Name: Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아의 후뇌 신경세포를 고해상도로 이미징하는 방법을. 막 표적화된 GFP를 이용하여 단일 세포 형태와 역동성을 관찰하고, 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 R. 브루 스터 (1R01GM085290 - 01A1)에게 수여 NIH 교부금에 의해 지원되었다.

1.Microinjection <ol><li> 희석 플라스미드 인코딩 막 타겟 그린 형광 단백질 (mGFP, 리차드 할랜드의 호의) 40 NG / ML의 농도. DNA는 Qiagen의 맥시 준비 키트를 사용하여 정화 플라스미드 (리차드 할랜드의 mGFP/PCS2 +, 호의)를 linearizing으로 준비가되어 있습니다. 솔루션에 페놀 레드 (10분의 1 총 볼륨을 희석)의 추가는 솔루션을 시각화하는 것이 좋습니다. 얼음 DNA 솔루션을 유지. </li><li> 졸업 슬라이드에 바늘을 정렬하고 부드럽게 깨끗한 레이저를 사용하여 직경이 1μm는 바늘의 일부를 도청하여, stereomicroscope에서 주사 바늘을 (CAT 번호 NA - GD - 1 Narishinge 과학에서 90mm 유리 모세관) 보정 블레이드 (적절한 크기의 팁을 얻기 위해). </li><li> 알려진 볼륨 (2nl)을 삽입하기 위해 바늘을 보정하기 위해 microinjection 장치에 바늘을 연결 (PCI 100 Microinjector, 하버드 장치)와 앞에는 조각에 위치 페놀 레드와 물이 들어있는 솔루션 0.5μl으로 바늘을 기입 파라핀니다. 솔루션은 발을 페달을 사용하여 적절하게 사용하실 수 있습니다. 7 KPa로 압력을 설정하고 그것이 솔루션의 0.5μl 특면 250 페달 소요 있도록 (10msec 30msec) 시간을 달라집니다. </li><li> humidified 100mm 배양 접시에있는 왁스의 스트립에있는 눈금 바늘을 조심스럽게 넣습니다. 접시를 ...을 축이다하려면, 가장자리 주위에 서부 유럽 표준시 Kimwipes를 (이것은 바늘에있는 솔루션의 증발을 방지) 장소. </li><li> 바늘 끝 (보정하지 않은 끝)에 DNA 0.5 - 1μl를로드 micropipette을 사용합니다. </li><li> 이 솔루션은 바늘 끝에 도달되면, microinjection 장치에 로딩에 사용했던 바늘의 끝을 연결합니다. 발 페달을 사용하여 약 2 NL / 주사를 제공하기 위해 microinjector에 대한 설정을 조정합니다. </li><li> 엠브료 매체 (1.0 ML 행크의 주식 # 1, 0.1 ML 행크의 주식 # 2, 1.0 ML 행크의 주식 # 4, 95.9 ML ddH 2 O, 1.0 ML 행크의 주식 # 5 가득한 페트리 접시의 중앙에 다음 위치 zebrafish의 배아 , 1.0 ML 신선한 행크의 주식 # 6, 산도 7.2-10 방울 1 M NaOH에 대한 사용). </li><li> 태아가 원하는 단계로 개발한 후, 부드럽게 잘 포셉로 chorion를 손잡이 및 사출을위한 대상 지역에 바늘을 ...을 놓다. 넓은 범위 mGFP 표현은 1cell 단계에서 노른자 또는 세포질로 DNA를 주입. , 작은 지역에 mGFP 표현을 제한하는 하나의 세포의 세포질에 4 (이상) 세포 단계에서 DNA를 주입합니다. </li><li> microinjection 장치의 발을 페달을 누르면 약 2 NL을 제공, 솔루션 (페놀 레드의 추가로 인해 가시)가 제대로 분사는 것을 보장. </li><li> 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 배양 접시에있는 모든 배아에 대해 반복합니다. </li><li> 배아는 28.5에서 원하는 단계 ° C를 개발하도록 허용합니다. </li><li> 부드럽게 잘 포셉을 (배아는 배아의 생존율을 증가 유리 페트리 접시에 dechorionating, 24hpf 미만 경우)를 사용하여 chorion를 벗겨내하여 Dechorionate 배아. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 빈 chorion를 제거합니다. </li></ol> 2. 이미징 mGFP - 표시 vibratome 섹션 <ol><li> 1X 인산 버퍼 용액 (PBS)에 정착액 (4 % paraformaldehyde로 배아의 수송을 유리 피펫을 사용합니다. 4 ° C 하룻밤에 배아를 수정. </li><li> 오분 각 1X PBS에서 배아 3 번 씻으십시오. </li><li> 페트리 접시, 그리고 좋은 집게를 사용하여 배아를 놓고, 배아를 손상시키지 않고 노른자를 제거합니다. 가능한 많은 노른자를 제거합니다. </li><li> H 2 O.에서 4% 낮은 용융 아가로 오스 준비 </li><li> 플라스틱 금형에 sectioning 플레이스 녹은 아가로 오스합니다. </li><li> 페트리 접시에서 주입된 배아를 리프트와 아가로 오스의 장소와 방향을 잘 집게를 사용하십시오. 배아는 주형의 한쪽 끝을 향해 배치되어야합니다. </li><li> 아가로 오스가 강화된되면, 금형의 아가로 오스 블록을 제거하는 등 주걱 같은 평평한 도구를 사용합니다. </li><li> 그것도되도록 면도날와 아가로 오스 블록의 아래쪽 끝부분을 잘라 버릴거야. </li><li> vibratome 무대 슈퍼 접착제 한 방울을 추가하고 그것에있는 아가로 오스 블록 (면도칼로 안정되었다 블록의 측면이 접착제에 직면한다)를 놓으십시오. 여러 개의 배아를 sectioning 들어, 무대에서 여러 아가로 오스 - 임베디드 표본을 탑재합니다. </li><li> (Vibratome 주식 회사) vibratome에 vibratome 무대를 연결합니다. </li><li> (:; 두께 - 50μm 속도 - 3 일반 설정) vibratome의 매개 변수를 설정합니다. 여러 개의 배아를 sectioning 경우, 무대 아가로 오스 블록을 정렬하고 (같은 배아에 해당하는 섹션이 함께 남아있게됩니다 것과 같은)으로 날개가 아가로 오스 블록의 전체 너비를 통해 전체 배아 통해 이뤄지는 아니지만되었는지 확인합니다. </li><li> vibratome 단계 1X PBS 하거라. </li><li> 섹션을 참조하십시오. </li><li> 일단 배아가 sectio입니다네드, vibratome 단계에서 아가로 오스 블록 (들)을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 아가로 오스 블록 (S)의 뒷면을 절단하여 각 섹션을 구분합니다. </li><li> 1X PBS - 채워진 멀티 잘 요리 (다른 배아에 해당하는 부분에 대해 서로 다른 우물을 사용)로 원하는 섹션과 장소를 선택하는 미세 집게를 사용하십시오. </li><li> 각각의 배아에 대해 반복합니다. </li><li> 항체 라벨을 진행, mGFP 영상 (섹션이 준비 하루 이틀 내에 몇 군데있다면이 단계가 필요하지 않을 수 있습니다) 향상시키기 위해, 23 불구하고 19 단계를 반복합니다. </li><li> 비 특정 바인딩을 차단하는 1X PBS에 차단 솔루션으로 실온에서 30 분 섹션을 처리합니다. </li><li> 기본 항체 (토끼 - GFP, Invitrogen 캣 번호 A11122) 4에서 5 상온에서 시간 또는 하루에 쉐이크에 차단 솔루션 @ 1:200 희석 ° C.와 함께 품어 섹션 </li><li> 1% BSA/1X PBS / 1퍼센트 DMSO 용액에서 네 번 (10 분, 15 분, 30 분 및 60 분 각) 씻으십시오. </li><li> 4 5 상온에서 시간 또는 숙박에 대해 차단 솔루션에 적절한 보조 항체와 섹션을 처리 ° C. </li><li> 1% BSA/1X PBS / 1퍼센트 DMSO 용액에서 네 번 (10 분, 15 분, 30 분 및 60 분 각) 씻으십시오. </li><li> 핵을 얼룩이 30 분에 대해, DAPI (Invitrogen 고양이 번호 D1306 50ml 1X PBS에 0.​​1 %의 DAPI)와 섹션을 처리합니다. </li><li> 오분 각 1X PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 슬라이드에 마운트합니다. </li><li> 공촛점 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol> 3. 라이브 영상 <ol><li> 그들은 원하는 발달 단계에 도달 Dechorionate 살고 주입 배아 삼십분 전에. 15 분 대한 진정 솔루션의 배아 (0.01 % 엠브료 매체 Tricaine)을 놓으십시오. </li><li> (; 부품 번호 P35G - O - 20 - C MatTek) 35mm 유리 바닥 문화 요리에 1% 아가로 오스의 드롭 놓습니다. </li><li> 아가로 오스는 응고 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스 3 구멍 (예 : micropipette 팁 같은 다른 개체가 구멍을 만드는 데 사용할 수 있습니다)을 만들기 위해 화염을 통해 열 모세관. 여운 아가로 오스는 구멍 바닥에 없습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 엠브료 매체와 페트리 접시를 입력합니다. </li><li> 구멍에서 배아를 배치 유리 피펫을 사용합니다. </li><li> 다음 방향이 지역 (지느러미 머리) 몇 군데 수 있도록 좋은 집게를 사용하여 난자는 유리와 접촉하고 있습니다. </li><li> 조심스럽게 현미경 스테이지 (증발을 방지하기 위해 페트리 접시 위에 뚜껑을 장소)에 페트리 접시를 전송. </li><li> 이미징 동안 배아는 28.5 ° C.에 있는지 확인하십시오 </li></ol> 4. 검색 결과 우리는 여기서 모자이크 표현을 사용하여 zebrafish 신경 튜브의 이미지를 하나의 세포에 대한 직접적인 접근 방식을 설명합니다. zebrafish 배아의 광학 투명도에도 불구하고, 우리는 신경 세포의 시각화가 크게 vibratome를 사용하여 얻은 크로스 섹션에 향상된 것으로 나타났습니다. 이 섹션 공촛점 현미경을 사용하여 다른 초점 비행기에서 특정 세포에서 세포 이미징을위한 연장 허용 (50 ㎜) 두께입니다. 이 방법론을 사용하는 결과는 다른이 출판되어 있지만, WT 배아 (그림 1)과 N - cadherin (N - CAD)의 신경 튜브에 세포의 대표 이미지는 돌연변이 (그림 2)이 제공됩니다. 후자는 돌연변이 정중선 (그림 2)을 향해 제대로 방향에 실패 N - CAD에 신경 접시의 측면 지역에 세포를 보여줍니다. 이 모자이크 라벨과는 달리, 이러한 베타 catenin과 같은 일반적인 세​​포 표면 마커와 neuroepithelium을 immunostaining하면 각각의 세포의 형태는 (그림 3) 시각을 허용하지 않습니다. 라이브 배아의 시간 저속 영상은 neurulation 동안을 세포 역학의 이해를 가능하게 고정 표본의 모자이크 라벨을 보완. 영화 1 WT 세포가 적극적으로 medially 지향 막 라고나할까요을 확장하여 정중선으로 마이 그 레이션하는 것으로 나타났다. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> WT zebrafish 배아의 신경 튜브 그림 1. mGFP 표현. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> N - cadherin zebrafish 배아의 신경 튜브 그림 2. mGFP 표현. <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> neuroepithelium 그림 3. B - catenin 단백질의 얼룩.

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).</li>
<li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

결론적으로, 분류 기술은 zebrafish 배아에 morphogenetic 프로세스의 단일 세포 분석을위한 수 있도록 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 주요 강조는 유비 쿼터스 모터의 제어하에 mGFP을 사용하여 신경 튜브의 영상 표시 전지 방식에 있습니다. 이 과도 표현 분석 독자의 추가 어플 리케이션을위한 안데르센 외의 최근 논문을 참조해야합니다. 3.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1976">Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain</a>. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

솔루션 <ul><li> 행크의 주식 # 1 : 8.0 g NaCl, 100 ML DD H 2 O에서 0.4 g KCl </li><li> 행크의 주식 # 2 : 0.358 g 나 2 HPO 4 무수, 100 ML ddH 2 O에서 0.60 g KH 2 PO 4 </li><li> 행크의 주식 # 4 : 50 ML ddH 2 O에서 0.72 g CaCl 2 </li><li> 행크의 주식 # 5 : 50 ML DD H 2 O에서 1.23 g MgSO 4 x7H 2 O </li><li> 1 X 인산 버퍼 : 0.8 % NaCl, 0.02 %의 KCl, 0.02 M PO4, 산도 7.3 </li><li> 차단 솔루션 : 2퍼센트 정상 염소 혈청, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 %의 dimethysulfoxide (DMSO) </li></ul>

zebrafish의 hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

초기 척추의 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. zebrafish 배아, 모자이크 표현의 플라스미드 DNA 결과의 주입이 단일 세포 또는 세포의 작은 클러스터의 시각화에 대한 허용에<sup&gt; 1</sup&gt;. 우리는 유비 쿼터스 모터의 제어하에 플라스미드 DNA 인코딩 막 타겟 그린 형광 단백질 (mGFP)의 분사가 neurulation를 겪고 이미징 세포에 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 센트럴 섹션에 있으며, 실시간으로 고해상도의 영상 표시 세포에 대한 방법론이다. 이 프로토콜은 젊은 zebrafish의 배아에 mGFP의 DNA의 삽입을 알아볼 수 있습니다. 배아는 다음 vibratome sectioning, 항체 라벨과 공촛점 현미경으로 영상에 대한 처리됩니다. 또는 mGFP을 표현 라이브 배아는 시간이 경과 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 우리는 이전에 zebrafish 배아의 hindbrain 지역에서 신경 튜브 형성을 유발 세포 행동을 분석하는이 간단한 접근 방법을 사용했을<sup&gt; 2</sup&gt;. 라이브 영상은 neurulation 동안을 세포 역학의 이해를 가능하게이 방법을 보완하면서 고정 준비가 세포 모양과 신경 튜브 조직의 전례 시각화를위한있었습니다.

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

초기 척추동물 배아를 형성하는 형태발생 과정을 이해하는 핵심은 세포를 고해상도로 이미지화하는 능력에 있습니다. 제브라피시(zebrafish)에서...

다음 실험의 전반적인 목적은 제브라피쉬 배아 내 신경 세포를 고해상도로 이미징하는 것입니다. 먼저, 막 표적 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 DNA를 제브라피쉬 배아의 1세포기에 주입하여 모자이크 상속을 유도함으로써, 흩어져 있는 세포들의 이미징 효율을 높입니다. 그 후, 배아를 anti-GFP로 면역 표지하고 절편화하여 고정된 상태에서 단일 세포의 형태를 고해상도로 시각화할 수 있게 합니다. 또는, 세포 역동성을 관찰하기 위해 타임랩스 비디오 현미경을 사용하여 살아있는 배아를 검사할 수도 있습니다.세포 형태 또는 역동성을 보여주는 결과가 도출되었습니다. 여기서는 공초점 현미경을 사용하여 제브라피시 후뇌를 이미징합니다. 여러분 안녕하세요.저는 메릴랜드 대학교 볼티모어 카운티 생물과학과의 Rachel Brewster 박사님 연구실 소속 PR Chandran입니다. 오늘은 제브라피시 배아의 신경 세포를 고해상도로 라벨링하고 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 일반적으로 이 절차를 통해 제브라피시 배아의 신경 분화 기전을 세포 수준에서 연구합니다.이제 시작하겠습니다. 100 mm 페트리 접시의 가장자리를 따라 젖은 Kim wipe를 배치하십시오.가습된 디쉬 내부의 왁스 스트립 위에 유리 미세주입 바늘을 조심스럽게 고정합니다. 해부용 실체 현미경 하에서 눈금 슬라이드에 바늘을 맞춥니다. 적절한 크기의 팁을 얻으려면, 깨끗한 면도날을 사용하여 직경이 1 µm인 지점의 바늘을 가볍게 칩니다.바늘을 미세주입 장치에 연결하고 파라필름 위에 페놀 레드 수용액 0.5 µL를 떨어뜨린 후, 바늘을 액체 방울에 대어 내부를 채웁니다. 미세주입 압력을 7 kPa로 설정하고 20 ms 펄스로 시작합니다. 모든 액체를 분사하는 데 필요한 펄스 횟수를 측정합니다. 분사에 약 250회의 펄스가 소요되도록 펄스 시간을 10 ms에서 30 ms 사이로 조정합니다.용액 0.5 µL를 준비합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 가시화를 위해 페놀 레드(phenol red)와 혼합한 MG FPD NA 수용액 0.5~1 µL를 바늘에 역충전합니다. 실체 현미경 하에서 바늘 내 용액의 증발을 방지하기 위해 습윤 접시의 덮개를 닫습니다.1세포 단계의 분리된 물고기 배아를 embryo.Medium이 채워진 60 millimeter 페트리 접시에 배치하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 배아의 chorion을 부드럽게 잡아 배아를 고정합니다. MGFP와 phenol red가 채워진 바늘을 주입 대상 부위로 이동시키십시오.광범위한 MGFP 발현을 위해 난황 또는 세포질에 주입하십시오. 미세주입 장치를 사용하여 약 2 nanoliters의 MGFP 용액을 전달합니다. 페놀 레드 지시약의 위치를 관찰하여 적절하게 주입되었는지 확인하십시오.배아에서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 한 번에 최대 30개까지, 디쉬에 있는 모든 배아에 주입하십시오. 배아가 빛에 노출되지 않도록 주의하며, 실체 현미경 하에서 배아가 원하는 단계까지 발달할 수 있도록 28.5 °C에서 배양하십시오.미세 핀셋을 사용하여 배아에서 코리안(Corian)을 조심스럽게 벗겨냅니다. 파스타 피펫을 사용하여 디쉬에서 빈 코리안을 제거하고, DEC가 코팅된 배아만 남깁니다. 화염 연마된 파스타 피펫을 사용하여 주입 및 코팅된 배아를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.여분의 배지를 최대한 제거한 다음, active 1 mL를 추가합니다. 상온의 1X PBS로 배아를 5분씩 3회 세척합니다. 실체 현미경 하에서 배아를 1X PBS가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.미세 핀셋을 사용하여 배아의 꼬리 부위 근처를 잡습니다. 두 번째 핀셋 또는 포커(poker)를 사용하여 후방 프레임 부위에 닿지 않게 주의하며 요황낭(yolk)을 최대한 제거합니다. 실체 현미경으로 관찰하면서 미세 핀셋으로 배아를 접시에서 들어 올려 4% 저융점 아가로스(low melting point agarose)가 채워진 섹셔닝 몰드(sectioning mold)에 넣습니다.배아를 몰드의 한쪽 끝으로 배치합니다. aros가 상온에서 응고되도록 둡니다. 스패튤러를 사용하여 굳은 aros 블록을 몰드에서 제거하고, 면도날을 이용해 블록의 하단을 고르게 잘라냅니다.필요한 경우, 순간접착제 한 방울을 사용하여 블록의 절단면이 아래로 향하게 하여 진동 스테이지에 고정하십시오. 스테이지 위에 여러 개의 블록을 정렬합니다. 스테이지를 진동 장치에 부착하십시오.칼날이 각 배아를 완전히 가로지르되, 블록 전체를 완전히 관통하지 않도록 주의하십시오. 스테이지를 1XPBS 섹션으로 채웁니다. 배아를 아가로스 블록의 뒤쪽까지 조심스럽게 절단한 후, 1XPBS가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.실체 현미경 하에서 섹션을 분리합니다. 미세 핀셋을 사용하여 원하는 섹션을 1x PBS가 채워진 멀티웰 디시에 옮깁니다. 배아마다 서로 다른 웰을 사용하십시오.절편을 DPI로 염색하고 anti GFP로 면역 표지합니다. 그렇지 않은 경우, 48시간 이내에 이미징을 수행합니다. 슬라이드당 최대 6개의 절편을 마운트하고, 공초점 이미징을 위해 절편 위에 커버슬립을 덮습니다.광퇴색을 방지하기 위해 슬라이드를 암소에 보관하십시오. 실시간 이미징 시, MGFP가 주입된 배아는 빛으로부터 보호되어야 합니다. 원하는 발달 단계에 도달하기 30분 전에 핀셋을 사용하여 배아를 코팅하십시오.코팅된 배아를 0.01% Trica가 포함된 배아 배지 진정액으로 옮겨 실온에서 15분 동안 배양합니다. 35mm 유리 바닥 배양 접시에 1% 일반 agarose 수용액을 한 방울씩 피펫으로 떨어뜨려 몰드를 채웁니다. agarose가 응고될 때까지 기다립니다.실체 현미경 하에서 90 millimeter 유리 모세관을 사용하여 aros 방울에 세 개의 구멍을 만듭니다. 웰의 바닥을 검사하고 핀셋으로 남아 있는 aros를 제거합니다. 실체 현미경 하에서 배아 배지로 디쉬를 채웁니다.파스타 피펫을 사용하여 배아를 aros의 각 구멍에 하나씩 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 배아의 관심 영역(이 경우에는 머리 등쪽)이 유리에 닿도록 방향을 조절합니다. 디쉬의 덮개를 덮습니다.디시를 공초점 현미경의 스테이지로 조심스럽게 운반합니다. 이미징이 진행되는 동안 배아의 온도를 28.5 °C로 유지하기 위해 공간 가열기를 사용하십시오. 여기 4~5개 체절 단계의 야생형 배아 후뇌 단면이 있으며, 막 표적 GFP(녹색)와 D(청색)로 이중 표지되었습니다. 단 하나의 세포만이 막 결합 GFP로 표지되어 세포의 형태와 조직을 고해상도로 이미징할 수 있습니다.이것은 4~5체절 단계의 nardi din 돌연변이체의 후뇌를 비교한 이미지입니다. 이 이미지는 nardi 돌연변이체의 세포들이 신경관 형성과정 동안 정중선을 향해 적절하게 배열되지 못함을 보여줍니다. MGFP로 세포를 표지하는 방법과 달리, beta-catenin과 같은 일반적인 세포 표면 마커로 후뇌를 표지하면 개별 세포의 형태를 시각화할 수 없습니다.MG FP가 표지된 배아의 후뇌를 타임랩스 이미징으로 관찰하면, 제브라피쉬의 신경 관계를 유도하는 세포 행동이 매우 역동적이며, 세포가 이동하고 상호 배치되는 과정에서 막 돌기의 신장이 수반됨을 알 수 있습니다. 지금까지 고해상도 단일 세포 이미징을 위해 고정된 제브라피쉬 배아와 살아있는 제브라피쉬 배아를 모두 준비하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

이 비디오는 성인 제브라피시의 뇌를 미세 해부하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 더 자세히 연구할 수 있는 전체 뇌 유래 중성구를 얻는 데 도움이 됩니다.

제브라피쉬 뇌 해부: 물고기 신경생물학 기법

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

배우세요 제브라피시 배아의 후뇌 신경세포를 고해상도로 이미징하는 방법을. 막 표적화된 GFP를 이용하여 단일 세포 형태와 역동성을 관찰하고, 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

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