Name: 에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 정량 리얼타임 PCR을 사용하여 Agrilus planipennis 유충 조직 및 발달 단계에서 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 해충 관리 전략 수립에 필수적인 분자 생물학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 실험의 설정에 루르드 델타 Arrueta Antequera (곤충학학과, 오하이오 주립 대학 / OARDC, 우스터, OH)에서 제공하는 도움말을 인정합니다. 우리는 EAB 애벌레 샘플을 보내 박사 테레사 폴란드 (USDA, 포레스트 서비스, NRS) 감사합니다. 현미경 설치가 평가됩니다 박사와 루이스 카나스 및 Nuris M 아코 스타가 제공하는 데 도움이됩니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 오하이오 농업 연구 개발 센터, 오하이오 주립 대학에 appropriated 주 및 연방 기금에 의해 제공되었다.

다른 단계를 완료 프로토콜은 그림 1의 플로우 차트에 그려져 있습니다. 절개를 구성 각 단계는, RNA 추출, 첫 스트랜드 cDNA 합성과 qRT - PCR은 아래 내용입니다. I. 애벌레의 해부 <ol><li> 이 절차의 시작, 장소 에메랄드 애쉬 송곳 또는 EAB, 젖은 티슈에 애벌레하기 전에 해부이 수행되기 전까지는. 신선한 1X 인산염은 절개를 통해 버퍼 추위를 유지하는 얼음, 또는 PBS, 생리 버퍼 유지. </li><li> 시작하려면, 미세 절개 핀과 해부 접시에 EAB 애벌레를 수정. 그 다음 해부 접시에 차가운 1X PBS를 추가합니다. </li><li> 첫째, 해부 가위의 벌금 쌍을 함께 애벌레 목을 벨. 이후 애벌레의 마지막 복부 세그먼트를 제거합니다. </li><li> 포셉의 시계 제조인 쌍을 사용하여 애벌레 시체에서 표피를 리프트. 그런 다음 가위를 사용하여 시체의 길이를 따라 절개합니다. 절개가 만들어으로 파열 창자를 안됩니다. </li><li> 조심스럽게 등 지방 기관 및 결합 조직 등 다른 조직에서 midgut 조직을 분리. 그런 다음, fatbody에 대한 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 신선한 1X PBS 버퍼에있는 조직을 씻어. 1.5 ML eppendorf 튜브에 미리 냉장 Trizol 시약 500 μL에 격리​​ midgut을 전송합니다. </li><li> 다음, 집게를 사용하여 지방 신체 조직을 분리하고 냉장 Trizol 시약 500 μL를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브에 그것을 전송합니다. </li><li> 마지막으로, 조직 무결성을 손상하지 않도록 돌봐 모든 준수 조직을 scrapping하여 애벌레 시체의 표피 조직을 분리. 신선한 PBS 버퍼에 고립 표피 조직을 씻어 차게 Trizol 시약 500 μL와 1.5 ML eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 절연 지방 몸, 표피 및 midgut 조직은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C까지 RNA 추출은. </li><li> RNA 추출을위한 준비에서 발달 단계에 따라 다양한 EAB 샘플을 정렬합니다. 이러한 단계가 1 일, 2 -, 3 -,, 4 - instars, prepupae과 성인을 포함합니다. </li></ol> II. RNA 추출 (Trizol 시약을 사용하는 제조 업체마다의 프로토콜로) 균질화 <ol><li> RNA 추출을 시작하려면 먼저 Trizol 포함 1.5 ML eppendorf 튜브에 조직을 균질로 플라스틱 pestles를 사용합니다. 균질 후, Trizol 시약 각 샘플의 to1 ML의 전체 볼륨을 가지고. </li><li> 발달 단계에 대한, 박격포와 유봉과 액체 질소로 전체 동물을 균질. 다음 Trizol 1 ML에 homogenate의 나누어지는 (50 μg)을 추가합니다. </li></ol> 단계 분리 : <ol start="3"><li> 실온에서 15 분 동안 한 ML의 Trizol로 샘플 튜브를 품어. </li><li> 부화 후, 각각의 튜브에 클로로포름의 200μL를 추가합니다. 즉시 클로로포름을 추가한 후, 약 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들. 그런 다음, 추가 2~3분을위한 실내 온도에서 튜브를 품어. </li><li> 다음, 2 ° C.에 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 원심 분리 후, RNA의 수성 단계있을 것입니다. 수성 단계의 볼륨을 600 μl, 또는 전체 Trizol 볼륨의 60 %되어야합니다. </li></ol> RNA 침전 <ol start="6"><li> 조심스럽게만을 수성 단계를 제거합니다. 수성 단계 아래의 물질의 존재는 압축을 푼 RNA의 오염을 초래하게됩니다. 그런 다음, 적절하게 표시 1.5 ML eppendorf 튜브에 수성 단계를 전송합니다. </li><li> , 수성 단계에서 RNA를 침전 각 튜브에 이소 프로필 알코올의 0.5 ML를 섞어합니다. 10 분 상온에서 샘플을 품어. 부화 후 2 ° C. 10 분 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기 </li></ol> RNA 와시 <ol start="8"><li> 원심 분리 후, 튜브의 표면에 뜨는를 삭제. RNA는 튜브의 아래쪽에 형성 겔형 펠렛에 속해 있습니다. Trizol 1 ML 당 75 % 에탄올의 최소 1 ML 추가, 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. vortexing하여 섞는다. 그런 다음, 2 ° C.에서 5 분 7500Xg에서 튜브를 원심 분리기 </li></ol> RNA 용리 <ol start="9"><li> 튜브의 표면에 뜨는 폐기하십시오. 1 분 작은 테이블 원심 분리기에 다시 튜브를 원심 분리기. 주의 pipetting하여 관에서 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 열어두고 50~10분을위한 펠릿 공기가 건조 보자. 이것은 크게는 용해도가 감소하므로 위에 펠릿 건조하지 않도록주의하십시오. </li><li> 공기 건조 후의 펠렛 resuspend <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> 또는 DEPC, 처리 물. 펠렛을 resuspend하는 데 사용되는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. SM에 대한 DEPC 처리 물의 50 μL를 사용하여큰 펠렛 모든 펠릿 또는 100 μL. 펠렛 완전히 여러 번 다운 피펫 팁을 이동하고하여 DEPC 처리된 물에 용해 보자. </li><li> 펠렛가 해산되면 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 넣으십시오. </li><li> 그런 다음, Nanodrop 분광 광도계 (RNA 샘플 2 μL)를 사용하여 각 RNA 샘플의 농도를 측정합니다. </li><li> -80에서 RNA 샘플을 보관 ° C 이상 사용까지. </li></ol> III. 첫 스트랜드 cDNA 합성 (Invitrogen에서 윗첨자 첫번째 스트랜드 합성 키트를 사용하여 제조 업체마다의 프로토콜로.) <ol><li> 각 RNA 샘플에 대해 PCR 튜브에 다음을 추가 : <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> X μl </td></tr><tr><td> 10mM dNTP 혼합 M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (DT) (0.5 μg / μl) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC 물을 치료 </td><td> (8 - X) μl </td></tr><tr><td> 총 볼륨 : </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> 참고 : x는 cDNA 합성에 사용되는 RNA의 볼륨입니다. RNA의 농도에 따라 RNA로부터 2-3 μg 각 반응에 사용되며 각 반응의 총 부피 10 μl해야합니다. </td></tr></tbody></table></li><li> 4 분간 65 thermocycler에 위의 반응 믹스 ° C를 놓습니다. </li><li> theromocyler에서 튜브를 제거하고 최소한 2 분 동안 즉시 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 다음을 추가하여 첫 스트랜드 마스터 믹스를 준비 : <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RT 버퍼 </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNase 아웃 </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table></li><li> RNA 샘플을 포함하는 각각의 튜브, pipeting로 섞어 마스터 믹스 9 μl를 추가하고 혼합 잠시을 원심 분리기. </li><li> thermocycler에 다시 튜브를 삽입하고 42 ° C. 2 분 동안 품어 </li><li> 일시 thermocycler를 각 튜브에 윗첨자 II 반대 transcriptase 효소 (Invitrogen) 1 μl를 추가합니다. 이 단계는 신속하게 완료되어야합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 70 반응 ° C 15 분 동안을 종료할 수 있습니다. </li><li> thermocycler에서 튜브를 제거하고 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 각각의 튜브에 RNase H 1 μl를 추가하고 37 thermocycler에 다시 자리 ° C를 20 분. </li><li> thermocycler의 샘플을 복용 후, 각각의 튜브에 nuclease 무료 물을 20 μl를 추가합니다. 각 샘플의 볼륨이 단계에서 두 배가됩니다. </li><li> 샘플 2 μl를 사용하여 각 시료의 농도를 확인합니다. qRT - PCR에 사용하기 위해 20ng/μl의 농도를 만들기 위해 각 샘플의 나누어지는 가져가라. 20ng/μl의 농도에 샘플을 만들어 물의 양은 합성 cDNA의 초기 농도에 따라 달라집니다. </li></ol> IV. qRT - PCR : 참조 유전자의 프라이머 설계 및 결정 <ol><li> 60 ° C와 ~ 100bp의 제품 크기의 녹는 온도 (TM)와 함께 디자인 primers. </li><li> AP - PERI1이 실험에 대한 관심의 유전자로 사용됩니다. 참조 유전자 또는 내부 통제는 데이터의 저장 분석과 정상화를 위해 필요합니다. Ribosomal 단백질 (AP - RP1)은 본 실험에 대한 참조 유전자로 사용됩니다. </li><li> 참조 유전자를 포함하는 데 사용됩니다 primers의 5uM 작업 주식을 준비합니다. </li></ol> 표준의 준비 <ol start="4"><li> 기준하여야한다 사용되는 primers의 효율성을 계산하기 위해서는. </li><li> 테스트하게 될 다양한 샘플로부터 cDNA를 혼합합니다. </li><li> 그래프의 각 원하는 포인트 5 배 시리얼 dilutions하십시오. 네 dilutions 충분해야하지만, 그 다섯도 매우 좋습니다. </li><li> 볼륨 얼마나 많은 지점과 얼마나 많은 기술 복제에서 사용중인 따라 달라집니다. 충분히 참조 유전자를 포함하여 테스트하고 각 유전자에 대한 표준을 만들기 위해이 있어야합니다. </li></ol> 플레이트 템플릿 <ol start="8"><li> qRT - PCR 플레이트의 각 잘 대해 샘플의 이름을 나타내는 템플릿을 디자인합니다. 각 유전자에 대한 기준과 적어도 두 기술은 샘플 당 복제를 포함하는 것을 잊지 말아주세요. </li></ol> 자전거 매개 변수를 설정 <ol start="9"><li> 에 qRT - PCR 기계를 켜고 자전거 매개 변수를 입력합니다. 다음과 같이 실험 자전거 매개 변수는 다음과 같습니다 1 단계 : <ul><li> 1 사이클 : 95 ° C 3 분 </li></ul> 2 단계 : <ul><li> 40주기 : 95 ° C 15 초 60 ° C 30 초 뒤에 (옵션 : 녹는 곡선을 결정하기위한 다음 단계를 포함) </li></ul>3 단계 : <ul><li> 1 사이클 : 95 ° C 1 분 </li></ul> 4 단계 : <ul><li> 1cycle : 55 ° C 1 분 </li></ul> 5 단계 : <ul><li> 81주기 : 55 ° C 30 초 </li></ul></li></ol> 플레이트는 CFX96 (BioRad) 기계 설정 <ol start="11"><li> 별도의 튜브에서 각 유전자 (참조 유전자를 포함)에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 잘 들어, 마스터 혼합으로 구성되어 있습니다 <table border="0"><tbody><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2.5 X SYBR 녹색 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 앞으로 프리머 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 프라이머 역방향 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> μl 8 </td></tr></tbody></table></li><li> 준비하는 동안 마스터 믹스 pipetting 오류에 대한 계정을 1-2 여분의 반응을 포함합니다. </li><li> 이전에 설계 템플릿에 따르면, 2 μL를 (20 μL / NG) 각 잘하는 cDNA의 추가할 수 있습니다. 그런 다음, 반응 당 10 μL의 총 볼륨의 결과, 각 잘하는 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다. </li><li> 샘플 잘 혼합되어 있는지 확인까지 피펫 아래 (2 배). 어떤 액체가 끝에 숙박 없다는 것을 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플에 대한 새 팁을 사용합니다. </li><li> 전체 플레이트가 설치되면 광학 테이프로 번호판을 커버. 그리스의 존재가 읽기에 영향을 미칠 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그런 다음, 우물의 모든 제품 판의 하단에되는 것을 보장하기 위해 1 분 500 RPM에서 번호판을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 접시의 바닥에 얼음도 물도 없다는 것을 확인하십시오. 마지막으로, qRT - PCR 기계에있는 접시를 놓고 PCR 프로그램을 실행합니다. </li></ol> 실험의 V. 도표 표현 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 플로우 차트는 유전자 발현 연구를위한 단계의 순서를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 중간에 midgut를 보여주는) 애벌레 EAB의 해부. 애벌레 EAB의 B) 절연의 midgut <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : A) 표피 (잘라내기), midgut (MG) ​​및 지방 단체 (FB)를 포함해 다른 애벌레 조직에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질은 (이하라는, AP - RP1) 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 애벌레 조직에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. 표피 조직은 최소한 표현을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X) 샘플 (Pfaffl, 2001)로 찍은 거죠. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : A) 애벌레 instars (제 1, 2, 3, 4), prepupae (PP)와 성인 (A)를 포함한 EAB의 다른 발달 단계에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질 (AP - RP1)이 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 다양한 발달 단계에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. PP 샘플은 mRNA 수준의 최소 수준을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X 샘플)로 찍은 거죠. VI. 결론 정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 또한, qRT - PCR은 대부분 같은 microarrays 및 차세대 RNA - Seq으로 높은 처리량 유전자 발현 분석에서 생성된 데이터의 유효성을 검사하는 핵심 도구를했습니다.

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

임계값주기 (CT)이 값은 qRT - PCR 플레이트의 각 샘플에 대해 얻을 수 있습니다. 표준 곡선을 만들기위한 각 희석에 대해 얻은 CT 값은 그 농도의 로그 역모를 꾸몄다했다. 실험 샘플에 대한 CT 값은 다음이 희석 시리즈 표준 곡선에 꾸몄다했다. 목표 수량은 각 실험 즉, 조직 발달 표현에 대해 생성된 별도의 표준 곡선으로부터 계산되었다. 상대 표현식 값 (REVs) 다음 내부 통제를 위해 얻은 수량 (AP - RP1)와 관심의 대상 시퀀스의 수량을 (이 경우 AP - PERI1)를 나눔으로써 결정되었다. 중요성의 계산은 각 유전자에 대한 REVs의 로그는 SAS (SAS 연구소 주식 회사 SAS / STAT 사용자 안내서, 버전 9.1)의 PROC 혼합 절차를 사용하여 ANOVA (분산 분석)에 의해 분석되었다. 표현 수준에서 의의는 P &lt;0.05로 결정되었다. 조직의 경우 상대 접어으로 변경되며, 변경된 사항은 캘리 브 레이터 (1X 샘플, Pfaffl, 200...

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 pcr

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

에메랄드 애쉬 송곳 (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;)하면 애쉬 나무의 수백만을 죽인이있는 이국적인 침입 해충 (수 있습니다<em&gt; Fraxinus</em&gt; 종) 북미 인치<strong&gt;</strong&gt; EAB는 빠른 속도로 확산 계속해서 공격은 성숙 나무 묘목에서 다른 연령층의 나무 재가. 그러나, 거의 날짜 또는 어떤 분자 지식 EAB을 위해 존재하지. 우리는 조직 수준에서 분자 기반의 생리 과정을 해독에 관심이있다 애쉬 나무의 성공적인 식민지의 원조 EAB. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 티슈 (midgut, 지방 기관 및 표피 포함) 및 다른 발달 단계 (1과 같은 확인할 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR의 효과적인 사용 (qRT - PCR)을 표시<sup&gt; 일</sup&gt; - 2<sup&gt; 차</sup&gt; - 3<sup&gt; 차</sup&gt; - 4<sup&gt; 일</supEAB의&gt; - instars, prepupae 어른). 예를 들어, peritrophin 유전자 (이하라는,<em&gt; AP - PERI1</em&gt;)는 관심의 유전자와 ribosomal 단백질 (로 exemplified입니다<em&gt; AP - RP1</em&gt;) 내부 통제로. Peritrophins은 곤충 장의 내벽입니다 peritrophic 멤브레인 / 매트릭스 (PM)의 중요한 구성 요소입니다. PM은 소화 및 midgut의 상피에 기계적 보호 등 다양한 기능이 있습니다.

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

물푸레나무하늘소(EAB, Agrilus planipennis)는 외래 침입 해충으로, 북미의 수백만 그루의 물푸레나무(Fraxinus spp)를 고사시켰습니다. 물푸레나무하늘소는...

다음 실험의 전반적인 목적은 quantitative PCR을 사용하여 emerald ash Borer의 조직 및 발달 단계별 유전자 발현을 분석하는 것입니다. 이는 유충 조직의 해부와 발달 단계의 분류를 통해 수행됩니다. 두 번째 단계로, triol 시약을 사용하여 조직과 발달 단계에서 RNA를 추출하며, 이를 템플릿으로 사용하여 첫 번째 가닥인 cDNA를 생성합니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성이 완료된 후, quantitative RT-PCR을 수행합니다.사이클 임계값(cycle threshold values)에서 얻은 전체 변화 데이터를 기반으로, 다양한 유충 조직 및 발달 단계에서 표적 유전자의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻습니다. 정량적 R-T-P-C-R 증폭 후의 과정입니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 곤충학과의 연구 책임자인 Prakash Mi입니다.저희 연구실은 주로 물푸레나무잎좀(emerald ash borer)과 물푸레나무 사이의 유전체적 또는 분자적 상호작용을 연구합니다. 물푸레나무잎좀(EAB)은 중국에서 유입된 외래 침입 해충으로, 북미 전역의 물푸레나무 개체군 존립을 위협하고 있습니다. 오늘은 qPCR 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 EAB의 유전자 발현 분석을 학습하는 프로토콜을 보여드리겠습니다.이 프로토콜에 참여할 연구실 구성원은 val 해부를 담당할 Swapna pri ou, RNA 분리를 시연할 bin Bandari, 그리고 마지막으로 qPCR 분석을 살펴볼 Lauren Rivera Vega입니다. 저희 연구실에서는 ash의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, emerald ash B 또는 EAD 유충을 젖은 조직지에 놓아 둡니다. 해부를 수행할 때까지 1x 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS를 신선하게 준비하여 얼음 위에 보관함으로써 해부 과정 내내 버퍼가 차갑게 유지되도록 합니다.먼저, 미세 해부 핀을 사용하여 해부 접시 위에 EAB 유충을 고정합니다. 그다음 해부 접시에 차가운 1x PBS를 첨가합니다. 먼저 미세 해부 가위로 유충의 머리를 절단합니다.그 다음, 시계 제작용 핀셋을 사용하여 유충의 마지막 복부 마디를 제거합니다. 유충 사체에서 큐티클을 들어 올린 후, 가위를 사용하여 사체의 길이를 따라 절개합니다. 이때 장이 파열되지 않도록 주의

analysis-gene-expression-emerald-ash-borer-agrilus-planipennis-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microarray 분석은 유전자 표현의 프로필을 결정하기 위해...

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

우리가 사용하는 프로토콜을...

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

RNA-Seq 분석은 비모델 유기체에서 적응 형질의 분자 토대를 식별하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에서는 모기 사육에서 RNA 염기서열 분석 및 RNA-Seq 데이터의 생물정보학 분석에 이르기까지 diapause와 non-diapause Aedes albopictus 모기 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

이 프로토콜은 효과적인 지자기장(GMF)의 역전이 차등 유전자 발현을 유도하고 애기장대 탈리아나의 형태를 변경한다는 가설을 테스트하는 방법을 설명합니다. Helmholtz 코일 쌍의 3축 팔각형 시스템을 사용하여 식물 성장 챔버에서 역전된 GMF 조건을 인위적으로 생성했습니다.

자기장 (GMF)과 식물 진화 : GMF 반전의 효과에 대한 조사<em&gt; 애기 장대</em&gt; 개발 및 유전자 발현

유치 하 고 에메랄드 색 재 송곳 (EAB) 캡처 효과적인 함정 탐지 하 고 침입 해충 관리의 핵심 요소입니다. 이층 트랩, 재 나무 근처의 전체 태양에 시각과 후 각 신호를 통합 했으며 현장 실험에서 다른 함정 디자인 보다 EAB를 캡처할 가능성이 매우 높습니다.

에메랄드 색 재 송곳의 조기 발견을 위한 이층 트랩을 구축

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

진딧물 진딧물 nerii 벌레 가족 (Apocyanaceae)에 높은 방어 식물에 colonizes 고 식물 곤충 상호 작용을 공부 하는 수많은 기회를 제공 합니다. 문화, 그리고 생성 및 분자의 분석 및 진딧물의 유지 보수에 대 한 프로토콜의 시리즈 제시 하는 여기, 그리고 A. nerii에 대 한-omic 데이터.

생물 학적 문화와 진딧물 nerii에 유전자 발현 측정 유지: 식물 곤충 상호 작용에 대 한 비-모델 시스템

우리는 곤충 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 면역형광 및 정량적 PCR 방법을 기술한다. 면역형광 프로토콜은 바이러스 및 벡터 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 정량적 PCR 프로토콜은 전체 화이트플라이 바디 및 바이러스 감염 식물에서 바이러스를 정량화하기 위해 확장될 수 있다.

면역형광 및 정량적 PCR에 의한 화이트플라이 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화

이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

배우세요 정량 리얼타임 PCR을 사용하여 Agrilus planipennis 유충 조직 및 발달 단계에서 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 해충 관리 전략 수립에 필수적인 분자 생물학 연구에 활용됩니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

더 많은 동영상 탐색