에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

다음 실험의 전반적인 목적은 정량적 PCR을 사용하여 emerald ash Boer의 조직 및 발달 단계별 유전자 발현을 분석하는 것입니다. 이는 유충 조직의 해부와 발달 단계의 분류를 통해 이루어집니다. 두 번째 단계로, triol 시약을 사용하여 조직과 발달 단계에서 RNA를 추출하며, 이는 첫 번째 가닥인 cDNA를 생성하기 위한 템플릿으로 사용됩니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성이 완료된 후, 정량적 RT-PCR을 수행합니다.

사이클 임계값(cycle threshold values)에서 얻은 전체 변화 데이터를 바탕으로, 다양한 유충 조직 및 발달 단계에서 표적 유전자의 차등 발현을 보여주는 결과가 도출되었습니다. 이는 정량적 R-T-P-C-R 증폭 후에 얻은 결과입니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 곤충학과 이 실험실의 책임연구원(PI)인 Prakash Mi입니다.

우리 연구실은 주로 물푸레나무좀(emerald ash borer)과 물푸레나무 사이의 유전적 또는 분자적 상호작용을 연구합니다. 물푸레나무좀(EAB)은 중국에서 유입된 외래 침입 해충으로, 북미 전역의 물푸레나무 개체군의 생존을 위협하고 있습니다. 오늘은 qPCR 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 물푸레나무좀의 유전자 발현 분석을 학습하는 프로토콜을 보여드리겠습니다.

본 프로토콜에 참여하는 실험실 구성원은 발 dissection을 수행할 Swapna pri ou, RNA isolation 과정을 보여줄 bin Bandari, 그리고 마지막으로 qPCR 분석을 담당할 Lauren Rivera Vega입니다. 또한, 저희 실험실에서는 물푸레나무의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 본 실험 절차를 시작하기 전에, 에메랄드 애쉬 보어(emerald ash B) 또는 EAB 유충을 젖은 티슈 페이퍼 위에 올려둡니다. 해부가 수행될 때까지, 해부 과정 전반에 걸쳐 버퍼의 낮은 온도를 유지할 수 있도록 갓 준비한 1x 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS를 얼음 위에 보관하십시오.

먼저, 미세 해부 핀을 사용하여 EAB 유충을 해부 접시에 고정합니다. 그런 다음 해부 접시에 차가운 1x PBS를 추가합니다. 먼저 미세 해부 가위로 유충의 머리를 제거합니다.

그 후, 시계 정밀 핀셋을 사용하여 유충의 마지막 복부 마디를 제거합니다. 유충의 사체에서 큐티클을 들어 올린 다음, 가위를 사용하여 사체의 길이를 따라 절개합니다. 이때 장이 파열되지 않도록 주의하십시오.

절개 시 지방체 및 결합 조직과 같은 다른 조직으로부터 중장 조직을 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음, 지방체 오염이 없는지 확인하기 위해 신선한 1X PBS 버퍼로 조직을 헹굽니다. 분리한 중장을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 미리 냉장 보관한 500 µL의 triol 시약으로 옮깁니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 지방체 조직을 분리한 후 500 µL의 냉각된 triol 시약이 들어 있는 1.5 mL 엔도르프 튜브(end orph tube)로 옮깁니다. 마지막으로, 유충 사체에서 부착된 조직을 긁어내어 큐티클 조직을 분리합니다. 이때 조직의 무결성이 손상되지 않도록 주의하십시오.

분리된 큐티클 조직을 신선한 PBS 버퍼로 헹군 후, 500 µL의 냉각된 triazole 시약이 들어 있는 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 분리된 지방체 큐티클 및 중장 조직은 RNA 추출 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. RNA 추출을 준비하기 위해, 다양한 EAB 샘플을 발달 단계별로 분류합니다.

이 단계들은 별, PrepU 및 성체의 1단계, 2단계, 3단계 및 4단계를 포함합니다. RNA 추출을 시작하려면, 먼저 플라스틱 페스틀을 사용하여 1.5 milliliter einor 튜브 내의 triol에 담긴 조직을 균질화하십시오. 균질화 후, triol 시약을 사용하여 각 샘플의 총 부피를 1 milliliter로 맞추십시오.

발달 단계의 경우, 액체 질소를 이용해 절구와 절구공이로 개체 전체를 균질화합니다. 그 후 균질화액의 일정량을 1 mL의 triol에 첨가합니다. 샘플 튜브를 1 mL의 triol과 함께 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 클로로포름을 첨가한 즉시 각 튜브에 200 µL의 클로로포름을 추가합니다. 튜브를 약 15초 동안 격렬하게 흔들어 줍니다. 그 후 튜브를 실온에서 2~3분 동안 추가로 배양합니다.

다음으로, 샘플을 2 °C에서 12,000 GS로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 RNA는 수성층에 위치하게 됩니다. 수성층의 부피는 600 µL 또는 전체 triol 부피의 60%여야 합니다.

수층만을 조심스럽게 제거하십시오. 수층 아래에 물질이 남아 있으면 추출된 RNA가 오염될 수 있습니다. 그런 다음, 수층을 적절하게 라벨링된 1.5 milliliter einor tube로 옮기십시오.

수성상 혼합물에서 RNA를 침전시키기 위해, 각 튜브에 0.5 milliliters의 이소프로판올을 혼합합니다. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 2 °C에서 12,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브에서 S natin을 제거합니다.

RNA는 튜브 바닥에 형성된 겔 형태의 펠렛에 존재합니다. 75% ethanol로 펠렛을 세척하며, 혼합액 1 mL당 적어도 1 mL의 75% ethanol을 첨가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 그 다음, 2 °C에서 7,500 G로 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.

튜브에서 상청액을 제거하십시오. 소형 테이블 원심분리기를 사용하여 튜브를 다시 1분 동안 원심분리하십시오. 정밀한 피펫팅을 통해 튜브 내의 과량의 상청액을 제거하십시오.

튜브를 열어 둔 상태로 펠렛을 5분에서 10분 동안 공기 건조시킵니다. 펠렛을 과하게 건조하면 공기 건조 후 용해도가 현저히 떨어지므로 주의하십시오. 펠렛을 dathyl percarbonate 또는 dep sea 처리된 물에 다시 현탁합니다.

펠렛을 재현탁하는 데 사용하는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. 작은 펠렛에는 50 µL의 dep sea 처리수를 사용하고, 큰 펠렛에는 100 µL를 사용하십시오. 피펫 팁을 여러 번 위아래로 움직여 펠렛이 dep sea 처리수에 완전히 용해되도록 합니다.

펠렛이 모두 용해되면, 시료를 55 °C에서 10분 동안 둡니다. 그런 다음 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 각 RNA 시료의 농도를 측정합니다. 마지막으로, RT-PCR용 Invitrogen SuperScript first strand synthesis system을 사용하여 해당 RNA 시료들에 대해 1차 가닥 cDNA 합성을 수행합니다.

이 절차는 본 프로토콜의 서면 부분에서 확인할 수 있습니다. 정량적 실시간 PCR 또는 Q-R-T-P-C-R을 시작하려면, 각 프라이머의 어닐링 온도가 60 °C가 되고 산물 크기가 약 100 base pairs가 되도록 설계하십시오. 본 실험에서는 AP par one을 표적 유전자로 사용합니다.

이후 데이터 분석 및 정규화를 위해 참조 유전자 또는 내부 대조군이 필요합니다. 여기서는 리보솜 단백질 a P RRP one을 참조 유전자로 사용합니다. 다음으로, 각 웰의 샘플 이름과 QR tpcr 플레이트를 표시하는 템플릿을 설계하십시오.

각 유전자에 대한 표준 시료와 샘플당 최소 두 개의 기술적 반복 시료(technical replicates)를 포함해야 함을 기억하십시오. 그런 다음 QRT PCR 기기를 켜고 사이클 매개변수를 입력하여 CFX 96 기기의 플레이트를 설정하십시오. 먼저, 각 웰에 사용할 유전자별 마스터 믹스를 별도의 튜브에 준비하십시오.

마스터 믹스는 nuclease free water 2 µL, 2.5 x cyber green 4 µL, 정방향 프라이머(primer forward) 1 µL 및 역방향 프라이머(primer reverse) 1 µL로 구성되어 총 부피는 8 µL가 됩니다. 이전에 설계된 템플릿에 따라 각 웰(well)에 cDNA 2 µL를 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 마스터 믹스 8 µL를 추가하여 반응당 총 부피를 10 µL로 맞춥니다. 샘플이 잘 섞이도록 피펫팅(pipette up and down)을 수행합니다.

팁에 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플마다 새 팁을 사용하십시오. 플레이트 전체의 셋업이 완료되면, 광학 테이프로 플레이트를 덮습니다.

그리스 성분이 측정값에 영향을 줄 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그 다음, 원심분리 후 웰 내의 모든 생성물이 플레이트 바닥에 위치하도록 플레이트를 500 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 플레이트 바닥에 얼음이나 물이 없는지 확인하십시오.

마지막으로, 플레이트를 QR TPCR 기기에 넣고 유충 EAB의 대표 결과에 해당하는 PCR 프로그램을 실행합니다. 여기에서는 해부 및 QR TPCR 과정이 표시됩니다. EAB 유충을 해부하면 유충 중앙의 중장이 드러나야 합니다.

여기에서 보여주는 바와 같이 EAB 유충의 중장을 분리하였으며, 평균 상대적 발현값(RAV)을 나타냅니다. 큐티클, 중장, 지방체 등 서로 다른 유충 조직에서의 파라트로핀 유전자 AP par one의 발현 결과가 여기에 표시되어 있습니다. 데이터 정규화를 위한 내부 대조군으로는 EAB 특이적 리보솜 단백질 ARP one이 사용되었습니다.

다양한 유충 조직에서 AP AP par one의 상대적 배수 변화량을 추출하였습니다. 큐티클 조직에서 발현량이 가장 적게 나타났으며, 따라서 이를 EAB의 1령, 2령, 3령 및 4령 유충을 포함한 서로 다른 발달 단계에서 AP Perry one의 보정 시료 평균 RV로 설정하였습니다.

PrepU와 성체 데이터의 정규화를 위해 aprp one을 내부 대조군으로 사용하여 분석하였습니다. 다양한 발달 단계에 따른 AP Perry one의 상대적 배수 변화(relative fold change)를 측정하였습니다. 분석 결과, PrepU 샘플에서 mRNA 수준이 가장 낮게 나타나 이를 보정군(calibrator)으로 설정하였습니다.

지금까지 측면 해부 방법과 더불어, 정량적 R-T-P-C-R을 사용하여 Emeral ra의 다양한 발달 단계 및 측면 부위의 유전자 발현 분석을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 해부 과정에서 조직 샘플 간의 교차 오염이 발생하지 않도록 주의해야 합니다. 또한, Q-R-T-P-C-R 수행 시 각 샘플을 해당하는 PCR 웰에 정확히 피펫팅하도록 주의를 기울여야 합니다.

이상입니다. 저희 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.