에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

다음 실험의 전반적인 목적은 quantitative PCR을 사용하여 emerald ash Borer의 조직 및 발달 단계별 유전자 발현을 분석하는 것입니다. 이는 유충 조직의 해부와 발달 단계의 분류를 통해 수행됩니다. 두 번째 단계로, triol 시약을 사용하여 조직과 발달 단계에서 RNA를 추출하며, 이를 템플릿으로 사용하여 첫 번째 가닥인 cDNA를 생성합니다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성이 완료된 후, quantitative RT-PCR을 수행합니다.

사이클 임계값(cycle threshold values)에서 얻은 전체 변화 데이터를 기반으로, 다양한 유충 조직 및 발달 단계에서 표적 유전자의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻습니다. 정량적 R-T-P-C-R 증폭 후의 과정입니다. 안녕하세요, 저는 오하이오 주립대학교 곤충학과의 연구 책임자인 Prakash Mi입니다.

저희 연구실은 주로 물푸레나무잎좀(emerald ash borer)과 물푸레나무 사이의 유전체적 또는 분자적 상호작용을 연구합니다. 물푸레나무잎좀(EAB)은 중국에서 유입된 외래 침입 해충으로, 북미 전역의 물푸레나무 개체군 존립을 위협하고 있습니다. 오늘은 qPCR 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 EAB의 유전자 발현 분석을 학습하는 프로토콜을 보여드리겠습니다.

이 프로토콜에 참여할 연구실 구성원은 val 해부를 담당할 Swapna pri ou, RNA 분리를 시연할 bin Bandari, 그리고 마지막으로 qPCR 분석을 살펴볼 Lauren Rivera Vega입니다. 저희 연구실에서는 ash의 유전자 발현을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, emerald ash B 또는 EAD 유충을 젖은 조직지에 놓아 둡니다. 해부를 수행할 때까지 1x 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline) 또는 PBS를 신선하게 준비하여 얼음 위에 보관함으로써 해부 과정 내내 버퍼가 차갑게 유지되도록 합니다.

먼저, 미세 해부 핀을 사용하여 해부 접시 위에 EAB 유충을 고정합니다. 그다음 해부 접시에 차가운 1x PBS를 첨가합니다. 먼저 미세 해부 가위로 유충의 머리를 절단합니다.

그 다음, 시계 제작용 핀셋을 사용하여 유충의 마지막 복부 마디를 제거합니다. 유충 사체에서 큐티클을 들어 올린 후, 가위를 사용하여 사체의 길이를 따라 절개합니다. 이때 장이 파열되지 않도록 주의하십시오.

절개 시 중장 조직을 지방체 및 결합 조직과 같은 다른 조직으로부터 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음, 지방체 오염이 없도록 조직을 신선한 1X PBS 버퍼로 헹굽니다. 분리한 중장을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 담긴 500 µL의 사전 냉각된 TRIzol 시약으로 옮깁니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 지방체 조직을 분리한 후 500 µL의 냉각된 triol 시약이 들어 있는 1.5 mL eend orph 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 유충 사체에서 부착된 조직을 긁어내어 큐티클 조직을 분리합니다. 이때 조직의 무결성이 손상되지 않도록 주의하십시오.

분리된 큐티클 조직을 신선한 PBS 버퍼로 헹구고, 500 µL의 냉각된 triazole 시약이 들어 있는 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 분리된 지방체 큐티클 및 중장 조직은 RNA 추출 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. RNA 추출을 준비하기 위해, 다양한 EAB 샘플을 발달 단계별로 분류합니다.

이 단계에는 별, PrepU 및 성체의 1단계, 2단계, 3단계 및 4단계가 포함됩니다. RNA 추출을 시작하려면, 먼저 1.5 milliliter TRIzol 튜브 내에서 플라스틱 페스틀을 사용하여 조직을 균질화하십시오. 균질화 후, TRIzol 시약을 사용하여 각 샘플의 총 부피를 1 milliliter로 맞추십시오.

발달 단계의 경우, 막자와 유발을 사용하여 액체 질소 내에서 동물 전체를 균질화합니다. 그 다음, 균질액의 일정량을 1 mL의 triol에 추가합니다. triol 1 mL가 들어있는 샘플 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 각 튜브에 200 µL의 클로로포름을 즉시 첨가합니다. 튜브를 약 15초 동안 강하게 흔들어 섞어줍니다. 그 후 실온에서 2~3분간 추가로 배양합니다.

다음으로, 샘플을 2°C에서 12,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 RNA는 수용액층에 존재하게 됩니다. 수용액층의 부피는 600 µL 또는 전체 triol 부피의 60%여야 합니다.

수용층만 조심스럽게 제거하십시오. 수용층 아래에 물질이 존재하면 추출된 RNA가 오염될 수 있습니다. 그 다음 수용층을 적절하게 라벨링된 1.5 milliliter einor tube로 옮깁니다.

수용액 상 혼합물에서 RNA를 침전시키기 위해, 각 튜브에 0.5 milliliters의 이소프로판올을 첨가합니다. 시료를 상온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 2 °C에서 12,000 Gs로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브에서 S natin을 제거합니다.

RNA는 튜브 바닥에 형성된 젤 형태의 펠렛에 존재합니다. 75% ethanol로 펠렛을 세척하며, 혼합액 1 mL당 최소 1 mL의 75% ethanol을 첨가한 후 볼텍싱으로 섞어줍니다. 그다음 튜브를 2 °C에서 7,500 G로 5분 동안 원심분리합니다.

튜브에서 상층액을 제거합니다. 소형 테이블 원심분리기를 사용하여 튜브를 1분 동안 다시 원심분리합니다. 정밀한 피펫팅을 통해 튜브 내의 과잉 상층액을 모두 제거합니다.

튜브를 열어 둔 채로 펠렛을 5~10분 동안 공기 건조시킵니다. 펠렛을 과하게 건조하면 공기 건조 후 용해도가 크게 감소하므로 주의하십시오. 펠렛을 다이에틸 퍼카보네이트 또는 DEP 처리된 물에 재현탁합니다.

펠렛을 재현탁하는 데 사용되는 물의 양은 펠렛의 크기에 따라 달라집니다. 작은 펠렛의 경우 50 µL의 dep sea 처리수를 사용하고, 큰 펠렛의 경우 100 µL를 사용하십시오. 파이펫 팁을 여러 번 위아래로 움직여 펠렛이 dep sea 처리수에 완전히 용해되도록 합니다.

펠렛이 완전히 용해되면, 샘플을 55 °C에서 10분 동안 둡니다. 그런 다음 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 각 RNA 샘플의 농도를 측정합니다. 마지막으로, RT-PCR용 Invitrogen SuperScript first strand synthesis system을 사용하여 해당 RNA 샘플의 1차 가닥 cDNA 합성을 수행합니다.

이 절차는 본 프로토콜의 서면 부분에서 확인하실 수 있습니다. quantitative real-time PCR 또는 Q-R-T-P-C-R을 시작하려면, 각 프라이머의 Tm 값을 60 °C로, 산물의 크기를 약 100 bp가 되도록 설계하십시오. 본 실험에서는 AP par 1을 표적 유전자로 사용합니다.

이후의 분석 및 데이터 정규화를 위해 참조 유전자 또는 내부 대조군이 필요합니다. 여기서는 리보솜 단백질 a P RRP one을 참조 유전자로 사용합니다. 다음으로, 각 웰의 샘플 이름과 QR tpcr 플레이트를 나타내는 템플릿을 설계하십시오.

각 유전자에 대한 표준 시료와 샘플당 최소 2개의 기술적 반복(technical replicates)을 포함해야 함을 기억하십시오. 그런 다음 QRT PCR 기기를 켜고 cycling 파라미터를 입력하여 CFX 96 기기의 플레이트를 설정하십시오. 먼저, 각 웰(well)을 위해 별도의 튜브에 유전자별 마스터 믹스를 준비하십시오.

마스터 믹스는 nuclease free water 2 µL, 2.5 x cyber green 4 µL, forward 프라이머 1 µL, reverse 프라이머 1 µL로 구성되어 총 부피는 8 µL가 됩니다. 이전에 설계된 템플릿에 따라 각 웰에 cDNA 2 µL를 첨가합니다. 그다지 각 웰에 마스터 믹스 8 µL를 추가하여 반응당 총 부피가 10 µL가 되도록 합니다. 샘플이 충분히 혼합되도록 파이펫으로 피펫팅합니다.

팁에 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플마다 새 팁을 사용하십시오. 플레이트 전체의 세팅이 완료되면, 광학 테이프로 플레이트를 덮으십시오.

그리스 성분이 측정값에 영향을 줄 수 있으므로 테이프를 만지지 마십시오. 그다음, 플레이트를 500 RPM에서 1분 동안 원심분리하여 웰 내의 모든 산물이 원심분리 후 플레이트 바닥에 위치하도록 합니다. 플레이트 바닥에 얼음이나 물이 없는지 확인하십시오.

마지막으로, 플레이트를 QR TPCR 기기에 넣고 EAB 유충의 대표 결과에 해당하는 PCR 프로그램을 실행합니다. 여기에서는 해부 및 QR TPCR 과정이 표시됩니다. EAB 유충을 해부하면 유충 중앙에 중장이 나타나야 합니다.

여기에 나타낸 것과 같이 EAB 유충의 중장을 분리하며, 평균 상대 발현값 또는 RAV를 나타냅니다. 큐티클, 중장 및 지방체를 포함한 다양한 유충 조직에 대한 파라트로핀 유전자 AP par one의 발현 결과가 여기에 표시되어 있습니다. EAB 특이적 리보솜 단백질 ARP one을 관심 유전자에 대해 얻은 데이터를 정규화하기 위한 내부 대조군으로 사용하였습니다.

다양한 유충 조직에 대한 AP AP par one의 상대적 배수 변화(relative fold change)를 추출하였습니다. 큐티클 조직에서 발현량이 가장 적게 나타났으며, 이에 따라 1, 2, 3, 4령 유충을 포함한 EAB의 서로 다른 발달 단계에서 AP Perry. One의 보정 시료 평균 RV로 설정하였습니다.

PrepU 및 성체의 데이터 정규화를 위해 aprp one을 내부 대조군으로 사용하여 결정하였습니다. 다양한 발달 단계에 따른 AP Perry one의 상대적 배수 변화를 측정하였습니다. 여기서 PrepU 샘플이 mRNA 수준이 가장 낮게 나타나 보정군(calibrator)으로 설정하였습니다.

우리는 방금 측면 해부 방법과 더불어, 정량적 R-T-P-C-R을 이용해 Emeral ra의 측면 및 다양한 발달 단계의 유전자 발현 분석을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행하는 동안 조직 샘플이 교차 오염되지 않도록 해부 시 주의해야 합니다. 또한, Q-R-T-P-C-R을 수행할 때 각 샘플을 해당 PCR 웰에 정확히 피펫팅하도록 주의를 기울여야 합니다.

이상입니다. 저희 영상을 시청해주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.