Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

다음 실험의 전반적인 목적은 제브라피쉬 배아 내 신경 세포를 고해상도로 이미징하는 것입니다. 먼저, 막 표적 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 DNA를 제브라피쉬 배아의 1세포기에 주입하여 모자이크 상속을 유도함으로써, 흩어져 있는 세포들의 이미징 효율을 높입니다. 그 후, 배아를 anti-GFP로 면역 표지하고 절편화하여 고정된 상태에서 단일 세포의 형태를 고해상도로 시각화할 수 있게 합니다. 또는, 세포 역동성을 관찰하기 위해 타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 살아있는 배아를 검사할 수도 있습니다.

세포 형태 또는 역동성을 보여주는 결과가 도출되었습니다. 여기서는 공초점 현미경을 사용하여 제브라피시 후뇌를 이미징합니다. 여러분 안녕하세요.

저는 메릴랜드 대학교 볼티모어 카운티 생물과학과의 Rachel Brewster 박사님 연구실 소속 PR Chandran입니다. 오늘은 제브라피시 배아의 신경 세포를 고해상도로 라벨링하고 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 일반적으로 이 절차를 통해 제브라피시 배아의 신경 분화 기전을 세포 수준에서 연구합니다.

이제 시작하겠습니다. 100 mm 페트리 접시의 가장자리를 따라 젖은 Kim wipe를 배치하십시오.

가습된 디쉬 내부의 왁스 스트립 위에 유리 미세주입 바늘을 조심스럽게 고정합니다. 해부용 실체 현미경 하에서 눈금 슬라이드에 바늘을 맞춥니다. 적절한 크기의 팁을 얻으려면, 깨끗한 면도날을 사용하여 직경이 1 µm인 지점의 바늘을 가볍게 칩니다.

바늘을 미세주입 장치에 연결하고 파라필름 위에 페놀 레드 수용액 0.5 µL를 떨어뜨린 후, 바늘을 액체 방울에 대어 내부를 채웁니다. 미세주입 압력을 7 kPa로 설정하고 20 ms 펄스로 시작합니다. 모든 액체를 분사하는 데 필요한 펄스 횟수를 측정합니다. 분사에 약 250회의 펄스가 소요되도록 펄스 시간을 10 ms에서 30 ms 사이로 조정합니다.

용액 0.5 µL를 준비합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 가시화를 위해 페놀 레드(phenol red)와 혼합한 MG FPD NA 수용액 0.5~1 µL를 바늘에 역충전합니다. 실체 현미경 하에서 바늘 내 용액의 증발을 방지하기 위해 습윤 접시의 덮개를 닫습니다.

1세포 단계의 분리된 물고기 배아를 embryo.Medium이 채워진 60 millimeter 페트리 접시에 배치하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 배아의 chorion을 부드럽게 잡아 배아를 고정합니다. MGFP와 phenol red가 채워진 바늘을 주입 대상 부위로 이동시키십시오.

광범위한 MGFP 발현을 위해 난황 또는 세포질에 주입하십시오. 미세주입 장치를 사용하여 약 2 nanoliters의 MGFP 용액을 전달합니다. 페놀 레드 지시약의 위치를 관찰하여 적절하게 주입되었는지 확인하십시오.

배아에서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 한 번에 최대 30개까지, 디쉬에 있는 모든 배아에 주입하십시오. 배아가 빛에 노출되지 않도록 주의하며, 실체 현미경 하에서 배아가 원하는 단계까지 발달할 수 있도록 28.5 °C에서 배양하십시오.

미세 핀셋을 사용하여 배아에서 코리안(Corian)을 조심스럽게 벗겨냅니다. 파스타 피펫을 사용하여 디쉬에서 빈 코리안을 제거하고, DEC가 코팅된 배아만 남깁니다. 화염 연마된 파스타 피펫을 사용하여 주입 및 코팅된 배아를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

여분의 배지를 최대한 제거한 다음, active 1 mL를 추가합니다. 상온의 1X PBS로 배아를 5분씩 3회 세척합니다. 실체 현미경 하에서 배아를 1X PBS가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.

미세 핀셋을 사용하여 배아의 꼬리 부위 근처를 잡습니다. 두 번째 핀셋 또는 포커(poker)를 사용하여 후방 프레임 부위에 닿지 않게 주의하며 요황낭(yolk)을 최대한 제거합니다. 실체 현미경으로 관찰하면서 미세 핀셋으로 배아를 접시에서 들어 올려 4% 저융점 아가로스(low melting point agarose)가 채워진 섹셔닝 몰드(sectioning mold)에 넣습니다.

배아를 몰드의 한쪽 끝으로 배치합니다. aros가 상온에서 응고되도록 둡니다. 스패튤러를 사용하여 굳은 aros 블록을 몰드에서 제거하고, 면도날을 이용해 블록의 하단을 고르게 잘라냅니다.

필요한 경우, 순간접착제 한 방울을 사용하여 블록의 절단면이 아래로 향하게 하여 진동 스테이지에 고정하십시오. 스테이지 위에 여러 개의 블록을 정렬합니다. 스테이지를 진동 장치에 부착하십시오.

칼날이 각 배아를 완전히 가로지르되, 블록 전체를 완전히 관통하지 않도록 주의하십시오. 스테이지를 1XPBS 섹션으로 채웁니다. 배아를 아가로스 블록의 뒤쪽까지 조심스럽게 절단한 후, 1XPBS가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.

실체 현미경 하에서 섹션을 분리합니다. 미세 핀셋을 사용하여 원하는 섹션을 1x PBS가 채워진 멀티웰 디시에 옮깁니다. 배아마다 서로 다른 웰을 사용하십시오.

절편을 DPI로 염색하고 anti GFP로 면역 표지합니다. 그렇지 않은 경우, 48시간 이내에 이미징을 수행합니다. 슬라이드당 최대 6개의 절편을 마운트하고, 공초점 이미징을 위해 절편 위에 커버슬립을 덮습니다.

광퇴색을 방지하기 위해 슬라이드를 암소에 보관하십시오. 실시간 이미징 시, MGFP가 주입된 배아는 빛으로부터 보호되어야 합니다. 원하는 발달 단계에 도달하기 30분 전에 핀셋을 사용하여 배아를 코팅하십시오.

코팅된 배아를 0.01% Trica가 포함된 배아 배지 진정액으로 옮겨 실온에서 15분 동안 배양합니다. 35mm 유리 바닥 배양 접시에 1% 일반 agarose 수용액을 한 방울씩 피펫으로 떨어뜨려 몰드를 채웁니다. agarose가 응고될 때까지 기다립니다.

실체 현미경 하에서 90 millimeter 유리 모세관을 사용하여 aros 방울에 세 개의 구멍을 만듭니다. 웰의 바닥을 검사하고 핀셋으로 남아 있는 aros를 제거합니다. 실체 현미경 하에서 배아 배지로 디쉬를 채웁니다.

파스타 피펫을 사용하여 배아를 aros의 각 구멍에 하나씩 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 배아의 관심 영역(이 경우에는 머리 등쪽)이 유리에 닿도록 방향을 조절합니다. 디쉬의 덮개를 덮습니다.

디시를 공초점 현미경의 스테이지로 조심스럽게 운반합니다. 이미징이 진행되는 동안 배아의 온도를 28.5 °C로 유지하기 위해 공간 가열기를 사용하십시오. 여기 4~5개 체절 단계의 야생형 배아 후뇌 단면이 있으며, 막 표적 GFP(녹색)와 D(청색)로 이중 표지되었습니다. 단 하나의 세포만이 막 결합 GFP로 표지되어 세포의 형태와 조직을 고해상도로 이미징할 수 있습니다.

이것은 4~5체절 단계의 nardi din 돌연변이체의 후뇌를 비교한 이미지입니다. 이 이미지는 nardi 돌연변이체의 세포들이 신경관 형성과정 동안 정중선을 향해 적절하게 배열되지 못함을 보여줍니다. MGFP로 세포를 표지하는 방법과 달리, beta-catenin과 같은 일반적인 세포 표면 마커로 후뇌를 표지하면 개별 세포의 형태를 시각화할 수 없습니다.

MG FP가 표지된 배아의 후뇌를 타임랩스 이미징으로 관찰하면, 제브라피쉬의 신경 관계를 유도하는 세포 행동이 매우 역동적이며, 세포가 이동하고 상호 배치되는 과정에서 막 돌기의 신장이 수반됨을 알 수 있습니다. 지금까지 고해상도 단일 세포 이미징을 위해 고정된 제브라피쉬 배아와 살아있는 제브라피쉬 배아를 모두 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.