Name: 아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 배우세요 아밀로이드 β 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 체외 선택법으로 선별하는 방법을. 이 기법은 알츠하이머병 연구와 진단 치료제 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 보건의 캘리포니아학과에서 NIH / NIA와 07-65798에서 부여 AG030709 지원했다. 우리는 펩타이드의 합성과 아미노산 분석, 도움 및 프로젝트 지원 및 시약을 제공하는 박사 치 - 홍콩 B. 첸의 초기 단계를 지원하는 박사 엘리자베스 F. 네펠드, 박사 앤드류 D에 대한 마가렛 M. 콘드론을 인정 도움이 토론을 위해. 엘링턴.

<ol><li>Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnostics+and+therapeutics+for+Alzheimer%27s+disease-how+early+can+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Neurother%22%5BJournal%5D)">Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there.</a> Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).</li>
<li>Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the early detection of Alzheimer's disease.</a> Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).</li>
<li>Kawas, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Early Alzheimer's disease.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B2-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shifts+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%3A+the+emerging+role+of+oligomeric+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies.</a> J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+pre-fibrillar+protein+assemblies+in+Alzheimer%27s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Alzheimer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders.</a> Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+therapeutics+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+specifically+interact+with+the+prion+protein+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP.</a> J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).</li>
<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
<li>Rhie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+2%27-fluoro-RNA+aptamers+that+bind+preferentially+to+disease-associated+conformations+of+prion+protein+and+inhibit+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion.</a> J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).</li>
<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Proske, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-protein-specific+aptamer+reduces+PrPSc+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.</a> ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).</li>
<li>Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-bovine+prion+protein+RNA+aptamer+containing+tandem+GGA+repeat+interacts+both+with+recombinant+bovine+prion+protein+and+its+%CE%B2+isoform+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity.</a> Prion. 2, 73-80 (2008).</li>
<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
<li>Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+DS+%22Lab+math%3A+a+handbook+of+measurements%2C+calculations%2C+and+other+quantitative+skills+for+use+at+the+bench%22">Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+developed+for+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods developed for SELEX.</a> Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).</li>
<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

SELEX 과정의 출발점은 일반적으로 10 12 -10 15 시퀀스를 포함하는 임의의 oligonucleotide 라이브러리의 합성이다. RNA SELEX에서, 여기를 시연 반면 DNA SELEX,이 라이브러리가, ssDNA 수영장이 생성된 후 직접 사용, ssDNA 라이브러리는 체외 수정의 전사에 의해 효소 RNA 수영장 최초로 변환됩니다. 각각의 사이클은 노출과 의도한 대상으로 oligonucleotides의 바인딩을 구성되어 의하여 다음, SELEX는 구속력 시퀀스 및 바인딩 시퀀스의 용출에서 바인더의 파티션, 반복 수행됩니다. 나중에 사이클에서는, 대상 및 RNA 및 / 또는 세척의 개수의 stoichiometry을 변경할 수 있습니다, 또는 경쟁 억제제는 SELEX 조건의 엄중을 높일 수있는 바인딩 또는 세척 버퍼에 추가할 수 있습니다. 수많은 방법 바인딩 및 파티션에 대한 28 설명했습니다 불구하고 필터 바인딩은, SELEX 10</...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA 생체고분자 실험실</td><td></td><td>동결건조 분말</td></tr><tr><td>MX5 자동-S 마이크로밸런스</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 코팅된 1.6ml 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 또는 C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>흄 후드 내에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>용액이 투명해질 때까지 볼텍싱합니다. APS는 매번 새로 조제하며, 48시간 이내에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) 6수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>용액이 투명해질 때까지 볼텍싱하십시오. 주변광으로부터 시약을 보호하기 위해 RuBpy 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오. RuBpy는 매번 새로 조제하며 48시간 이내에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; 엑셀셀루즈(Excellulose)&amp;#8482; 탈염 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 코팅된 0.6ml 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine 겔 (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10-웰; 미니 사이즈 (8 cm X 8 cm); 25 &amp;#x03BC;웰당 로딩 부피; 분리 범위 5 kDa ~ 40 kDa</td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 분광광도계</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssDNA 라이브러리</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤 주문 제작된</td><td>해당 라이브러리는 프라이머 결합 부위와 클로닝 부위를 포함하는 두 개의 불변 영역(constant regions) 사이에 49개의 무작위 뉴클레오타이드가 포함되도록 설계되었습니다: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>재조합 &lt;전자현미경&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; 10X 버퍼와 함께 공급된 DNA 폴리머라아제&amp;#215; PCR 완충액 및 25 mM MgCl₂ 별도 튜브&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 일반적인 PCR을 위해.</td></tr><tr><td>PCR 뉴클레오타이드 믹스, 10mM 용액</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(각 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>정방향 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>주문 제작된</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>역방향 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤 주문된</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>써멀 사이클러</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>O-링이 부착된 캡이 포함된 멸균된 1.6ml 원추형 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; 대규모 RNA 생산 시스템&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>키트 구성품: 120 &amp;#x03BC;효소 믹스 (RNA 중합효소, 재조합 RNasin)&amp;#174; 리보핵산가수분해효소 억제제 및 재조합 무기 피로인산가수분해효소); 240 &amp;#x03BC;전사 5X 완충액; 100 &amp;#x03BC;각 100 mM의 4종 rNTP, 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;선형 컨트롤 DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M 아세트산 나트륨 (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-시티딘 5&amp;rsquo;-트리포스페이트, 250 &amp;mu;Ci (9.25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>비방사능: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)</td></tr><tr><td>시트르산 포화 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (125:24:1, pH 4.7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름:이소아밀 알코올 (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학용 절대 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Z216-MK 냉장 마이크로원심분리기</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50 마이크로 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>Fisher Scientific(45-001-487)에서 구입함</td><td>Sephadex로 사전 충전됨&amp;#8482; G-50 DNA Grade이며, 살생물제로서 0.15% Kathon이 포함된 STE 버퍼로 사전 평형화됨</td></tr><tr><td>Triathler 벤치탑 액체 섬광 계수기</td><td>Hidex Oy, 핀란드 투르쿠</td><td>Triathler LSC 모델: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-우레아 시료 버퍼 (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-요소 겔 1.0 mm, 10웰</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE 전기영동 버퍼 (5x)&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>방사능 제염제</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;전자현미경(electron microscopy)&gt;SureLock&lt;/em&gt; 미니셀</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;전자현미경(EM)&gt;SureLock&lt;/em&gt; 미니 셀(Mini-Cell)</td></tr><tr><td>자가방사선촬영 필름</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>완전한 암전 상태에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>자동방사선촬영 필름, Hyperfilm&amp;#8482; 전기화학발광</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>적색 안전광 하에서 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>막 디스크</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>혼합 셀룰로오스 에스테르, 친수성, 0.22-&amp;#x03BC;m-disc 멤브레인</td></tr><tr><td>125ml 플라스크용 프리츠 유리 지지대</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학용 2-프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>재조합 RNase 억제제</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;역전사 시스템</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>재조합 RNase 억제제</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; 로딩 다이</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 aptamers의 선택

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

알츠하이머 병 (AD 1)의 presymptomatic 진단이 어려운 렌더링 교활한 코스와 진보, 나이 의존, neurodegenerative 무질서이다. 확실히 AD 진단 따라서 광고의 presymptomatic, 조기 진단이 효과적인 치료법 2,3를 개발하고 관리를 위해 중요합니다 수립, 오직 사후 이루어진다. 아밀로이드 β - 단백질 (Aβ) 광고 pathogenesis의 중심이다. 가용성, oligomeric Aβ 어셈블리는 AD 4,5에서 neurotoxicity 기본 시냅스 기능 장애 및 신경 세포 손실에 영향을 믿고 있습니다. 수용성 Aβ 어셈블리 다양한 형태의이 설명되었습니다, 그러나, 그들의 상호 관계 및 광고의 병인 및 pathogenesis 관련성 복잡하고 잘 이해 6되지 않습니다. 특정 분자 인식 도구는 Aβ 어셈블리 사이의 관계를 해명하고 증상이 등장하기 전에 초기 질병 과정에서 이러한 어셈블리의 탐지 및 특성을 촉진 수도 있습니다. 분자 인식은 일반적으로 항체에 의존합니다. 그러나, 분자 인식 도구, aptamers의 대체 수업은 항체 7,8에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 지수 농축 (SELEX) 9,10하여 리간드의 체계적 발전 : Aptamers는 체외 수정이 선택에 의해 생성 oligonucleotides 있습니다. SELEX는 다원 진화와 마찬가지로, 수, 그 반복 과정을 선택, 증폭, 강화, 그리고 재산의 영구화, 예를 들어, 아비드, 특정 리간드 바인딩 (aptamers) 또는 촉매 활동 (ribozymes 및 DNAzymes). 현대 생물 공학 및 의학 11 도구로 aptamers의 출현에도 불구하고, 그들은 아밀로이드 분야에서 underutilized되었습니다. 몇 RNA 또는 ssDNA의 aptamers은 프리온 단백질 (PrP) 12-16의 다양한 형태에 대한 선택되었습니다. 재조합 보빈 PrP에 대해 생성되는 RNA aptamer는 아밀로이드 원섬유 18 양식 전체 길이 PrP의 가용성, oligomeric, β - 시트 풍부한 conformational 변형, 보빈 PrP - β 17 인식 표시되었다. Aptamers 2 - microglobulin (β 2m)는 β 2m 원섬유 19 이외의 다른 특정 amyloidogenic 단백질 원섬유를 바인딩하는 찾았습니다 원섬유의의 β의 monomeric 여러 양식을 사용하여 생성되었습니다. Ylera 외. 고정 monomeric Aβ40 20에 대한 선택의 RNA aptamers를 설명했다. 예기치이 aptamers은 원섬유의 Aβ40을 바운드. 모두,이 데이터는 몇 가지 중요한 질문을 올립니다. 왜 monomeric 단백질에 대한 선택 aptamers는 고분자 형태를 인식나요? amyloidogenic 단백질의 monomeric 및 / 또는 oligomeric 형태에 대한 aptamers를 얻을 수 있을까요? 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 사진을 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) 22,23을 사용하여 생성된 covalently - 안정 oligomeric Aβ40 21 aptamers를 선택하려했습니다. 이전 결과 17,19,20 마찬가지로, 이러한 aptamers 가능성이 높습니다 aptatope 21 구조 잠재적으로 일반적인 아밀로이드를 인식 Aβ와 기타 여러가지 amyloidogenic 단백질의 원섬유과 반응. 여기, 우리는 이러한 aptamers 21 생산에 사용 SELEX 방법론을 제시한다.

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides 아르<em&gt; 체외 수정</em&gt; 특정 대상에 대한 친화력을 바탕으로 진화 방법. Aptamers는 다양한 치료, 진단 및 연구 애플 리케이션과 분자 인식 도구입니다. 우리는 아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 질병의 원인이되는 에이전트 aptamers의 선정 방법을 보여줍니다.

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

알츠하이머병(AD)은 서서히 진행되는 연령 의존적 신경퇴행성 질환으로, 그 경과가 잠행적이기 때문에 증상 발현 전의 진단을 ...

RNA Selects 실험의 전반적인 목표는 표적 단백질에 특이적이고 강력하게 결합하는 RNA 분자를 선별하는 것입니다. 이는 무작위 DNA 올리고뉴클레오타이드 라이브러리로부터 RNA를 인비트로(in vitro) 전사한 후, 전사된 RNA 풀을 표적 단백질과 함께 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로는 필터 결합법이 사용됩니다.이를 통해 표적 결합 RNA 분자를 비결합 RNA 풀에서 분리합니다. 다음으로, 표적 결합 RNA 분자를 추출합니다. 역전사하여 DNA로 전환한 뒤 PCR로 증폭시키고, 다시 RNA로 전사합니다.일부 결합 어버(abers)가 농축된 이 RNA 풀은 다음 선택 사이클에서 표적에 결합하는 데 사용됩니다. 일반적으로 8회에서 20회 사이클 후에 결합력이 매우 높은 표적 특이적 압타머가 선택되고 특성화됩니다. 안녕하세요, 저는 UCLA 신경과 교실의 gal bean이며, 오늘은 far rahimi입니다.저희 실험실의 시니어 박사후 연구원이 cellex라고 불리는 과정을 시연할 예정입니다. 저희는 실험실에서 amyloid beta oligomers에 대한 abers를 선택하기 위해 이 과정을 사용해 왔습니다. 그럼 시작하겠습니다.이제 읽어드리겠습니다. 본 선택 실험에서는, 이전 JoVE 비디오 프로토콜에 설명된 픽업 절차를 사용하고 동봉된 서면 프로토콜에 상세히 기술된 수정 사항을 적용하여, amyloid beta protein A beta 40로 구성된 균질하고 응집물이 없는 안정적인 단백질 리가먼트를 준비합니다. 가교 결합 후, 5 mL 탈염 컬럼을 사용하여 가교 결합된 리가먼트 혼합물을 정제합니다.먼저, 컬럼을 스탠드에 고정하고 컬럼 배출구 아래에 비커를 놓습니다. 컬럼의 상단 캡과 배출구 플러그를 제거합니다. 보관 버퍼를 흘려보내어 비커에 수집합니다.다음으로, 10 millimolar ammonium acetate pH 8.3를 3 milliliter씩 분주하여 레진 층 부피의 5배량으로 컬럼을 평형화합니다. 컬럼 평형화가 완료되면, 0.5 milliliter의 픽업 반응 혼합물을 컬럼에 로딩합니다. 단백질 혼합물이 레진에 충분히 흡착되도록 기다린 후 통과액은 제거합니다.비커 안에 컬럼 출구 아래에 첫 번째 수집 튜브를 놓습니다. 컬럼에 아세테이트 완충액 0.5 milliliters를 가하고, 처음으로 흘러나오는 0.5 milliliter 분획을 수집합니다. 용출 과정을 반복하여 해당

selection-aptamers-for-amyloid-protein-causative-agent-alzheimer-s

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

바이오패닝 기술과 원자력 현미경을 사용하여 낮은 농도에서도 모든 생물학적 물질에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 음성 및 양성 바이오패닝 시스템을 만들었습니다.  우리는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 관련된 TDP-43 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 데 성공했습니다.

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

생체 내에서 Aβo의 효과를 연구하기 위해 Aβo의 신경독성 효과를 상쇄하기 위해 삼투압 펌프를 사용하여 해마에 Aβo 항체(6E10)를 지속적으로 주입하는 용해성 Aβo의 반복적인 해마 주입을 기반으로 하는 모델을 개발했습니다.

만성 아밀로이드 - 베타 올리고머 주입의 동물 모델에서 신경 퇴행은 삼투 펌프와 항체 치료 인 퓨즈에 의해 상쇄되어

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS)와 분자 이미징 생물 학적 샘플에서 여러 analytes의 동시 매핑을 수 있습니다. 여기, 선물이 Alzheimer의 질병과 MALDI IMS를 사용 하 여 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy 샘플의 뇌 조직에 감지 및 아 밀 로이드 β 단백질의 시각화에 대 한 프로토콜.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

본 프로토콜은 알츠하이머병의 APP/PS1 트랜스제닉 마우스 모델에서 아밀로이드-베타 부하를 정량화하기 위해 시상 마우스 뇌 절편의 전체 영역 또는 관심 영역 분석을 수행하는 절차를 설명하고 비교한다.

마우스 뇌 절편에 대한 아밀로이드-베타 부하의 전체 대 하위 지역 정량화

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

배우세요 아밀로이드 β 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 체외 선택법으로 선별하는 방법을. 이 기법은 알츠하이머병 연구와 진단 치료제 개발에 활용됩니다.

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

더 많은 동영상 탐색