Name: 아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 배우세요 아밀로이드 β 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 체외 선택법으로 선별하는 방법을. 이 기법은 알츠하이머병 연구와 진단 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 보건의 캘리포니아학과에서 NIH / NIA와 07-65798에서 부여 AG030709 지원했다. 우리는 펩타이드의 합성과 아미노산 분석, 도움 및 프로젝트 지원 및 시약을 제공하는 박사 치 - 홍콩 B. 첸의 초기 단계를 지원하는 박사 엘리자베스 F. 네펠드, 박사 앤드류 D에 대한 마가렛 M. 콘드론을 인정 도움이 토론을 위해. 엘링턴.

<ol><li>Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnostics+and+therapeutics+for+Alzheimer%27s+disease-how+early+can+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Neurother%22%5BJournal%5D)">Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there.</a> Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).</li>
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<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
<li>Rhie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+2%27-fluoro-RNA+aptamers+that+bind+preferentially+to+disease-associated+conformations+of+prion+protein+and+inhibit+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion.</a> J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).</li>
<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Proske, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-protein-specific+aptamer+reduces+PrPSc+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.</a> ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).</li>
<li>Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-bovine+prion+protein+RNA+aptamer+containing+tandem+GGA+repeat+interacts+both+with+recombinant+bovine+prion+protein+and+its+%CE%B2+isoform+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity.</a> Prion. 2, 73-80 (2008).</li>
<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
<li>Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+DS+%22Lab+math%3A+a+handbook+of+measurements%2C+calculations%2C+and+other+quantitative+skills+for+use+at+the+bench%22">Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+developed+for+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods developed for SELEX.</a> Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).</li>
<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

SELEX 과정의 출발점은 일반적으로 10 12 -10 15 시퀀스를 포함하는 임의의 oligonucleotide 라이브러리의 합성이다. RNA SELEX에서, 여기를 시연 반면 DNA SELEX,이 라이브러리가, ssDNA 수영장이 생성된 후 직접 사용, ssDNA 라이브러리는 체외 수정의 전사에 의해 효소 RNA 수영장 최초로 변환됩니다. 각각의 사이클은 노출과 의도한 대상으로 oligonucleotides의 바인딩을 구성되어 의하여 다음, SELEX는 구속력 시퀀스 및 바인딩 시퀀스의 용출에서 바인더의 파티션, 반복 수행됩니다. 나중에 사이클에서는, 대상 및 RNA 및 / 또는 세척의 개수의 stoichiometry을 변경할 수 있습니다, 또는 경쟁 억제제는 SELEX 조건의 엄중을 높일 수있는 바인딩 또는 세척 버퍼에 추가할 수 있습니다. 수많은 방법 바인딩 및 파티션에 대한 28 설명했습니다 불구하고 필터 바인딩은, SELEX 10</...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA 생체고분자 실험실</td><td></td><td>동결건조 분말</td></tr><tr><td>MX5 자동-S 마이크로밸런스</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 코팅된 1.6ml 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 또는 C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>흄 후드 내에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>용액이 투명해질 때까지 볼텍싱합니다. APS는 매번 새로 조제하며, 48시간 이내에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) 6수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>용액이 투명해질 때까지 볼텍싱하십시오. 주변광으로부터 시약을 보호하기 위해 RuBpy 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오. RuBpy는 매번 새로 조제하며 48시간 이내에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; 엑셀셀루즈(Excellulose)&amp;#8482; 탈염 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 코팅된 0.6ml 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine 겔 (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10-웰; 미니 사이즈 (8 cm X 8 cm); 25 &amp;#x03BC;웰당 로딩 부피; 분리 범위 5 kDa ~ 40 kDa</td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 분광광도계</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssDNA 라이브러리</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤 주문 제작된</td><td>해당 라이브러리는 프라이머 결합 부위와 클로닝 부위를 포함하는 두 개의 불변 영역(constant regions) 사이에 49개의 무작위 뉴클레오타이드가 포함되도록 설계되었습니다: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>재조합 &lt;전자현미경&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; 10X 버퍼와 함께 공급된 DNA 폴리머라아제&amp;#215; PCR 완충액 및 25 mM MgCl₂ 별도 튜브&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 일반적인 PCR을 위해.</td></tr><tr><td>PCR 뉴클레오타이드 믹스, 10mM 용액</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(각 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>정방향 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>주문 제작된</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>역방향 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤 주문된</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>써멀 사이클러</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>O-링이 부착된 캡이 포함된 멸균된 1.6ml 원추형 튜브</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; 대규모 RNA 생산 시스템&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>키트 구성품: 120 &amp;#x03BC;효소 믹스 (RNA 중합효소, 재조합 RNasin)&amp;#174; 리보핵산가수분해효소 억제제 및 재조합 무기 피로인산가수분해효소); 240 &amp;#x03BC;전사 5X 완충액; 100 &amp;#x03BC;각 100 mM의 4종 rNTP, 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;선형 컨트롤 DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M 아세트산 나트륨 (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-시티딘 5&amp;rsquo;-트리포스페이트, 250 &amp;mu;Ci (9.25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>비방사능: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)</td></tr><tr><td>시트르산 포화 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (125:24:1, pH 4.7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름:이소아밀 알코올 (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학용 절대 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Z216-MK 냉장 마이크로원심분리기</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50 마이크로 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>Fisher Scientific(45-001-487)에서 구입함</td><td>Sephadex로 사전 충전됨&amp;#8482; G-50 DNA Grade이며, 살생물제로서 0.15% Kathon이 포함된 STE 버퍼로 사전 평형화됨</td></tr><tr><td>Triathler 벤치탑 액체 섬광 계수기</td><td>Hidex Oy, 핀란드 투르쿠</td><td>Triathler LSC 모델: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-우레아 시료 버퍼 (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-요소 겔 1.0 mm, 10웰</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE 전기영동 버퍼 (5x)&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>방사능 제염제</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;전자현미경(electron microscopy)&gt;SureLock&lt;/em&gt; 미니셀</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;전자현미경(EM)&gt;SureLock&lt;/em&gt; 미니 셀(Mini-Cell)</td></tr><tr><td>자가방사선촬영 필름</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>완전한 암전 상태에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>자동방사선촬영 필름, Hyperfilm&amp;#8482; 전기화학발광</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>적색 안전광 하에서 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>막 디스크</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>혼합 셀룰로오스 에스테르, 친수성, 0.22-&amp;#x03BC;m-disc 멤브레인</td></tr><tr><td>125ml 플라스크용 프리츠 유리 지지대</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학용 2-프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>재조합 RNase 억제제</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;역전사 시스템</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>재조합 RNase 억제제</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; 로딩 다이</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 aptamers의 선택

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

알츠하이머 병 (AD 1)의 presymptomatic 진단이 어려운 렌더링 교활한 코스와 진보, 나이 의존, neurodegenerative 무질서이다. 확실히 AD 진단 따라서 광고의 presymptomatic, 조기 진단이 효과적인 치료법 2,3를 개발하고 관리를 위해 중요합니다 수립, 오직 사후 이루어진다. 아밀로이드 β - 단백질 (Aβ) 광고 pathogenesis의 중심이다. 가용성, oligomeric Aβ 어셈블리는 AD 4,5에서 neurotoxicity 기본 시냅스 기능 장애 및 신경 세포 손실에 영향을 믿고 있습니다. 수용성 Aβ 어셈블리 다양한 형태의이 설명되었습니다, 그러나, 그들의 상호 관계 및 광고의 병인 및 pathogenesis 관련성 복잡하고 잘 이해 6되지 않습니다. 특정 분자 인식 도구는 Aβ 어셈블리 사이의 관계를 해명하고 증상이 등장하기 전에 초기 질병 과정에서 이러한 어셈블리의 탐지 및 특성을 촉진 수도 있습니다. 분자 인식은 일반적으로 항체에 의존합니다. 그러나, 분자 인식 도구, aptamers의 대체 수업은 항체 7,8에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 지수 농축 (SELEX) 9,10하여 리간드의 체계적 발전 : Aptamers는 체외 수정이 선택에 의해 생성 oligonucleotides 있습니다. SELEX는 다원 진화와 마찬가지로, 수, 그 반복 과정을 선택, 증폭, 강화, 그리고 재산의 영구화, 예를 들어, 아비드, 특정 리간드 바인딩 (aptamers) 또는 촉매 활동 (ribozymes 및 DNAzymes). 현대 생물 공학 및 의학 11 도구로 aptamers의 출현에도 불구하고, 그들은 아밀로이드 분야에서 underutilized되었습니다. 몇 RNA 또는 ssDNA의 aptamers은 프리온 단백질 (PrP) 12-16의 다양한 형태에 대한 선택되었습니다. 재조합 보빈 PrP에 대해 생성되는 RNA aptamer는 아밀로이드 원섬유 18 양식 전체 길이 PrP의 가용성, oligomeric, β - 시트 풍부한 conformational 변형, 보빈 PrP - β 17 인식 표시되었다. Aptamers 2 - microglobulin (β 2m)는 β 2m 원섬유 19 이외의 다른 특정 amyloidogenic 단백질 원섬유를 바인딩하는 찾았습니다 원섬유의의 β의 monomeric 여러 양식을 사용하여 생성되었습니다. Ylera 외. 고정 monomeric Aβ40 20에 대한 선택의 RNA aptamers를 설명했다. 예기치이 aptamers은 원섬유의 Aβ40을 바운드. 모두,이 데이터는 몇 가지 중요한 질문을 올립니다. 왜 monomeric 단백질에 대한 선택 aptamers는 고분자 형태를 인식나요? amyloidogenic 단백질의 monomeric 및 / 또는 oligomeric 형태에 대한 aptamers를 얻을 수 있을까요? 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 사진을 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) 22,23을 사용하여 생성된 covalently - 안정 oligomeric Aβ40 21 aptamers를 선택하려했습니다. 이전 결과 17,19,20 마찬가지로, 이러한 aptamers 가능성이 높습니다 aptatope 21 구조 잠재적으로 일반적인 아밀로이드를 인식 Aβ와 기타 여러가지 amyloidogenic 단백질의 원섬유과 반응. 여기, 우리는 이러한 aptamers 21 생산에 사용 SELEX 방법론을 제시한다.

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides 아르<em&gt; 체외 수정</em&gt; 특정 대상에 대한 친화력을 바탕으로 진화 방법. Aptamers는 다양한 치료, 진단 및 연구 애플 리케이션과 분자 인식 도구입니다. 우리는 아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 질병의 원인이되는 에이전트 aptamers의 선정 방법을 보여줍니다.

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

알츠하이머병(AD)은 서서히 진행되는 연령 의존적 신경퇴행성 질환으로, 그 경과가 잠행적이기 때문에 증상 발현 전의 진단을 ...

RNA Selects 실험의 전반적인 목표는 표적 단백질에 특이적이고 강력하게 결합하는 RNA 분자를 선별하는 것입니다. 이는 무작위 DNA 올리고뉴클레오타이드 라이브러리로부터 RNA를 인비트로(in vitro) 전사한 후, 전사된 RNA 풀을 표적 단백질과 함께 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로는 필터 결합법이 사용됩니다.이를 통해 표적 결합 RNA 분자를 비결합 RNA 풀에서 분리합니다. 다음으로, 표적 결합 RNA 분자를 추출합니다. 역전사하여 DNA로 전환한 뒤 PCR로 증폭시키고, 다시 RNA로 전사합니다.일부 결합 어버(abers)가 농축된 이 RNA 풀은 다음 선택 사이클에서 표적에 결합하는 데 사용됩니다. 일반적으로 8회에서 20회 사이클 후에 결합력이 매우 높은 표적 특이적 압타머가 선택되고 특성화됩니다. 안녕하세요, 저는 UCLA 신경과 교실의 gal bean이며, 오늘은 far rahimi입니다.저희 실험실의 시니어 박사후 연구원이 cellex라고 불리는 과정을 시연할 예정입니다. 저희는 실험실에서 amyloid beta oligomers에 대한 abers를 선택하기 위해 이 과정을 사용해 왔습니다. 그럼 시작하겠습니다.이제 읽어드리겠습니다. 본 선택 실험에서는, 이전 JoVE 비디오 프로토콜에 설명된 픽업 절차를 사용하고 동봉된 서면 프로토콜에 상세히 기술된 수정 사항을 적용하여, amyloid beta protein A beta 40로 구성된 균질하고 응집물이 없는 안정적인 단백질 리가먼트를 준비합니다. 가교 결합 후, 5 mL 탈염 컬럼을 사용하여 가교 결합된 리가먼트 혼합물을 정제합니다.먼저, 컬럼을 스탠드에 고정하고 컬럼 배출구 아래에 비커를 놓습니다. 컬럼의 상단 캡과 배출구 플러그를 제거합니다. 보관 버퍼를 흘려보내어 비커에 수집합니다.다음으로, 10 millimolar ammonium acetate pH 8.3를 3 milliliter씩 분주하여 레진 층 부피의 5배량으로 컬럼을 평형화합니다. 컬럼 평형화가 완료되면, 0.5 milliliter의 픽업 반응 혼합물을 컬럼에 로딩합니다. 단백질 혼합물이 레진에 충분히 흡착되도록 기다린 후 통과액은 제거합니다.비커 안에 컬럼 출구 아래에 첫 번째 수집 튜브를 놓습니다. 컬럼에 아세테이트 완충액 0.5 milliliters를 가하고, 처음으로 흘러나오는 0.5 milliliter 분획을 수집합니다. 용출 과정을 반복하여 해당 튜브들에 총 8.5 milliliter 분획을 수집합니다.SDS-PAGE 및 흡광도를 통해 시료를 분석합니다. 단백질 함량이 가장 높은 분획들을 합친 후, 서면 프로토콜에 설명된 대로 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 아미노산 분석용으로 10 µL의 분취액을 남겨두고 나머지는 보관합니다.다음으로, RNA 풀을 준비합니다. 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 PCR을 통해 합성 단일 가닥 DNA 라이브러리를 증폭하는 것으로 시작하십시오. 증폭된 DNA 생성물을 정제하고, 2% agarose 겔 전기영동을 통해 DNA 양을 확인합니다.일반적으로 DNA의 농도와 수율은 튜브당 50 µL 부피에서 160 ± 10 ng/µL입니다. 다음으로, 동봉된 서면 프로토콜에 상세히 기술된 대로, 방사성 CTP 존재 하에 DNA를 밤새 인 비트로 전사(in vitro transcribe)한 후, 증폭된 DNA 템플릿을 DNase로 4시간 동안 소화시켜 P 32 표지 RNA 풀을 생성합니다. 제조사인 Promega에서는 DNase와 함께 15분간 배양할 것을 권장하지만, 본 실험에서는 4시간 동안 배양했을 때 DNase 처리 후 모든 DNA 템플릿이 완전히 제거됨을 확인하였습니다.시트르산 포화 페닐 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 1부피분 첨가하여 RNA를 추출하고, 약 1분 동안 볼텍싱한 후 실온에서 16,000 Gs로 2분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 마이크로파이펫을 사용하여 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 1부피분 첨가하고 1분간 볼텍싱한 후 원심분리합니다. 이전과 마찬가지로 마이크로파이펫을 사용하여 하층을 흡입 제거합니다.이 단계에서는 상층액보다 하층액을 제거하는 것이 더 쉽다는 점에 유의하십시오. 하층액은 폐기합니다. 다음으로 RNA를 침전시키기 위해 3 M sodium acetate 0.1 부피 해당량과 isopropanol 1 부피 해당량을 첨가하십시오.혼합하여 -20 °C 냉동고에 15분 동안 보관합니다. 15분 후, 원심분리하여 상층액을 흡입 제거하고 0.5 mL의 70% ethanol로 RNA 펠릿을 세척합니다. 에탄올 세척 후 원심분리하고 에탄올을 버립니다. 가열 블록에서 37 °C로 5분 동안 RNA 펠릿을 건조시킨 후, in vitro 전사 반응액과 동일한 부피가 되도록 RNA 샘플을 150 mM STE buffer pH 8.0에 용해합니다.RNA 생성물이 포함된 튜브를 가열 블록에서 70 °C로 10분 동안 가열하고 볼텍스합니다. RNA 용해를 촉진하기 위해 상온에서 최고 속도로 1분 동안 원심분리하며, 신틸레이션 계수 및 TPE urea 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위해 1 µL의 RNA aliquot을 보관합니다. RNA 용해 후, 제조사의 지침에 따라 G 50 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거합니다.G 50 정제 RNA 중 1 µL는 신틸레이션 계수 및 변성 겔 전기영동을 위해 남겨두어야 합니다. RNA 침전 및 G 50 탈염 단계에서 얻은 1 µL RNA 분주액 2개를 신틸레이션 계수에 사용하십시오. 신틸레이션 계수 후 표지 통합률(percent label incorporation)을 계산하고, 통합률 계산 후 RNA의 수율과 RNA의 비방사능(specific activity)을 계산하십시오.마지막으로, 샘플을 6% TBE urea poly acrylamide gel에서 전기영동하고 동반된 서면 프로토콜에 기술된 대로 자동 방사선 촬영(auto radiography)을 통해 RNA를 시각화하여 G 50 정제 전후의 RNA를 확인합니다. 표지된 생성물의 품질이 만족스러우면, RNA 라이브러리를 단백질 샘플과 혼합하여 선택(selects) 과정을 진행하십시오. RNA 스톡을 90 °C에서 10분 동안 배양하여 변성시킨 후, 실온에서 10분 동안 배양하여 천천히 재자연화(re naturation)시킵니다.RNA를 배양하는 동안, 단백질 튜브 하나를 60 mM 수산화나트륨 8 µL와 핵산이 제거된 탈이온수 36 µL에 녹입니다. 혼합물을 1분 동안 초음파 처리한 후, 2 X RNA 결합 버퍼 36 µL를 첨가합니다. 음성 대조군의 경우,RNA를 20 µL의 10 X RNA 결합 버퍼와 혼합한 후, nuclease free water를 추가하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 결합 반응을 위해, 단백질과 RNA 혼합물 20 µL를 20 µL의 10 X RNA 결합 버퍼와 혼합하고, nuclease free water를 사용하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다.튜브를 상온에서 30분 동안 배양하는 동안, 샘플이 배양되는 동안 필터와 필터 결합 장치를 준비합니다. 먼저, 125 milliliter 사이드암 플라스크를 진공 입구에 연결합니다. 세척된 필터용 다공성 유리 지지대를 사이드암 플라스크 위에 놓습니다.다음으로, 35 x 10 mm 페트리 접시에서 2~3 mL의 1X RNA 결합 완충액에 세 장의 필터 막을 10~15분 동안 평형화합니다. 음성 대조군과 결합 반응 시료의 배양이 완료되면 최고 속도로 5분 동안 원심분리합니다. 실온에서 진공 장치를 켜고, 첫 번째 막을 다공성 유리에 배치한 후 마이크로 파이펫을 사용하여 RNA 결합 완충액 0.5 mL를 막 위에 떨어뜨립니다.각 버퍼 방울이 멤브레인을 통해 천천히 흐르도록 진공도를 조절하십시오. 이 첫 번째 필터는 진공 흡입력을 조절하는 용도로만 사용됩니다. 다음으로, 다공성 유리에 두 번째 멤브레인을 배치하고 동일한 유속으로 음성 대조군을 멤브레인에 도포하십시오.샘플을 도포한 후, 1X RNA 결합 버퍼 0.5 mL씩 네 번 세척합니다. 음성 대조군 막을 제거하여 신틸레이션 계수용 튜브에 넣습니다. 다공성 유리를 미리 세척한 두 번째 다공성 유리 지지대로 교체합니다.세 번째 디스크를 다공성 유리에 놓고 결합 반응 혼합물을 처리합니다. 방금 보여드린 것처럼 필터를 세척하며, 이후 선택 사이클에서는 세척 횟수를 늘릴 수 있습니다. 선택 조건의 엄격도를 높이려면, 필터 디스크를 꺼내어 '결합 반응'이라고 표시된 1.6 milliliter 튜브에 넣으십시오.두 필터 모두에 대해 신틸레이션 계수를 수행합니다. 막에 가해진 총 방사능 양과 비교하여 필터에 결합된 방사능 수치를 계산합니다. 이를 통해 선택 과정이 진행됨에 따른 결합 농축도를 확인할 수 있습니다.섬광 계수를 마친 후, 튜브에서 결합 반응 필터를 꺼내어 깨끗하고 건조한 35 by 10 millimeter 페트리 접시에 놓습니다. 깨끗한 메스와 핀셋을 사용하여 멤브레인을 작은 조각으로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 잘린 조각들을 다시 섬광 바이알로 옮깁니다.400 µL의 용출 버퍼를 넣고 튜브를 95 °C에서 10분 동안 배양합니다. 10분이 지나면 볼텍싱으로 혼합한 후, 실온에서 최고 속도로 튜브를 원심분리하고 추출 버퍼를 흡입하여 라벨이 부착된 새 튜브에 수집합니다. 신틸레이션 계수를 통해 막 조각이 포함된 튜브에 남아 있는 방사능 수치를 측정합니다. 추출 효율을 평가하기 위해 추출 과정을 3회 반복하며, 3회 추출 후의 효율은 통상적으로 약 95%에서 96%입니다. 다음으로, RNA 공동 침전제로 글리코겐 3~4 µL를 첨가하고, 앞서 설명한 방식과 동일하게 필터에서 방출된 RNA를 추출 및 침전시키되 -20 °C 냉동고에 하룻밤 동안 보관합니다.밤새 배양한 후 샘플을 원심 분리하면 RNA가 거의 보이지 않는 액상으로 침전됩니다. 튜브 바닥에 있는 이 희미한 침전상(precipitant phase)이 흐트러지지 않도록 상청액을 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 0.5 mL의 70% ethanol로 RNA 펠릿을 세척하고 4 °C에서 최대 속도로 5분간 원심 분리한 후, 희미한 침전상이 흐트러지지 않게 주의하며 ethanol을 흡입하여 제거하십시오.RNA 펠릿을 50 µL의 STE 버퍼에 용해하고, 동반된 서면 프로토콜의 신규 전사 RNA 정제 과정에 따라 G 50 정제를 진행하십시오. 다음 선택 사이클을 진행하려면, 동반된 서면 프로토콜에 기술된 대로 RNA를 DNA로 역전사한 후 PCR 증폭을 수행하십시오. 이때 역전사 효소가 제외된 음성 대조군 샘플을 반드시 포함하십시오.음성 대조군 레인이 비어 있고 다른 레인들이 예상대로 나타났는지 겔에서 PCR 산물을 확인하십시오. 이전에 보여드린 방법대로 RNA를 전사하고 라벨링하여 사용하십시오. 다음 주기에서 생성된 올리고머 픽업을 선택하십시오.선별에 사용된 A beta 40 단백질은 본 비디오 프로토콜에 표시된 방법으로 정제되었으며, 이후 빨간색 추적선으로 표시된 흡광도 측정과 SDS page를 통해 분석되었습니다. 단백질은 지속적으로 3분획에서 5분획 사이에 컬럼에서 용출되며, 6분획 이후의 가교 반응 시약 용액은 7분획의 흡광도 증가로 확인되었습니다. SDS page는 전형적인 A beta 40 올리고머 분포를 보여줍니다.각 선택 주기(select cycle)에서 RNA의 무결성은 선택의 반복적 진행을 위해 중요합니다. RNA 전사 및 표지 후, 표지된 RNA의 품질은 변성 젤 전기영동으로 평가합니다. 다음은 G 50 정제 전후의 온전한 표지 RNA 산물의 전형적인 프로필입니다. 인비트로(in vitro) 전사 반응 후에도 이전 선택 주기에서 유래한 오염 DNA 템플릿이 여전히 남아 있으면 선택 효율이 감소하여 더 많은 주기가 필요할 수 있습니다.역전사 반응 후 PCR 증폭 결과에 대한 아가로스 겔 전기영동을 통해 예상되는 DNA 산물이 나타남을 확인할 수 있으며, 음성 대조군 반응 튜브에서 DNA 산물이 검출되지 않는 것은 인비트로(in vitro) 전사 후 DNA 처리법을 통해 DNA 템플릿이 성공적으로 제거되었음을 나타냅니다. 지금까지 광가교 결합으로 공유 결합 안정화된 아밀로이드 베타 40 올리고머를 위한 항체를 선택하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 높은 친화력을 갖기 위해서는 두 분자 모두 안정적인 구조를 유지해야 하며, 두 분자가 상호작용하는 3차원 구조를 가지고 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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