Name: Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 마우스 블라스토시스트에서 영양막 줄기세포(TS cells)를 유도하고 배양하는 방법을. 이 기술은 태반 발달 및 줄기세포 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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저자는 원래 프로토콜 쟈넷 Rossant 감사합니다. 이 연구는 WH하는 보건 부여 CA106308 국립 연구소에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 준비와 TS 세포 라인의 설립에 대해 설명합니다. 이전 자연 교배에 설정하고 슈퍼 배란의 유도를 포함 blastocysts의 수집, 일반적인 마우스 조작은 기본적으로 나지 외 의해 설명된 표준 프로토콜을 따르십시오. 2003 (pp146 - 150). TS 세포의 유도 및 유지 보수 <ol><li> 관심 마우스 사이에 설치 사육 크로스. </li><li> 피더 세포로 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 준비합니다. 이틀 blastocysts의 수집 전에 MEFs는 (2 × 10 6 세포) 100mm 요리 도금입니다. 그 다음날, 이들 세포는 37 2 1 시간 배양을위한 ° C, 5 % CO 2 mitomycin C (20 MG / ML)이있는 TS 매체의 10 ML로 취급됩니다. 이것은 PBS로 두 번 세포를 세척옵니다. mitomycin C 처리 전지는 다음 12 잘 접시 (1 X 10 5 셀 / 음)에 씨앗을 품고 있습니다. </li><li> blastocyst 수집 (3.5 DPC, 첫날이라 함)의 날, MEF 문화 매체는 TS 중간 플러스 1X FGF4/Heparin (0.5 ML / 음)으로 대체됩니다. </li><li> 자궁 수집 준비 : 마우스를 안락사와 자궁 (그림 1A)을 찾습니다. </li><li> 자궁 경부 (방광 뒤에 위치)에서 집게로 쥐고하여 자궁을 제거하고 자궁 및 자궁 경부 (그림 1B)의 교차점을 가로질러. 자궁을 당겨, 멀리 멤브레인 지방 조직을 장식하고 수란관 (그림 1C)와 접합 아래 자궁 잘라. 60mm 판에서 TS 매체의 작은 볼륨 (0.2 ML)의 uteri (그림 1D)를 놓으십시오. </li><li> 26 게이지 바늘로 1 - ML 주사기를 사용하여 TS 매체 1 ML 각 자궁 경적을 플러시. 자궁의 기본에 바늘을 삽입하고 1 ML의 TS 매체와 새로운 60mm 판으로 천천히 플러시. 자궁이 비정상적으로 증가하고 내리는 동안 완벽하게 확장해야합니다. </li><li> 수집하고 입 제어 피펫을 사용하여 TS 매체를 포함하는 깨끗한 접시에 12 잘 신중하게 blastocysts을 전송. 12 잘 접시에 TS 매체를 통해 직렬 전송으로 blastocysts 세 번 씻으십시오. 37 mitomycin C - 대우 MEF 모이통과 문화를 포함하는 12 잘 플레이트에 잘마다 놓으 blastocyst (그림 2A) ° C, 5 % CO 2. </li><li> blastocysts은 조나 pellucida에서 부화하고 24~36시간에있는 우물에 연결합니다. 작은 가지는 쉽게 일 3 관찰됩니다. 500 μl 신선한 TS 매체 플러스 1X FGF4/Heparin과 문화를 피드. </li><li> 4 ~ 5 일에, blastocyst의 가지는 크기에 따라 disaggregation 준비되어야합니다. TS 세포 disaggregation에 대한 이상적인 크기는 그림 3B의 그림입니다. 0.5 ML PBS로 한 문화를 씻으십시오. 37 오분 ° C, 5 % CO 2 100 ML 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화를 추가합니다. P100의 pipetteman과 함께 적극적으로하고 아래로 pipetting하여 작은 대단히 짧은 시간에 가지 봐라. 잘으로 TS - 70CM - 1.5F4H (30 % TS 매체 70 % MEF - CM 플러스 1.5x FGF4/Heparin)을 추가하여 trypsinization를 중지합니다. disaggregation 후 중간 8 시간 변경하고 모든 이일 세포를 먹이로 진행합니다. </li><li> 일 6 10 (매우 변수) 사이 TS 세포 식민지가 볼 수 있습니다. 그들은 명확한 콜로니 경계 (그림 2C)와 형태와 같은 평면, 상피 시트 수 있습니다. 매 2 일 문화 먹이를 계속 </li><li> TS 세포가 50 % confluency (대개 일 15 20 사이)에 도달하면, PBS로 한번 씻어 100 ML 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. 가까운 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 trypsinization 동안 아래 피펫. mitomycin C - 대우 MEF 모이통 (2.5 X 10 5 cells/6-well 또는 5 X10 5 cells/60mm 플레이트) 포함하는 6 자 또는 60mm 판에서 새로 만들기를 TS - 70CM - 1.5F4H 및 전송을 추가하여 trypsinization를 중지합니다. </li><li> 통로 중간 이후 8 시간 변경 2 일 모든 문화 먹이를 계속합니다. </li><li> MEF 모이통에 하나 또는 두 개 더 구절 (구절 사이 3-5일) 후, TS 세포는 그들없이 교양 수 있습니다. MEFs 훨씬 빠른 trypsinization 후 TS 세포보다 문화 판에 연결되기 때문에, 자기편 요금 이러한 차이는 MEF 모이통에서 TS 세포를 분리하기 위해 이용하실 수 있습니다. 교양 세포를 통과 후, ° C, 5 % CO 2 30 분 37 그들을 품어. 대부분의 MEFs는 판에 연결되며 TS 인구는 현탁액에 남아 있습니다. 새 접시에 뜨는를 전송합니다. 순수한 TS 인구를 얻기 위해 몇 구절이 과정을 반복합니다. </li><li> TS - 70CM - 1.5F4H에서 TS 세포를 유지하고 모든 사일을 패스 (1시 10분에서 1시 20분까지 분할) 또는 때 문화의 70 % confluency에 도달합니다. 고밀도 (1시 5분 분할 이상) 또는 culturing을 지나치게 합류들이 차별의 원인이 될 수있는 세포가 나온다. </li><li> TS 세포의 신분은 세포 마커, Cdx2 (그림 3) immunostaining으로 확인하실 수 있습니다. </li></ol> 냉동 TS 세포 <ol><li> 냉동 중간 (50 % FBS, 30 % TS 매체 20 % DMSO)를 2 배 준비합니다. </li><li> 공동trypsinization로 llect의 TS 세포는, 6 분 450g에서 원심 분리하여 따라갔다. 2X 동결 매체의 동일한 볼륨 TS 매체에서 그들을 Resuspend. </li><li> 천천히 -70에서 이소 프로필 알코올 챔버를 사용하여 세포를 고정 ° C와 24-48시간 후 액체 질소로 전송할 수 있습니다. </li><li> 60mm 판 (합류 70 %) 보통 2 유리병에 보관됩니다. </li></ol> TS 세포를 해동 <ol><li> 신속하게 37 병을 해동 ° C는 (450g, 6 분) 원심 분리 10 ML TS 미디어에서 그들을 수집, 30 % TS 미디어, 70CM - 1.5F4H에 resuspend. </li><li> 세포 중 하나 유리병은 60mm 판에 씨앗을 품고있다. </li></ol> TGC에 TS 세포 분화 trophoblast 거대 세포 (TGCs)에 TS 세포의 분화는 MEF - CM, FGF4 및 헤파린의 철수에 의해 유도된 수 있습니다. TGC 표현형은 (대형 핵) 4 일 유도 후에 감지된 수 있습니다 (다나카 외., 1998 애기 외. 2008). p450scc의 Immunostaining 것은 차별화된 문화에 TGC 마커 (그림 4A)의 표현을 감지합니다. PI의 흐름 cytometric 분석 (propidium 요오드화물의) 스테인드 세포가 더 높은 DNA 내용 (그림 4B)이있는 차별화된 세포의 존재를 보여줍니다. 이러한 결과는 TS 세포가 polyploid TGCs 될 endoreduplication를 받아야하는 것이 좋습니다. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마우스 uteri의 해부. (A) uteri의 위치는 화살표로 표시됩니다. 그림과 같이 (B) 자궁 및 자궁 경부의 교차점을 가로질러. (C) 그냥 난소 (OV) 아래 수란관 (OD) 아래 자궁을 잘라요. uteri의 (D) 이미지. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 대표 사진 마우스 blastocyst, blastocyst의 파생물 및 trophoblast들의 서식지를 보여줍니다. (A) E3.5에서 수집된 마우스 blastocyst가 표시됩니다. ICM, 내부 세포 덩어리, MT, 뮤럴 trophectoderm, PT, 북극 trophectoderm. (B) MEF 모이통에 trophoblast의 파생물이 표시됩니다. TS, trophoblast의 줄기 세포. (C) trophoblast의 줄기 세포 콜로니는 MEF 모이통에 명확한 가장자리를 보여줍니다. 화살표는 셀 경계를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 분석을 immunostaining하여 TS 세포의 식별. TS (AD)과 ES (제어, EH) 세포 마커의 식별이 적용됩니다. 전지는 Oct4 (A, E) 또는 Cdx2 (B, F)을 인식하는 항체와 immunostained하고, 통합 이미지를 제공 DAPI (C, G) (D, H)에 의해 counterstained 있습니다. 스케일 바, 50 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 체외에서 TS 세포의 분화. (A) 문화에 Undifferentiated (Undiff) 또는 차별 (비교) 세포가 TGC 마커의 표현에 대해 검사했다, p450scc (녹색), DAPI (빨간색)와 counterstained. (B) PI 물들일 차별화된 세포의 흐름 cytometric 분석은 DNA의 내용을 (; M2, 개 이상 사본 M1, 2-4 부) 측정합니다. M2 인구 polyploid trophoblast 세포를 나타냅니다.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서는, 우리는 프로세스가 TS 세포 라인을 확립 uteri와 실험 절차에서 E3.5 blastocysts를 수집 보여줍니다. 또한 TS 세포의 stemness를 유지하고 차별화된 세포에 자신의 차별을 유발하는 조건을 설명합니다. 순수 TS 세포 라인을 얻기 위해 두 가지 중요한 단계는 가지의 disaggregation에 대한 타이밍 (9 단계)이며, 첫 번째 통로 (11 단계)를 처리. 그것은 광범위한 blastocyst 단계 11 (Kunath 외., 2005)에 TS 식민지의 9 단계 또는 전면에 자라난 (&gt; 50 % confluency)에서 자라다 후 원시 endoderm - 파생 세포 문화에 발생할 수있는 것으로보고되었습니다. 원시 endoderm - 파생 세포가 TS 세포에 비해 둥근 세포 모양과 감소 세포 - 세포 접촉 자신의 독특한 형태로 확인할 수 있지만 그들은 TS 매체에서 잘 성장하고하지 않기 때문에, 그것은 문화에서 그들을 제거하기가 어렵습니다 MEF 모이통 또는 FGF4을 필요로하는 것 같...

시약 TS 매체 : RPMI - 1640, 20 % FBS, 1 ㎜의 나트륨 pyruvate, 100 MM 베타 - 메르 캅 토 에탄올 100 MG / ML 페니실린 - 스트렙토 마이신. Mitomycin C : 2 ML PBS 2 MG mitomycin C (시그마 M - 0503)을 디졸브 200 ML TS 매체 (10 NG / ML)로이 2 ML 혼합물을 추가합니다. 사용하기 전까지 -20 ° C 20 aliquots (10 ML)과 저장을합니다. 100mm 플레이트 당 한 나누어지는를 추가합니다. 마우스 배아 fibroblast - 조건 매체 (MEF - CM) : 100mm 접시에 플레이트 MEFs (1 × 10 6 / 플레이트). 다음날, 요리 당 10 ML TS 미디어를 추가하고 48 시간 동안 문화를 계속합니다. 그들을 필터 (0.45 ㎜) 35 ML의 aliquots에서 -20 ° C에서 저장, 문화 매체를 수집합니다. 4 저장할 수 있습니다 필요한 각 나누어지는 ° C.를 녹여 MEFs 그들이 합류되기 전에 CM 두 이상 일괄적으로 준비하는 데 사용할 수 있습니다. PBS / BSA : 0.45 mm 주사기 필터를 통해 필터 PBS (10 ML)에 BSA, 분수 V (시그마 A3311, 0.1 % (W / V)를) 디졸브와 1.5 ML 튜브 1 ML aliquots합니다. -70에서 보관 ° C와 FGF4을 준비하는 데 필요한 때 하나 튜브를 녹여. FGF4 (1000x) PBS / BSA 용액 1 ML과 Resuspend 동결 건조된 FGF4 (시그마 F8424, 25 MG). -70에서 잘 섞어 1.5 ML 튜브 및 저장소로 10 aliquots (100 ML)를 만들 ° C. 필요할 경우 각각의 튜브를 해동하고 4 나머지를 저장할 ° C는 다시 냉동하지 않습니다. 1X FGF4을 (25 NG / ML)을 구하는 TS 매체에서 1,000 회 희석. 헤파린 (1000x) 1 최종 농도로 PBS에 Resuspend 헤파린 (시그마 H3149, 10,000 단위) MG / ML (1000x). -70 1.5 ML 튜브와 가게에 100 ML aliquots 만들기 ° C. 해동의 aliquots 필요와 4 나머지를 저장할 ° C는 다시 냉동하지 않습니다. 1X 헤파린 (1 NG / ML)을 구하는 TS 매체 1000 시간을 희석.

blastocysts에서 마우스 trophoblast의 줄기 세포의 유도

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

trophectoderm의 사양은 포유류의 발전의 초기 분화 행사 중 하나입니다. trophectoderm의 mediates 주입에서 파생된 및 trophoblast의 일족이 태반의 태아 부분을 생성합니다. 결과적으로,이 혈통의 개발은 배아 생존을 위해 필수적입니다. 마우스 blastocysts에서 trophoblast 줄기 (TS) 세포의 유도 먼저 다나카에 의해 설명되었다<em&gt; 외.</em&gt; 1998. 적절한 자극 후 무대 및 세포 유형의 특정 마커의 trophoblast 특정 재산과 자신의 표현을 보존하기 위해 TS 세포의 능력은 초기 placentation 이벤트 recapitulating 떨어지던 trophoblast의 혈통 개발을 조사하기 위해 가치있는 모델 시스템을 제공합니다. 또한, trophoblast 세포는 자연 게놈 증폭을받은 몇 체세포 유형 중 하나입니다. trophoblast의 polyploidization를 기본 분자 경로가 해명되기 시작했지만, trophoblast의 게놈 증폭의 생리적 역할과 장점은 크게 어려운 남아 있습니다. 문화 polyploid trophoblast 세포에 diploid의 줄기 세포의 개발이 만들어<em&gt; 예 생체내</em건강과 질병의 게놈 복제 및 불안정성의 규제 메커니즘을 elucidating위한&gt; 시스템은 훌륭한 도구입니다. 여기 애기 출판 수정과 이전의 보고서를 기반으로 한 프로토콜을 설명<em&gt; 외.</em&gt; 2008.

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

영양외배엽(trophectoderm)의 분화 결정은 포유류 발생 과정에서 가장 초기에 일어나는 분화 사건 중 하나입니다. ...에서 유래한 영양막(trophoblast) 계보는...

본 실험 과정의 전반적인 목표는 마우스 배반포로부터 TS 세포를 유도하는 것입니다. 이는 먼저 임신한 마우스에서 자궁각을 분리하고 배반포를 회수함으로써 수행됩니다. 과정의 두 번째 단계는 TS 세포의 성장에 유리한 조건과 메틸레이터(meth feeders) 상에서 배반포를 배양하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 TS 콜로니를 확장하고 결과적으로 meth 피더 없이 TS 세포를 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 줄기세포 특성을 유지하며 TS 세포를 배양하여 동결 보존을 수행하고 영양막 세포 분화를 유도하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 통해 분화되지 않은 TS 세포에서는 영양막 줄기세포 마커인 IE CDX two의 발현을, 영양막 거대 세포로 성숙한 후에는 분화 마커인 IEP four 50 SCC의 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 로체스터 대학 의료 센터(University of Rochester Medical Center) 생의학 유전학과의 Shani Chu입니다. 오늘은 영양막 줄기세포 배양 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 건강한 태반 형성을 위한 영양막의 성장 및 분화와 배외 조직에서의 역할을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 관심 대상인 마우스 간의 교배 교배를 설정하십시오. 다음으로, 공급 세포(feeder cells)로 사용할 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts) ORM을 준비하십시오.배반포 보조 플레이트 수집 2일 전, 100 mm 디쉬에 있는 meth 세포를 다음 날로 준비합니다. 이 meth 세포를 20 µg/mL의 mitomycin C가 포함된 TS 배지 10 mL로 37 °C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 처리합니다. 2시간 후, PBS로 세포를 2회 세척하고 mitomycin C 처리된 meth 세포를 TS 배지 10 mL에 재현탁하여 12-well 플레이트에 분주합니다. 배반포 보조 수집 당일, meth 배양 배지를 1X FGF4-heparin이 추가된 TS 배지로 교체합니다.이제 마우스 자궁에서 배반포 보조 세포를 수집할 준비가 되었습니다. 먼저, 안락사시킨 동물을 등으로 눕히고 피부와 털을 70% ethanol로 닦아냅니다. 다음으로, 측면에 작은 절개를 가하고 피부를 머리 쪽으로 당긴 후, 복부를 노출시키기 위해 복막을 측면으로 절개합니다.복강을 노출시키기 위해 자궁의 위치를 확인합니다. 방광 뒤쪽에 위치한 자궁경부를 포셉으로 잡고 자궁과 자궁경부의 접합부를 가로질러 절단하여 자궁을 제거합니다. 자궁을 끌어당겨 막과 지방 조직을 다듬어 제거합니다.그 다음 난관과의 접합부 아래쪽에서 자궁을 절단합니다. 절단한 자궁을 60 mm 플레이트에 담긴 0.2 mL의 TS 배지에 넣습니다. 이제 1 mL 주사기에 TS 배지 1 mL를 채웁니다.26 gauge 바늘을 장착하고 자궁 한 쪽의 기저부에 바늘을 삽입합니다. 새로운 60 millimeter 플레이트에 천천히 세척액을 흘려보냅니다. 세척하는 동안 자궁은 충분히 팽창되고 완전히 확장되어야 합니다.동일한 방식으로, 마우스 컨트롤 피펫을 사용하여 반대쪽 자궁각을 세척합니다. 배반포를 수집하여 옮깁니다. TS 배지가 담긴 깨끗한 12-well 플레이트로 조심스럽게 옮긴 후, 12-well 플레이트의 TS 배지를 이용한 연속 전송을 통해 배반포를 세 번 세척합니다.웰당 하나의 blast assist를 넣습니다. 37°C, 5% CO₂ 조건에서 mitomycin C로 처리된 meth feeder 배양이 포함된 12웰 플레이트를 사용합니다. blast assist는 24~36시간 이내에 zona lucida에서 부화하여 웰에 부착됩니다.3일째에 작은 돌출부가 쉽게 관찰될 것입니다. 4일 또는 5일째에 500 µL의 신선한 TS 배지와 1X FGF4-heparin을 사용하여 배양액에 공급하십시오. blast assist 돌출부는 크기에 따라 해리 준비가 완료될 것입니다.TSL 해리 시 가장 이상적인 크기가 여기에 예시되어 있습니다. 배양물을 0.5 mL의 PBS로 한 번 세척하십시오. 그런 다음 0.25% trypsin-EDTA 100 µL를 첨가하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 5분 동안 배양하십시오.이제 이 절차에서 가장 중요한 부분인 블라스트(blast)를 분리할 준비가 되었습니다. 다음으로 P 100 피펫을 사용하여 블라스트 보조 성장물을 강하게 파이펫팅하여 작은 덩어리로 분리합니다. 웰에 0.5 mL의 70 cm 1.5 F four H 배지를 첨가하여 트립신화를 중단시키고, 즉시 세포를 배양기로 옮깁니다. 해리 8시간 후에 배지를 교체합니다.6일에서 10일 사이에 이틀 간격으로 세포에 계속해서 배지를 공급합니다. 이 기간은 변동성이 매우 큽니다. TSL 콜로니를 관찰할 수 있습니다.이들은 명확한 콜로니 경계를 가진 평평한 상피 시트 모양의 형태를 보입니다. TS 세포가 보통 15일에서 20일 사이에 50% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 이틀마다 배지를 계속 공급하십시오. PBS로 한 번 세척한 후 0.25% trypsin EDTA 100 microliters를 첨가하고, 트립신 처리 중에 피펫팅을 반복하여 거의 단일 세포 현탁액 상태가 되도록 하십시오.5분 후, 7 mL의 DMEM 1.5 F 4H 배지를 추가하여 트립신 반응을 중단시킵니다. 그다음, 미리 준비한 mitomycin C 처리 meth feeder가 들어 있는 새로운 6-well 플레이트에 세포를 옮기고 37°C, 5% Carbon dioxide 조건에서 배양합니다. 계대 배양 8시간 후에 배지를 교체하고 2일마다 지속적으로 배양액을 공급합니다. meth feeder 위에서 1~2회 더 계대 배양한 후, TSL을 meth feeder로부터 분리하기 위해 feeder 없이 배양할 수 있습니다.배양된 세포를 계대 배양한 후, 37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 30분 동안 배양합니다. trypsin 처리 후 mes는 TS 세포보다 배양 접시에 훨씬 빠르게 부착되기 때문에, 대부분의 mes는 접시에 부착되는 반면 TS 세포군은 부유 상태로 남게 됩니다. 상층액을 새 접시로 옮깁니다.순수한 TS 세포 집단을 얻기 위해 TS 세포를 meth 피더로부터 분리하는 이 과정을 여러 세대 동안 반복합니다. TS cells는 70 cm, 1.5 F four H 배지에서 배양하며, 4일마다 또는 배양 밀도가 70%confluency에 도달했을 때 계대 배양합니다. 마지막으로, 세포 마커의 면역 염색을 통해 TS cells의 정체성을 확인할 수 있습니다.TS 세포를 동결하기 위해, 세포를 수집한 후 450 G에서 6분 동안 원심분리합니다. 세포를 TS 배지와 동일한 부피의 2x 동결 배지에 재현탁하여 cryo vial에 옮깁니다. 보통 70% 정도로 합류된(confluent) 60mm 플레이트의 세포는 2개의 vial에 나누어 보관합니다.-70°C의 이소프로필 알코올 챔버를 사용하여 세포를 천천히 동결합니다. 24~48시간 후에 액체 질소로 옮깁니다. TSL 해동은 바이알을 37°C에서 빠르게 해동하여 수행해야 합니다.haw 세포를 10 mL의 TS 배지가 담긴 15 mL 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 수집된 세포를 70 cm, 1.5 F four H 배지에 재현탁한 후, 각 세포 바이알을 60 mm 플레이트에 분주합니다. TS 세포의 영양막 거대세포(trophoblast giant cells, TGC)로의 분화는 MEC four와 헤파린을 제거함으로써 유도할 수 있습니다. TGC는 핵과 세포체가 비대해져 배양 시 쉽게 식별할 수 있습니다.TGC 표현형은 또한 녹색으로 표시된 TGC 마커 P four 50 SCC와 적색으로 표시된 dappy 대조 염색의 면역 염색을 통해 여기서 관찰된 바와 같이 검출될 수 있습니다. 분화된 세포는 P four 50 SCC를 발현하는 반면, 분화되지 않은 세포는 이를 발현하지 않습니다. propidium iodide로 염색된 분화 세포의 유세포 분석 결과, DNA 함량이 더 높게 나타났으며 M1은 2~4개의 복제본을, M2는 4개 이상의 DNA 복제본을 나타냅니다.이러한 결과는 TSL이 endo reduplicating 과정을 거쳐 M two 집단으로 대표되는 다배체 TCS가 됨을 시사합니다. 우리는 blast, ptosis를 수집하고, blast, ptosis로부터 마우스 TS 세포를 유도하는 방법을 보여드렸습니다. TSL 라인을 구축할 때 outgrowth를 주의 깊게 관찰하여, 배양 조건에서 다능성이 유지되는지 확인하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜 세부 마우스 배아의 줄기 세포 (ESC)와 lethally 조사받는 마우스에 그들의 이후의 주입에서 transplantable 조혈 줄기 세포의 유도. 간단히, ESC는 다음 retroviral HoxB4 및 OP9 stromal 세포와 조혈 크린 시토킨 공동 양식에 감염된 embryoid 단체로 구별됩니다.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

자기 갱신과 신체의 모든 세포 유형으로 차별화하는 인간 배아 줄기 세포의 능력은 그들이 모두 의료 어플 리케이션을위한 개발과 질병의 근본적인 질문을 해결하기위한 연구 도구로 큰 약속을 개최하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 내부 세포 질량 immunosurgical 절연에 의해 배아에서 인간 배아 줄기 세포의 유도에 대한 간결한, 단계별 절차를 제공합니다.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

초기 개발 단계 동안 원시 종자 세포로 차별화하는 배아 새싹 세포의 능력은 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델​​입니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시 coitum 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

배반포와 같은 세포를 효율적으로, 시기 적절하고, 순차적으로 생성하는 인간 블라스토이드의 형성을 요약하는 프로토콜.

인간 배반포 모델링 배반포 개발 및 이식을 위한 프로토콜

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

배우세요 마우스 블라스토시스트에서 영양막 줄기세포(TS cells)를 유도하고 배양하는 방법을. 이 기술은 태반 발달 및 줄기세포 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

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