 비타민 솔루션과 autoclaved 물). Resuspend 매체 autoclaved해야하지만 신선한 만들 필요하지 않습니다. 접시 (예 : 8로 "x15"X2 "Pyrex 유리 접시)에 1 L Agrobacterium 함유 침투 매체를 붓고. </li><li> 냄비 반전 (식물에서 떨어지지 않을 것이란)와 침투 솔루션에 식물의 모든 공중 부분을 찍어, 한 번에 한 오분 냄비 기다. 공장의 모든 항공 부분이 침투 매체에 열중하는 동안, 토양은 토양에 곰팡이 성장의 기회를 줄이기 위해 침투 미디어 중 하나를 흠뻑 젖어셔서 마십시오. </li><li> 마른 후, 트레이에 종이 타월의 여러 레이어에서 자신의 측면에서 모든 담근 판돈을 놓으십시오. 종이 타올은 침투 미디어의 접근 금액을 만끽해보세요. 높은 습도를 보장하기 위해 플라스틱 포장으로 트레이를 다룹니다. 식물 성장 챔버에 트레이를 놓습니다. </li><li> 다음날, 똑바로 플라스틱 랩, 종이​​ 수건, 장소의 냄비를 제거합니다. 4-5 더 많은 일 동안이 식물을 물을 마십시오. 이후, 그들은 씨앗을 설정할 때까지 정상적으로 식물을 유지하고 대량의 종자를 수집합니다. </li><li> 4g의 멋진 한천, 압력솥, 그리고 추가 1M NaOH와 5.8-500 ML의 물, 산도에 용해, MS 매체가 50 μg / ML Kanamycin (중량 2.2g Murashige가 포함된 비타민없이 기초 소금을 Skoog와 함께 접시 (150x15mm 페트리 접시)을 부어 ) 50 μg / ML 최종 농도 Kanamycin를 추가합니다. 번호판이 필요 ° C까지 4 보관됩니다. </li><li> 항생제 - 내성 유전자 변형 식물을 선택하기 위해, 하나는 최소한 20,000 씨앗을 화면으로 필요합니다. 0.1 그램은 약 5,000 씨앗입니다. 무게와 씨앗의 양을 예상됩니다. </li><li> 30 초 동안 70 %의 에탄올과 15 ML 팰컨 튜브를 세척하여 씨를 소독. 한번 무균 물로 씨앗을 씻으십시오. 가게에서 구입 5 % 표백제 (Clorox)의 1시 10분 희석이 들어있는 용액에 30 초 동안 씨앗을 만끽해보세요. 멸균 물 3-6 시간을 씨를 린스. 무균 후드, 각 MS (Kanamycin) 플레이트에 피펫 5000에 대한 씨앗은 오염을 피하기 위해 Micropore 3M ​​테이프로 번호판을 봉인, 접시에 균일하게 씨앗을 확산. </li><li> 4 번호판을 품어 ° C 3-4 일 동안 어둠 속에서, 다음 챔버 (같은 식물 성장 챔버 수)에 접시를 전송합니다. 약 14 일 후, 유전자 변형 모종 녹색 유지하지만 이외의 유전자 변형 것들은 창백 돌려 죽어 가고 있습니다. 둔화가 매체에서 뿌리를 철수하고 토양에서 그들을 배치하여 토양에 유전자 변형 묘목을 전송합니다. </li></ol> II. pTSO2을 검토 : : 거스 표현 패턴 <ol><li> 수확 pTSO2 : 거스 형질 전환 모종 및 유리 섬광 약병이나 microfuge 튜브의 감기 90 % 아세톤에 배치그것은 얼음에 보관됩니다. 한 샘플의 큰 숫자를 분석하는 경우 폴리스티렌 microtiter 플레이트 (안 폴리 프로필렌)도 사용할 수 있습니다. </li><li> 모든 샘플이 채취 후 20 분 상온에서 튜브를 놓으십시오. 이 시간 동안 X - Gluc (0.2 % 트리톤 X - 100, 50mM NaHPO 4 버퍼 pH7.2, 2mM 칼륨 Ferrocyanide, 2mM의 칼륨 Ferricyanide)와 얼음에 장소없이 신선한 얼룩 버퍼를합니다. </li><li> 샘플에서 아세톤을 제거하고 얼룩 버퍼를 추가합니다. </li><li> X - Gluc 얼룩 솔루션 (0.2 % 트리톤 X - 100, 50mM NaHPO 4 버퍼 pH7.2, 2mM의 칼륨 Ferrocyanide, 2mM의 칼륨 Ferricyanide, 2mM X - gluc)를 구성합니다. 샘플에서 얼룩 버퍼를 제거하고 샘플을 X - Gluc을 포함하고있는 얼룩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 15-20분위한 진공 아래 샘플을 침투. 천천히 진공을 해제하고 모든 샘플이 얼룩 솔루션의 표면 아래 싱크되었는지 확인합니다. 필요한 경우 진공이 릴리스되면 모든 샘플 싱크까지 침투를 반복합니다. </li><li> 37 품어 샘플 ° C X - Gluc와 얼룩 버퍼에 하룻밤. </li><li> 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 얼룩 버퍼를 제거합니다. 삼십분마다 변경 상온에서 (20 %, 35 % 및 50 % 에탄올) 연속 에탄올 시리즈의 샘플을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 30 분 FAA 정착액 (50 % 에탄올, 5 % 포름 알데히드 10 % 초산, 나머지 물)에 조직을 수정. FAA를 제거하고 70 % 에탄올을 추가합니다. 이 시점에서 조직은 시각 수 있으며 디지털 카메라가 장착된 해부 현미경 사진. TSO2가 (그림 1) 표현이 어디 진한 파란색 색상을 나타냅니다. 또한, 조직은 ° C 나중에 볼 수 있도록 4 저장할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 pTSO2 :. : 유전자 변형 모종의 거스 표현 (A), 측면 뿌리 (B), 그리고 루트 팁 (C). TSO2 발기인은 젊은 분열 조직에서 매우 활성화되어 있습니다. (C)와 같이 산발적 표현식 패턴은 특정 세포주기의 단계에있는 유전자 표현의 전형이다. </li></ol> 대표 결과 제대로하면, 변환 효율은 약 0.1-0.2 %되어야합니다. 다른 단어에서, 하나는 모든 5,000 종자를 선별하여 50-10 형질 모종을해야합니다. 평균 약 100 유전자 변형 라인은 야생 형 식물의 4 냄비를 변환하여 얻을 수 있습니다. 에 대한 pTSO2를 포함하는 유전자 변형 모종 : 거스 구축 3, 거스 활동을 반영 진한 파란색 색상 어린 나뭇잎, 쏴, 아펙스, 루트 팁, 그리고 측면 루트 primordia (그림 1)을 포함하여 적극적으로 나누어 세포에서 발견된다. 비 균일한 산발적 패턴은 세포주기 단계 - 구체적인 표현의 특징입니다.

<ol><li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li>
<li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression%2C+DNA+damage+repair%2C+and+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

변환 효율은 아래 설명하는 여러 가지 요인에 의해 결정됩니다 : <ol><li> 식물의 건강과 자신의 나이가 기본 중요합니다. 다수의 미숙 꽃 봉오리를 생산 약 한 달쯤 식물 이상적입니다. 변환하기 전에 보조 촬영 형성 3-4일 권장하는 기본 골인을 트리밍하는 것은 변환 효율을 증가합니다. 이전 식물 transformants을 일으키다하지만 낮은 비율로합니다. </li><li> 식물의 불임은 중요하다. 하나는 감소 다산과 돌연변이를 변환하는 경우, 많은 식물은 찍기 위해 필요한 것입니다. </li><li> 침투 버퍼의 0.3 % Silwet L - 77 계면 활성제가 필수적인 것으로 간주됩니다. </li><li> 침투 미디어에서 시간을 디핑 것은 적어도 5 분 정도한다. </li><li> 곰팡이 오염을 줄이기 위해 몇 가지주의 사항을 주의해야한다. 첫째, 하나는 식물 / 토양 침투하기 전에 하루에 물을 침투하여 미디어를 몸으로에서 흙을 피하기 위해 필요합니다. 잠수함 침투 미디어의 토양하지 마십시오. 둘째, 수분을 줄이...

<table><tbody><tr><td>6-벤질아데닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>852430</td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>Crompton Corp.</td><td></td><td>독성, 장갑 착용 필수</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog 기본 배지 (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;비타민 용액 1000X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>X-Gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 &amp;#946;D-글루쿠로니드 사이클로헥사민 염</td><td>Biosynth International, Inc</td><td>B-7300</td><td>독성, 빛에 민감하므로 암소 보관</td></tr><tr><td>3M 마이크로포어 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>19027761</td><td></td></tr></tbody></table>

의 꽃 - 물놀이 변환 arabidopsis thaliana 검사 ptso2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

유기체로 외국 유전자를 도입하는 능력은 현대 생물학과 생명 공학에 대한 기초입니다. 모델 꽃 공장에서<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; 꽃 - 딥 변환 방법<sup&gt; 1-2</sup&gt; 때문에 간단, 효율성 및 저렴한 비용의 이전의 모든 방법을 대체하고 있습니다. 젊은 꽃의 특히, 골인<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 식물의 솔루션에 담근 아르<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; 구체적인 플라스미드 구조를 들고. 마른 후, 식물이 정상적인 성장과 항복 씨앗, 외국 유전자로 변환하고 항생제를 포함하는 매체에 대해 선택할 수있는 작은 비율로 반환됩니다. 크게 촉진이 꽃 - 물놀이 방법<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 연구와 식물 유전자 기능에 대한 우리의 이해에 크게 공헌했습니다. 본 연구에서는, 우리는 기자의 유전자를 변형하는 꽃 - 수영 방법을 사용<em&gt; β - glucuronidase (거스)</em&gt;의 통제하에<em&gt; TSO2</em&gt; 발기인.<em&gt; TSO2</em&gt; Ribonucleotide 환원 효소 (RNR) 작은 subunit에 대한 코딩<sup&gt; 3</sup&gt; 세포주기의 S - 단계에서 dNDP 생합성에 필수적인 세포주기 규제 유전자입니다. 심사<em&gt; 거스</em유전자 변형&gt;의 표현<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 모종가를 보여줍니다<em&gt; TSO2</em&gt;를 적극적으로 조직을 나누어 표현입니다. 보고된 실험 방법 및 자료를 쉽게 고등학교 및 대학 수준의 연구뿐만 아니라 교육뿐만 아니라 적용할 수 있습니다.

이 문서의 꽃 - 수영 방법을 보여줍니다<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em의&gt; - 중재 변환<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;. 세포주기 조절 발기인 - 기자를 소개함으로써,<em&gt; pTSO2 : β - glucuronidase (거스)</em&gt;로<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 우리는 하나가 유전자 변형 모종의 거스 기자 표현식을 감지하는 방법을 보여줍니다.

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

외래 유전자를 생물체 내로 도입하는 능력은 현대 생물학과 생명공학의 기초가 됩니다. 모델 개화 식물인 Arabidopsis...

Floral dipping은 리포터 컨스트럭트로 애기장대 식물을 형질전환시키는 데 사용됩니다. 이후 생성된 형질전환 식물에서 리포터 유전자의 발현 여부를 조사합니다. 먼저, 꽃이 핀 어린 애기장대 식물을 리포터 컨스트럭트가 포함된 agrobacterium 투에피실론 용액에 담급니다.다음으로, 식물을 원래의 생장 조건으로 되돌려 종자를 생산할 때까지 배양하며, 이 중 소수의 종자에 외래 유전자가 도입됩니다. 절차의 세 번째 단계는 식물에서 종자를 수집하여 항생제가 포함된 선택 배지에 파종하는 것입니다. 마지막으로, 항생제가 포함된 선택 배지에서 자라는 유묘를 검사합니다.외래 유전자를 포함하는 형질전환 묘는 항생제에 내성을 가져 살아남는 반면, 비형질전환 묘는 결국 하얗게 변하며 죽게 됩니다. 형질전환 묘의 리포터 유전자 발현은 리포터 유전자의 기질로 형질전환 묘를 염색한 후 해부 현미경으로 세포와 조직을 관찰하여 확인합니다. 안녕하세요, 저는 메릴랜드 대학교 세포생물학 및 분자유전학과의 Zou 박사 연구실 소속 Chloe Mara입니다.저는 Dr.Z Chile 연구실의 Wna gva입니다. 오늘은 애기장대(Arabidopsis) 식물을 형질전환시키기 위한 floral dip 방법을 보여드리겠습니다. 그런 다음, 형질전환 식물에서 리포터 유전자 발현을 확인하는 방법을 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 유전자 발현과 식물의 기능을 연구하기 위해 이러한 절차를 일상적으로 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차는 형질전환 약 한 달 전에 시작하십시오.토끼ops 종자를 5인치 정사각형 화분 4~8개에 화분당 약 10~15개씩 심은 다음, 저온실에서 4°C로 3일간 저온 처리한 후 식물 성장 챔버로 옮겨 가임력이 감소된 돌연변이 arabidopsis 식물을 형질 전환시킵니다. 화분 수를 6~10개 더 추가하여 늘리십시오.식물을 표준 조건에서 성장시킵니다. 단일 조건이나 저온 체계에서 성장한 식물은 개화까지 더 오랜 시간이 걸리며, 형질전환 준비가 완료되기까지도 더 많은 시간이 소요됩니다. 세심한 식물 관리를 통해 건강한 상태를 유지하는 것이 성공적인 형질전환을 위해 필수적입니다.식물이 막 추대되어 꽃이 피기 시작했을 때 성장 중인 식물에 살충제를 분무하는 것이 권장됩니다. 이때가 형질전환 효율을 높이기 위한 형질전환에 적합한 시기입니다. 형질전환 3~4일 전, 식물이 추대되는 즉시 주 꽃줄기를 잘라내십시오.형질전환 2일

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