Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀
July 25th, 2010
초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 고해상도로 신경 세포를 이미지화하는 것입니다.먼저 제브라 피쉬 배아에서 DNA를 인코딩하는 멤브레인 표적 녹색 형광 단백질을 단일 세포 단계의 제브라 피쉬 배아에 주입하여 모자이크 유전을 일으켜 흩어진 세포의 이미징을 향상시킬 수 있습니다. 그런 다음 배아를 anti GFP로 면역 표지하고 절편화하여 고정된 제제에서 고해상도로 단일 세포의 형태를 시각화할 수 있습니다. 또는 세포 역학을 이미지화하기 위해 타임 랩스 비디오 현미경을 사용하여 살아있는 배아를 검사할 수 있습니다.
세포 형태 또는 역학을 보여주는 결과를 얻습니다. 여기에서 제브라피시 뒷뇌는 컨포칼 현미경으로 이미지화되었습니다. 여러분 안녕하세요.
저는 볼티모어 카운티 메릴랜드 대학교 생물학과 레이첼 브루스터 박사 연구실의 PR Chandran입니다. 오늘은 제브라피시 배아의 신경 세포를 더 높은 해상도로 라벨링하고 이미지화하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 일반적으로 세포 수준에서 얼룩말 물고기 배아의 신경 관계 메커니즘을 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다.
시작하겠습니다. 젖은 곳에 두십시오. 킴이 100mm 페트리 접시의 가장자리를 닦는다.
가습 접시 안의 왁스 스트립에 유리 미세 주입 바늘을 조심스럽게 고정합니다. 해부 실체 현미경 아래에서 바늘을 눈금이 매겨진 슬라이드에 맞춥니다. 적절한 크기의 팁을 얻으려면 깨끗한 면도날을 사용하여 직경이 1마이크로미터인 바늘을 부드럽게 두드립니다.
바늘을 마이크로 주입 장치 피펫 0.5 마이크로 리터의 페놀 레드와 물 용액을 파라 필름에 연결하고 물방울에서 바늘을 앞면에 채 웁니다. 마이크로 주입 압력을 7킬로 파스칼로 설정하고 20밀리초 펄스로 시작하여 모든 액체를 분배하는 데 필요한 펄스 수를 계산합니다. 분배하는 데 약 250 펄스가 소요되도록 시간을 10밀리초에서 30밀리초 사이로 변경합니다.
0.5 마이크로 리터의 용액. 마이크로 피펫을 사용하여 시각화를 위해 페놀 레드와 혼합된 물에 0.5-1마이크로리터의 MG FPD NA를 바늘에 다시 채웁니다. 실체 현미경 아래에서 바늘에서 용액이 증발하는 것을 방지하기 위해 가습 접시를 덮으십시오.
배아로 채워진 60mm 페트리 접시에 하나의 세포 단계를 별도의 물고기 배아를 배치합니다. 보통. 가는 집게를 사용하여 코리안을 부드럽게 잡고 배아를 안정시킵니다. MGFP와 페놀 레드로 채워진 바늘을 주입할 대상 영역으로 이동합니다.
광범위한 MGFP 발현을 위해 난황 또는 세포질에 주입합니다. 미세주입 장치를 사용하여 약 2나노리터의 MGFP 용액을 공급합니다. 페놀 레드 인디케이터의 위치를 관찰하여 적절한 주입을 확인하십시오.
배아에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다. 접시에 있는 모든 배아를 한 번에 최대 30개의 배아까지 주입합니다. 배아를 섭씨 28.5도에서 배양하는 빛에 노출시키지 말고 실체 현미경 아래에서 배아가 원하는 단계로 발달할 수 있도록 합니다.
가는 집게를 사용하여 배아에서 코리안을 부드럽게 떼어냅니다. 파스타 피펫을 사용하여 접시에서 빈 고추를 제거하고 dec 코팅된 배아만 남깁니다. 화염 광택 파스타 피펫을 사용하여 주입된 코팅된 배아를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
가능한 한 많은 여분의 매체를 제거한 다음 1ml의 ative를 추가하십시오. 실온에서 XPB S3를 한 번씩 5분씩 배아를 세척합니다. 실체 현미경 아래에서 하나의 XPBS로 채워진 페트리 접시로 배아를 옮깁니다.
가는 집게를 사용하여 배아를 꼬리 부위 근처에 잡습니다. 두 번째 집게 세트나 포커를 사용하여 뒷골 부위를 건드리지 않고 가능한 한 많은 요를 제거하십시오. 실체 현미경 아래를 보면서 미세한 집게를 사용하여 접시에서 배아를 들어 올려 4%의 낮은 융점으로 채워진 절편 주형으로 넣습니다. 아로스.
배아를 금형의 한쪽 끝으로 배치합니다. aros가 실온에서 응고되도록 합니다. 주걱을 사용하여 칼날을 올려 블록의 하단 끝을 고르게 잘라 금형에서 경화된 aros 블록을 제거합니다.
슈퍼 접착제 한 방울을 사용하여 블록을 비브라토 스테이지에 고정합니다.tage 원하는 경우 자른 면이 아래로 향하게 합니다. 스테이지에서 여러 블록을 정렬합니다. 스테이지를 비브라토에 부착합니다.
칼날이 각 배아를 완전히 절단하지만 블록을 완전히 절단하지는 않는지 확인하십시오. 스테이지를 하나의 XPBS 섹션으로 채웁니다. 배아는 하나의 아로 블록의 뒤쪽을 조심스럽게 잘라 하나의 XPBS로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.
실체 현미경 아래에서 섹션을 분리합니다. 가는 집게를 사용하여 원하는 섹션을 하나의 XPBS로 채워진 다중 웰 접시에 넣습니다. 각 배아에 대해 다른 웰을 사용하십시오.
DPI와 면역 라벨로 섹션을 안티 GFP로 염색합니다. 그렇지 않은 경우 48시간 이내에 이미징합니다. 슬라이드당 최대 6개의 섹션을 장착하고 컨포칼 이미징을 위해 섹션 상단에 커버 슬립을 놓습니다.
사진 표백을 방지하기 위해 슬라이드를 어두운 곳에 보관하십시오. 라이브 이미징, MGFP 주입 배아는 빛으로부터 보호되어야 합니다. 배아가 원하는 발달 단계에 도달하기 30분 전에 겸자를 사용하여 코팅합니다.
코팅된 배아를 0.01% Trica가 포함된 배아 배지의 진정 용액으로 옮기고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 1 % 규칙의 피펫 방울이 35mm 유리 바닥 배양 접시의 물에서 발생하여 곰팡이를 채웠다. 아그로스가 굳어지도록 합니다.
90mm 유리 모세관 튜브를 사용하여 실체 현미경 아래의 aros 방울에 세 개의 구멍을 만듭니다. 우물의 바닥을 검사하고 집게로 잔여 아로를 제거합니다. 실체 현미경 아래에서 배아 배지로 접시를 채웁니다.
파스타 피펫을 사용하여 배아를 아로스의 각 구멍에 하나씩 이식합니다. 가는 집게를 사용하여 배아의 방향을 잡아 관심 영역(이 경우 등쪽 머리)이 유리에 닿도록 합니다. 접시를 덮으십시오.
접시를 컨포칼 현미경의 스테이지로 조심스럽게 운반하십시오. 공간 히터를 사용하여 이미징 내내 배아를 섭씨 28.5도로 유지합니다. 다음은 야생형 배아의 뒷뇌를 관통하는 4-5개의 소미트(somites)로, 녹색의 GFP와 파란색의 D를 대상으로 하는 막으로 이중 표지된 단 하나의 세포에만 막 결합 GFP로 표지되어 세포의 형태와 조직에 대한 고해상도 이미징이 가능합니다.
이것은 nardi din 돌연변이의 뒷뇌의 비교 가능한 이미지입니다. 이 이미지는 nardi와 돌연변이의 세포가 신경 계시 동안 정중선을 향해 적절하게 방향을 잡지 못한다는 것을 보여줍니다. MGFP로 세포를 표시하는 방법과 달리, 베타-카테닌(beta-catenin)과 같은 일반적인 세포 표면 마커로 후뇌를 라벨링하면 개별 세포의 형태를 시각화할 수 없습니다.
MG FP로 표시된 배아의 뒷뇌에 대한 타임 랩스 이미징은 제브라 피쉬의 신경 관계를 주도하는 세포 행동이 매우 역동적이며 세포가 이동하고 상호 대조할 때 막 돌출부의 확장을 포함한다는 것을 보여줍니다. 고해상도의 단일 세포 이미징을 위해 고정 및 살아있는 제브라 물고기 배아를 모두 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 그게 다야.
시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 연구는 막 표적 Green Fluorescent Protein을 사용하여 제브라피쉬 배아의 신경 세포의 고해상도 이미징 기술을 제시합니다. 이 방법은 단일 세포와 그 동태를 시각화하여 형태 형성 과정에 대한 통찰을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 이미징 기술
배경
- 배아 발달의 이해는 발달 생물학에 중요합니다.
- 고해상도 이미징 기술은 세포 형태를 연구하는 데 필수적입니다.
- 제브라피쉬는 투명한 배아 때문에 모델 생물로 사용됩니다.
- 막 표적 형광 단백질은 이미징 기능을 향상시킵니다.
연구 목적
- 제브라피쉬 배아의 신경 세포 라벨링 및 이미징 방법을 개발합니다.
- 고해상도로 세포 형태 및 동태를 시각화할 수 있게 합니다.
- 초기 발달 동안 형태 형성 과정의 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 1세포 단계 배아에 막 표적 Green Fluorescent Protein을 암호화하는 DNA 주입.
- 모자이크 유전은 흩어진 세포의 향상된 이미징을 가능하게 합니다.
- 고정된 준비물에 대한 항-GFP 면역 라벨링.
- 시간 경과 비디오 현미경을 사용한 생체 이미징으로 세포 동태를 관찰합니다.
주요 결과
- 제브라피쉬 배아에서 단일 세포 형태의 성공적인 시각화.
- 생 배아에서 신경 세포의 동적 이미징.
- 제브라피쉬 후뇌 이미징에 콘포컬 현미경을 사용했습니다.
- 결과는 이 이미징 기술의 효과를 입증합니다.
결론
- 이 기술은 배아 발달 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다.
- 고해상도 이미징은 세포 동태에 대한 통찰을 보여줄 수 있습니다.
- 이 방법은 발달 생물학의 다양한 연구에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-resolution cellular imaging in zebrafish embryos enables precise visualization of neural cell morphology and dynamic behaviors during early development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research pipelines. The approach enhances predictive confidence for early-stage discovery and translational studies involving vertebrate neural systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neural morphogenesis at single-cell resolution for pathway clarification.
- Supports biological de-risking by visualizing cell orientation and migration during neurulation.
- Facilitates functional target validation through direct observation of cellular behaviors in vivo.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish models for downstream imaging-based assays.
- Standardizes cell labeling and imaging protocols for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable screening of genetic or pharmacological perturbations affecting neural development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling vertebrate neural tube formation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through live and fixed imaging outputs.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing cellular mechanisms underlying developmental phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging methodology integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in vertebrate neural development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of neural cell behaviors and morphogenetic processes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative studies.
- Analytics: Delivers high-content morphological and dynamic readouts for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neural development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse neurodevelopmental investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of cellular phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling and microinjection techniques.
- Needs access to confocal microscopy and immunolabeling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different developmental stages or genetic backgrounds.
- Photo-bleaching and mosaic expression are practical limitations to consider.
