Name: 에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 정량 리얼타임 PCR을 사용하여 Agrilus planipennis 유충 조직 및 발달 단계에서 유전자 발현을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 해충 관리 전략 수립에 필수적인 분자 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 실험의 설정에 루르드 델타 Arrueta Antequera (곤충학학과, 오하이오 주립 대학 / OARDC, 우스터, OH)에서 제공하는 도움말을 인정합니다. 우리는 EAB 애벌레 샘플을 보내 박사 테레사 폴란드 (USDA, 포레스트 서비스, NRS) 감사합니다. 현미경 설치가 평가됩니다 박사와 루이스 카나스 및 Nuris M 아코 스타가 제공하는 데 도움이됩니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 오하이오 농업 연구 개발 센터, 오하이오 주립 대학에 appropriated 주 및 연방 기금에 의해 제공되었다.

다른 단계를 완료 프로토콜은 그림 1의 플로우 차트에 그려져 있습니다. 절개를 구성 각 단계는, RNA 추출, 첫 스트랜드 cDNA 합성과 qRT - PCR은 아래 내용입니다. I. 애벌레의 해부 <ol><li> 이 절차의 시작, 장소 에메랄드 애쉬 송곳 또는 EAB, 젖은 티슈에 애벌레하기 전에 해부이 수행되기 전까지는. 신선한 1X 인산염은 절개를 통해 버퍼 추위를 유지하는 얼음, 또는 PBS, 생리 버퍼 유지. </li><li> 시작하려면, 미세 절개 핀과 해부 접시에 EAB 애벌레를 수정. 그 다음 해부 접시에 차가운 1X PBS를 추가합니다. </li><li> 첫째, 해부 가위의 벌금 쌍을 함께 애벌레 목을 벨. 이후 애벌레의 마지막 복부 세그먼트를 제거합니다. </li><li> 포셉의 시계 제조인 쌍을 사용하여 애벌레 시체에서 표피를 리프트. 그런 다음 가위를 사용하여 시체의 길이를 따라 절개합니다. 절개가 만들어으로 파열 창자를 안됩니다. </li><li> 조심스럽게 등 지방 기관 및 결합 조직 등 다른 조직에서 midgut 조직을 분리. 그런 다음, fatbody에 대한 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 신선한 1X PBS 버퍼에있는 조직을 씻어. 1.5 ML eppendorf 튜브에 미리 냉장 Trizol 시약 500 μL에 격리​​ midgut을 전송합니다. </li><li> 다음, 집게를 사용하여 지방 신체 조직을 분리하고 냉장 Trizol 시약 500 μL를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브에 그것을 전송합니다. </li><li> 마지막으로, 조직 무결성을 손상하지 않도록 돌봐 모든 준수 조직을 scrapping하여 애벌레 시체의 표피 조직을 분리. 신선한 PBS 버퍼에 고립 표피 조직을 씻어 차게 Trizol 시약 500 μL와 1.5 ML eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 절연 지방 몸, 표피 및 midgut 조직은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C까지 RNA 추출은. </li><li> RNA 추출을위한 준비에서 발달 단계에 따라 다양한 EAB 샘플을 정렬합니다. 이러한 단계가 1 일, 2 -, 3 -,, 4 - instars, prepupae과 성인을 포함합니다. </li></ol> II. RNA 추출 (Trizol 시약을 사용하는 제조 업체마다의 프로토콜로) 균질화 <ol><li> RNA 추출을 시작하려면 먼저 Trizol 포함 1.5 ML eppendorf 튜브에 조직을 균질로 플라스틱 pestles를 사용합니다. 균질 후, Trizol 시약 각 샘플의 to1 ML의 전체 볼륨을 가지고. </li><li> 발달 단계에 대한, 박격포와 유봉과 액체 질소로 전체 동물을 균질. 다음 Trizol 1 ML에 homogenate의 나누어지는 (50 μg)을 추가합니다. </li></ol> 단계 분리 : <ol start="3"><li> 실온에서 15 분 동안 한 ML의 Trizol로 샘플 튜브를 품어. </li><li> 부화 후, 각각의 튜브에 클로로포름의 200μL를 추가합니다. 즉시 클로로포름을 추가한 후, 약 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들. 그런 다음, 추가 2~3분을위한 실내 온도에서 튜브를 품어. </li><li> 다음, 2 ° C.에 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 원심 분리 후, RNA의 수성 단계있을 것입니다. 수성 단계의 볼륨을 600 μl, 또는 전체 Trizol 볼륨의 60 %되어야합니다. </li></ol> RNA 침전 <ol start="6"><li> 조심스럽게만을 수성 단계를 제거합니다. 수성 단계 아래의 물질의 존재는 압축을 푼 RNA의 오염을 초래하게됩니다. 그런 다음, 적절하게 표시 1.5 ML eppendorf 튜브에 수성 단계를 전송합니다. </li><li> , 수성 단계에서 RNA를 침전 각 튜브에 이소 프로필 알코올의 0.5 ML를 섞어합니다. 10 분 상온에서 샘플을 품어. 부화 후 2 ° C. 10 분 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기 </li></ol> RNA 와시 <ol start="8"><li> 원심 분리 후, 튜브의 표면에 뜨는를 삭제. RNA는 튜브의 아래쪽에 형성 겔형 펠렛에 속해 있습니다. Trizol 1 ML 당 75 % 에탄올의 최소 1 ML 추가, 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. vortexing하여 섞는다. 그런 다음, 2 ° C.에서 5 분 7500Xg에서 튜브를 원심 분리기 </li></ol> RNA 용리 <ol start="9"><li> 튜브의 표면에 뜨는 폐기하십시오. 1 분 작은 테이블 원심 분리기에 다시 튜브를 원심 분리기. 주의 pipetting하여 관에서 초과 뜨는을 제거합니다. 튜브를 열어두고 50~10분을위한 펠릿 공기가 건조 보자. 이것은 크게는 용해도가 감소하므로 위에 펠릿 건조하지 않도록주의하십시오. </li><li> 공기 건조 후의 펠렛 resuspend <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> 또는 DEPC, 처리 물. 펠렛을 resuspend하는 데 사용되는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. SM에 대한 DEPC 처리 물의 50 μL를 사용하여큰 펠렛 모든 펠릿 또는 100 μL. 펠렛 완전히 여러 번 다운 피펫 팁을 이동하고하여 DEPC 처리된 물에 용해 보자. </li><li> 펠렛가 해산되면 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 넣으십시오. </li><li> 그런 다음, Nanodrop 분광 광도계 (RNA 샘플 2 μL)를 사용하여 각 RNA 샘플의 농도를 측정합니다. </li><li> -80에서 RNA 샘플을 보관 ° C 이상 사용까지. </li></ol> III. 첫 스트랜드 cDNA 합성 (Invitrogen에서 윗첨자 첫번째 스트랜드 합성 키트를 사용하여 제조 업체마다의 프로토콜로.) <ol><li> 각 RNA 샘플에 대해 PCR 튜브에 다음을 추가 : <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> X μl </td></tr><tr><td> 10mM dNTP 혼합 M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (DT) (0.5 μg / μl) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC 물을 치료 </td><td> (8 - X) μl </td></tr><tr><td> 총 볼륨 : </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> 참고 : x는 cDNA 합성에 사용되는 RNA의 볼륨입니다. RNA의 농도에 따라 RNA로부터 2-3 μg 각 반응에 사용되며 각 반응의 총 부피 10 μl해야합니다. </td></tr></tbody></table></li><li> 4 분간 65 thermocycler에 위의 반응 믹스 ° C를 놓습니다. </li><li> theromocyler에서 튜브를 제거하고 최소한 2 분 동안 즉시 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 다음을 추가하여 첫 스트랜드 마스터 믹스를 준비 : <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RT 버퍼 </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNase 아웃 </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table></li><li> RNA 샘플을 포함하는 각각의 튜브, pipeting로 섞어 마스터 믹스 9 μl를 추가하고 혼합 잠시을 원심 분리기. </li><li> thermocycler에 다시 튜브를 삽입하고 42 ° C. 2 분 동안 품어 </li><li> 일시 thermocycler를 각 튜브에 윗첨자 II 반대 transcriptase 효소 (Invitrogen) 1 μl를 추가합니다. 이 단계는 신속하게 완료되어야합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 70 반응 ° C 15 분 동안을 종료할 수 있습니다. </li><li> thermocycler에서 튜브를 제거하고 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 각각의 튜브에 RNase H 1 μl를 추가하고 37 thermocycler에 다시 자리 ° C를 20 분. </li><li> thermocycler의 샘플을 복용 후, 각각의 튜브에 nuclease 무료 물을 20 μl를 추가합니다. 각 샘플의 볼륨이 단계에서 두 배가됩니다. </li><li> 샘플 2 μl를 사용하여 각 시료의 농도를 확인합니다. qRT - PCR에 사용하기 위해 20ng/μl의 농도를 만들기 위해 각 샘플의 나누어지는 가져가라. 20ng/μl의 농도에 샘플을 만들어 물의 양은 합성 cDNA의 초기 농도에 따라 달라집니다. </li></ol> IV. qRT - PCR : 참조 유전자의 프라이머 설계 및 결정 <ol><li> 60 ° C와 ~ 100bp의 제품 크기의 녹는 온도 (TM)와 함께 디자인 primers. </li><li> AP - PERI1이 실험에 대한 관심의 유전자로 사용됩니다. 참조 유전자 또는 내부 통제는 데이터의 저장 분석과 정상화를 위해 필요합니다. Ribosomal 단백질 (AP - RP1)은 본 실험에 대한 참조 유전자로 사용됩니다. </li><li> 참조 유전자를 포함하는 데 사용됩니다 primers의 5uM 작업 주식을 준비합니다. </li></ol> 표준의 준비 <ol start="4"><li> 기준하여야한다 사용되는 primers의 효율성을 계산하기 위해서는. </li><li> 테스트하게 될 다양한 샘플로부터 cDNA를 혼합합니다. </li><li> 그래프의 각 원하는 포인트 5 배 시리얼 dilutions하십시오. 네 dilutions 충분해야하지만, 그 다섯도 매우 좋습니다. </li><li> 볼륨 얼마나 많은 지점과 얼마나 많은 기술 복제에서 사용중인 따라 달라집니다. 충분히 참조 유전자를 포함하여 테스트하고 각 유전자에 대한 표준을 만들기 위해이 있어야합니다. </li></ol> 플레이트 템플릿 <ol start="8"><li> qRT - PCR 플레이트의 각 잘 대해 샘플의 이름을 나타내는 템플릿을 디자인합니다. 각 유전자에 대한 기준과 적어도 두 기술은 샘플 당 복제를 포함하는 것을 잊지 말아주세요. </li></ol> 자전거 매개 변수를 설정 <ol start="9"><li> 에 qRT - PCR 기계를 켜고 자전거 매개 변수를 입력합니다. 다음과 같이 실험 자전거 매개 변수는 다음과 같습니다 1 단계 : <ul><li> 1 사이클 : 95 ° C 3 분 </li></ul> 2 단계 : <ul><li> 40주기 : 95 ° C 15 초 60 ° C 30 초 뒤에 (옵션 : 녹는 곡선을 결정하기위한 다음 단계를 포함) </li></ul>3 단계 : <ul><li> 1 사이클 : 95 ° C 1 분 </li></ul> 4 단계 : <ul><li> 1cycle : 55 ° C 1 분 </li></ul> 5 단계 : <ul><li> 81주기 : 55 ° C 30 초 </li></ul></li></ol> 플레이트는 CFX96 (BioRad) 기계 설정 <ol start="11"><li> 별도의 튜브에서 각 유전자 (참조 유전자를 포함)에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 잘 들어, 마스터 혼합으로 구성되어 있습니다 <table border="0"><tbody><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2.5 X SYBR 녹색 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 앞으로 프리머 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 프라이머 역방향 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> μl 8 </td></tr></tbody></table></li><li> 준비하는 동안 마스터 믹스 pipetting 오류에 대한 계정을 1-2 여분의 반응을 포함합니다. </li><li> 이전에 설계 템플릿에 따르면, 2 μL를 (20 μL / NG) 각 잘하는 cDNA의 추가할 수 있습니다. 그런 다음, 반응 당 10 μL의 총 볼륨의 결과, 각 잘하는 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다. </li><li> 샘플 잘 혼합되어 있는지 확인까지 피펫 아래 (2 배). 어떤 액체가 끝에 숙박 없다는 것을 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플에 대한 새 팁을 사용합니다. </li><li> 전체 플레이트가 설치되면 광학 테이프로 번호판을 커버. 그리스의 존재가 읽기에 영향을 미칠 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그런 다음, 우물의 모든 제품 판의 하단에되는 것을 보장하기 위해 1 분 500 RPM에서 번호판을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 접시의 바닥에 얼음도 물도 없다는 것을 확인하십시오. 마지막으로, qRT - PCR 기계에있는 접시를 놓고 PCR 프로그램을 실행합니다. </li></ol> 실험의 V. 도표 표현 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 플로우 차트는 유전자 발현 연구를위한 단계의 순서를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 중간에 midgut를 보여주는) 애벌레 EAB의 해부. 애벌레 EAB의 B) 절연의 midgut <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : A) 표피 (잘라내기), midgut (MG) ​​및 지방 단체 (FB)를 포함해 다른 애벌레 조직에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질은 (이하라는, AP - RP1) 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 애벌레 조직에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. 표피 조직은 최소한 표현을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X) 샘플 (Pfaffl, 2001)로 찍은 거죠. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : A) 애벌레 instars (제 1, 2, 3, 4), prepupae (PP)와 성인 (A)를 포함한 EAB의 다른 발달 단계에 peritrophin 유전자 (AP - PERI1)에 대한 상대적인 표현 값 (REVs) 의미합니다. EAB 특정 ribosomal 단백질 (AP - RP1)이 관심의 유전자, AP - PERI1에 대해 얻은 데이터를 정규화에 대한 내부 통제로 사용되었다. 다양한 발달 단계에서 AP - PERI1의 B) 상대 배 변경할 수 있습니다. PP 샘플은 mRNA 수준의 최소 수준을 보여주 따라서 캘리 브 레이터 (1X 샘플)로 찍은 거죠. VI. 결론 정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 또한, qRT - PCR은 대부분 같은 microarrays 및 차세대 RNA - Seq으로 높은 처리량 유전자 발현 분석에서 생성된 데이터의 유효성을 검사하는 핵심 도구를했습니다.

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

임계값주기 (CT)이 값은 qRT - PCR 플레이트의 각 샘플에 대해 얻을 수 있습니다. 표준 곡선을 만들기위한 각 희석에 대해 얻은 CT 값은 그 농도의 로그 역모를 꾸몄다했다. 실험 샘플에 대한 CT 값은 다음이 희석 시리즈 표준 곡선에 꾸몄다했다. 목표 수량은 각 실험 즉, 조직 발달 표현에 대해 생성된 별도의 표준 곡선으로부터 계산되었다. 상대 표현식 값 (REVs) 다음 내부 통제를 위해 얻은 수량 (AP - RP1)와 관심의 대상 시퀀스의 수량을 (이 경우 AP - PERI1)를 나눔으로써 결정되었다. 중요성의 계산은 각 유전자에 대한 REVs의 로그는 SAS (SAS 연구소 주식 회사 SAS / STAT 사용자 안내서, 버전 9.1)의 PROC 혼합 절차를 사용하여 ANOVA (분산 분석)에 의해 분석되었다. 표현 수준에서 의의는 P &lt;0.05로 결정되었다. 조직의 경우 상대 접어으로 변경되며, 변경된 사항은 캘리 브 레이터 (1X 샘플, Pfaffl, 200...

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 pcr

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

에메랄드 애쉬 송곳 (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;)하면 애쉬 나무의 수백만을 죽인이있는 이국적인 침입 해충 (수 있습니다<em&gt; Fraxinus</em&gt; 종) 북미 인치<strong&gt;</strong&gt; EAB는 빠른 속도로 확산 계속해서 공격은 성숙 나무 묘목에서 다른 연령층의 나무 재가. 그러나, 거의 날짜 또는 어떤 분자 지식 EAB을 위해 존재하지. 우리는 조직 수준에서 분자 기반의 생리 과정을 해독에 관심이있다 애쉬 나무의 성공적인 식민지의 원조 EAB. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 티슈 (midgut, 지방 기관 및 표피 포함) 및 다른 발달 단계 (1과 같은 확인할 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR의 효과적인 사용 (qRT - PCR)을 표시<sup&gt; 일</sup&gt; - 2<sup&gt; 차</sup&gt; - 3<sup&gt; 차</sup&gt; - 4<sup&gt; 일</supEAB의&gt; - instars, prepupae 어른). 예를 들어, peritrophin 유전자 (이하라는,<em&gt; AP - PERI1</em&gt;)는 관심의 유전자와 ribosomal 단백질 (로 exemplified입니다<em&gt; AP - RP1</em&gt;) 내부 통제로. Peritrophins은 곤충 장의 내벽입니다 peritrophic 멤브레인 / 매트릭스 (PM)의 중요한 구성 요소입니다. PM은 소화 및 midgut의 상피에 기계적 보호 등 다양한 기능이 있습니다.

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

물푸레나무하늘소(EAB, Agrilus planipennis)는 외래 침입 해충으로, 북미의 수백만 그루의 물푸레나무(Fraxinus spp)를 고사시켰습니다. 물푸레나무하늘소는...

다음 실험의 전반적인 목적은 quantitative PCR을 사용하여 emerald ash Borer의 조직 및 발달 단계별 유전자 발현을 분석하는 것입니다. 이는 유충 조직의 해부와 발달 단계의 분류를 통해 수행됩니다. 두 번째 단계로, triol 시약을 사용하여 조직과 발달 단계에서 RNA를 추출하며, 이를 템플릿으로 사용하여 첫 번째 가닥인 cDNA를 생성합니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성이 완료된 후, quantitative RT-PCR을 수행합니다.사이클 임계값(cycle threshold values)에서 얻은 전체 변화 데이터를 기반으로, 다양한 유충 조직 및 발달 단계에서 표적 유전자의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻습니다. 정량적 R-T-P-C-R 증폭 후의 과정입니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 곤충학과의 연구 책임자인 Prakash Mi입니다.저희 연구실은 주로 물푸레나무잎좀(emerald ash borer)과 물푸레나무 사이의 유전체적 또는 분자적 상호작용을 연구합니다. 물푸레나무잎좀(EAB)은 중국에서 유입된 외래 침입 해충으로, 북미 전역의 물푸레나무 개체군 존립을 위협하고 있습니다. 오늘은 qPCR 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 EAB의 유전자 발현 분석을 학습하는 프로토콜을 보여드리겠습니다.이 프로토콜에 참여할 연구실 구성원은 val 해부를 담당할 Swapna pri ou, RNA 분리를 시연할 bin Bandari, 그리고 마지막으로 qPCR 분석을 살펴볼 Lauren Rivera Vega입니다. 저희 연구실에서는 ash의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, emerald ash B 또는 EAD 유충을 젖은 조직지에 놓아 둡니다. 해부를 수행할 때까지 1x 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS를 신선하게 준비하여 얼음 위에 보관함으로써 해부 과정 내내 버퍼가 차갑게 유지되도록 합니다.먼저, 미세 해부 핀을 사용하여 해부 접시 위에 EAB 유충을 고정합니다. 그다음 해부 접시에 차가운 1x PBS를 첨가합니다. 먼저 미세 해부 가위로 유충의 머리를 절단합니다.그 다음, 시계 제작용 핀셋을 사용하여 유충의 마지막 복부 마디를 제거합니다. 유충 사체에서 큐티클을 들어 올린 후, 가위를 사용하여 사체의 길이를 따라 절개합니다. 이때 장이 파열되지 않도록 주의하십시오.절개 시 중장 조직을 지방체 및 결합 조직과 같은 다른 조직으로부터 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음, 지방체 오염이 없도록 조직을 신선한 1X PBS 버퍼로 헹굽니다. 분리한 중장을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 담긴 500 µL의 사전 냉각된 TRIzol 시약으로 옮깁니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 지방체 조직을 분리한 후 500 µL의 냉각된 triol 시약이 들어 있는 1.5 mL eend orph 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 유충 사체에서 부착된 조직을 긁어내어 큐티클 조직을 분리합니다. 이때 조직의 무결성이 손상되지 않도록 주의하십시오.분리된 큐티클 조직을 신선한 PBS 버퍼로 헹구고, 500 µL의 냉각된 triazole 시약이 들어 있는 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 분리된 지방체 큐티클 및 중장 조직은 RNA 추출 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. RNA 추출을 준비하기 위해, 다양한 EAB 샘플을 발달 단계별로 분류합니다.이 단계에는 별, PrepU 및 성체의 1단계, 2단계, 3단계 및 4단계가 포함됩니다. RNA 추출을 시작하려면, 먼저 1.5 milliliter TRIzol 튜브 내에서 플라스틱 페스틀을 사용하여 조직을 균질화하십시오. 균질화 후, TRIzol 시약을 사용하여 각 샘플의 총 부피를 1 milliliter로 맞추십시오.발달 단계의 경우, 막자와 유발을 사용하여 액체 질소 내에서 동물 전체를 균질화합니다. 그 다음, 균질액의 일정량을 1 mL의 triol에 추가합니다. triol 1 mL가 들어있는 샘플 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 각 튜브에 200 µL의 클로로포름을 즉시 첨가합니다. 튜브를 약 15초 동안 강하게 흔들어 섞어줍니다. 그 후 실온에서 2~3분간 추가로 배양합니다.다음으로, 샘플을 2°C에서 12,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 RNA는 수용액층에 존재하게 됩니다. 수용액층의 부피는 600 µL 또는 전체 triol 부피의 60%여야 합니다.수용층만 조심스럽게 제거하십시오. 수용층 아래에 물질이 존재하면 추출된 RNA가 오염될 수 있습니다. 그 다음 수용층을 적절하게 라벨링된 1.5 milliliter einor tube로 옮깁니다.수용액 상 혼합물에서 RNA를 침전시키기 위해, 각 튜브에 0.5 milliliters의 이소프로판올을 첨가합니다. 시료를 상온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 2 °C에서 12,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브에서 S natin을 제거합니다.RNA는 튜브 바닥에 형성된 젤 형태의 펠렛에 존재합니다. 75% ethanol로 펠렛을 세척하며, 혼합액 1 mL당 최소 1 mL의 75% ethanol을 첨가한 후 볼텍싱으로 섞어줍니다. 그다음 튜브를 2 °C에서 7,500 G로 5분 동안 원심분리합니다.튜브에서 상층액을 제거합니다. 소형 테이블 원심분리기를 사용하여 튜브를 1분 동안 다시 원심분리합니다. 정밀한 피펫팅을 통해 튜브 내의 과잉 상층액을 모두 제거합니다.튜브를 열어 둔 채로 펠렛을 5~10분 동안 공기 건조시킵니다. 펠렛을 과하게 건조하면 공기 건조 후 용해도가 크게 감소하므로 주의하십시오. 펠렛을 다이에틸 퍼카보네이트 또는 DEP 처리된 물에 재현탁합니다.펠렛을 재현탁하는 데 사용되는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. 작은 펠렛의 경우 50 µL의 dep sea 처리수를 사용하고, 큰 펠렛의 경우 100 µL를 사용하십시오. 파이펫 팁을 여러 번 위아래로 움직여 펠렛이 dep sea 처리수에 완전히 용해되도록 합니다.펠렛이 완전히 용해되면, 샘플을 55 °C에서 10분 동안 둡니다. 그런 다음 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 각 RNA 샘플의 농도를 측정합니다. 마지막으로, RT-PCR용 Invitrogen SuperScript first strand synthesis system을 사용하여 해당 RNA 샘플의 1차 가닥 cDNA 합성을 수행합니다.이 절차는 본 프로토콜의 서면 부분에서 확인하실 수 있습니다. quantitative real-time PCR 또는 Q-R-T-P-C-R을 시작하려면, 각 프라이머의 Tm 값을 60 °C로, 산물의 크기를 약 100 bp가 되도록 설계하십시오. 본 실험에서는 AP par 1을 표적 유전자로 사용합니다.이후의 분석 및 데이터 정규화를 위해 참조 유전자 또는 내부 대조군이 필요합니다. 여기서는 리보솜 단백질 a P RRP one을 참조 유전자로 사용합니다. 다음으로, 각 웰의 샘플 이름과 QR tpcr 플레이트를 나타내는 템플릿을 설계하십시오.각 유전자에 대한 표준 시료와 샘플당 최소 2개의 기술적 반복(technical replicates)을 포함해야 함을 기억하십시오. 그런 다음 QRT PCR 기기를 켜고 cycling 파라미터를 입력하여 CFX 96 기기의 플레이트를 설정하십시오. 먼저, 각 웰(well)을 위해 별도의 튜브에 유전자별 마스터 믹스를 준비하십시오.마스터 믹스는 nuclease free water 2 µL, 2.5 x cyber green 4 µL, forward 프라이머 1 µL, reverse 프라이머 1 µL로 구성되어 총 부피는 8 µL가 됩니다. 이전에 설계된 템플릿에 따라 각 웰에 cDNA 2 µL를 첨가합니다. 그다지 각 웰에 마스터 믹스 8 µL를 추가하여 반응당 총 부피가 10 µL가 되도록 합니다. 샘플이 충분히 혼합되도록 파이펫으로 피펫팅합니다.팁에 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플마다 새 팁을 사용하십시오. 플레이트 전체의 세팅이 완료되면, 광학 테이프로 플레이트를 덮으십시오.그리스 성분이 측정값에 영향을 줄 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그다음, 플레이트를 500 RPM에서 1분 동안 원심분리하여 웰 내의 모든 산물이 원심분리 후 플레이트 바닥에 위치하도록 합니다. 플레이트 바닥에 얼음이나 물이 없는지 확인하십시오.마지막으로, 플레이트를 QR TPCR 기기에 넣고 EAB 유충의 대표 결과에 해당하는 PCR 프로그램을 실행합니다. 여기에서는 해부 및 QR TPCR 과정이 표시됩니다. EAB 유충을 해부하면 유충 중앙에 중장이 나타나야 합니다.여기에 나타낸 것과 같이 EAB 유충의 중장을 분리하며, 평균 상대 발현값 또는 RAV를 나타냅니다. 큐티클, 중장 및 지방체를 포함한 다양한 유충 조직에 대한 파라트로핀 유전자 AP par one의 발현 결과가 여기에 표시되어 있습니다. EAB 특이적 리보솜 단백질 ARP one을 관심 유전자에 대해 얻은 데이터를 정규화하기 위한 내부 대조군으로 사용하였습니다.다양한 유충 조직에 대한 AP AP par one의 상대적 배수 변화(relative fold change)를 추출하였습니다. 큐티클 조직에서 발현량이 가장 적게 나타났으며, 이에 따라 1, 2, 3, 4령 유충을 포함한 EAB의 서로 다른 발달 단계에서 AP Perry. One의 보정 시료 평균 RV로 설정하였습니다.PrepU 및 성체의 데이터 정규화를 위해 aprp one을 내부 대조군으로 사용하여 결정하였습니다. 다양한 발달 단계에 따른 AP Perry one의 상대적 배수 변화를 측정하였습니다. 여기서 PrepU 샘플이 mRNA 수준이 가장 낮게 나타나 보정군(calibrator)으로 설정하였습니다.우리는 방금 측면 해부 방법과 더불어, 정량적 R-T-P-C-R을 이용해 Emeral ra의 측면 및 다양한 발달 단계의 유전자 발현 분석을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행하는 동안 조직 샘플이 교차 오염되지 않도록 해부 시 주의해야 합니다. 또한, Q-R-T-P-C-R을 수행할 때 각 샘플을 해당 PCR 웰에 정확히 피펫팅하도록 주의를 기울여야 합니다.이상입니다. 저희 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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