플래시 동결 E12.5 마우스 브레인 Cryosectioning

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스(University of California Irvine)와 에드 마키(Ed Maki) 연구실의 스펜서 컬리(Spencer Curley)이며, 냉동 절제술을 하는 방법을 시연할 예정입니다. 이를 위해 일반적으로 사용되는 시약을 먼저 사용합니다. 제가 사용하는 매립 컴파운드 또는 매립 매체는 최적의 절단 온도를 위해 OCT라고 합니다.

이것은 명확한 해결책이고, 매우 두껍고 점성이 있으며, 조직을 잘 잡아주는 동안 방향을 잡을 수 있다가 얼어붙고, 궁극적으로는 수용성이므로 모든 유형의 염색 과정에서 제거할 수 있습니다. 그래서 나는 조직을 틀에 끼워 넣는다. 이 극저온 금형 생검 용기는 다양한 크기로 제공됩니다.

저는 쥐의 배아 조직을 만들기 때문에 여기에서 이 작은 곰팡이를 사용할 것입니다. 우리는 조직과 액체 질소를 급속 동결합니다. 먼저 이 보호용 진공 플라스크에 여기 탱크의 액체 질소를 채울 것입니다.

조직을 급속 동결하기 전에 조직을 극저온 보호해야 하며, 그렇지 않으면 동결 자체로 인해 조직이 파괴됩니다. 그래서 당신이 할 일은 하룻밤 사이에 30% 자당 용액에 조직을 가라앉히는 것입니다. 그리고 더 오래 걸리더라도 조직이 가라앉는 한 괜찮습니다.

보시다시피, 비자 배아 12.5 일 쥐 머리는 자당 용액에 가라 앉았으므로 얼 준비가되었습니다. 이제 저는 자당 용액에 들어 있는 조직을 더 큰 접시에 부어 조직을 조작할 수 있습니다. 이 OCT를 가져다가 실제로 뚜껑에 놓여 있는 이 35mm 접시에 부어 비스듬히 넣을 수 있습니다.

따라서 OCT는 깊이를 위해 가장자리를 따라 웅덩이가 됩니다. 그래서 저는 한 쌍의 뭉툭한 집게를 사용하고 있는데, 그 이유는 날카로울 필요가 없고 다른 집게를 망치고 싶지 않기 때문입니다. 그래서 저는, 저는 그것들을 가져다가 이 머리들 중 하나를 아주 부드럽게 들어올려서 OCT의 첫 번째 욕조에 넣습니다.

OCT에서 배아를 코팅하고 싶습니다. 이것은 조직을 더 좋고 균일하게 동결할 수 있도록 합니다. 조직 주위에 잔류 자당이나 기포가 남는 것을 원하지 않습니다.

기포는 확실히 피하십시오. 그래서 저는 OCT를 머리 주위와 아래에서 부드럽게 저어주고, OCT를 통해 머리를 움직이고, 저온 틀을 채우는 동안 몇 초 동안 그대로 둡니다. 이제 저는 기포를 피하면서 다시 OCT로 극저온 주형을 채울 것입니다.

그리고 저는 그것을 틀의 꼭대기까지 채울 것입니다. 그리고 아시다시피, 저는 곰팡이에 라벨을 붙였습니다. 그래서 저는 그것이 얼어붙은 후에 제 방향을 볼 수 있을 것입니다.

OCT가 얼면 하얗게 변하고 더 이상 조직을 볼 수 없습니다. 따라서 영구 마커에 레이블을 지정하고 싶습니다. 그만큼, 크라이오 몰드.

저는 실제로 OCT에서 거품을 얻었기 때문에 집게를 사용하여 가장자리 너머로 밀어낼 것입니다. 당신은 그것이 당신의 조직, 당신의 조직을 얼리는 것을 방해하는 것을 원하지 않습니다. 이제 이 접시의 머리를 내 틀에 있는 OCT로 옮길 것입니다.

접시에서 꺼내 틀에 아주 부드럽게 넣겠습니다. 그런 다음 현미경으로 가서 조직의 방향을 잡을 것입니다. 여기 저의 극저온 주형에 조직이 있고 방향을 잡을 수 있도록 스코프를 살펴볼 것입니다.

저는 이 마우스 머리를 통해 코로나 절개를 할 것입니다. 그래서 관상 절편을 위한 저온 유지 장치에 배치할 수 있도록 방향을 지정해야 합니다. 그래서 다시 말하지만, 저는 이 뭉툭한 집게를 사용하고 있으며 보시다시피 여기에 거품이 몇 개 있고 그것들을 빼내기 위해 최선을 다할 것입니다.

그러나 이 작은 거품은 나쁘지 않습니다. 나는이 작은 거품에 대해 아무것도 눈치 채지 못했습니다. 당신은 단지 큰 거품을 원하지 않습니다.

그래서 저는 제가 할 수 있는 한 최선을 다해 그것들을 꺼내고 거품을 더 잘 피할 수 있기 때문에 집게를 자주 닦을 것입니다. 이제 제 라벨링이 보이시면 여기 위에 t가 있고 여기 왼쪽에 F가 있습니다. 그것은 단지 머리, 머리 꼭대기가 위로 오고 앞쪽 또는 얼굴이 내 왼쪽에 있을 것임을 나타냅니다.

그렇게 하면 관상 절편을 위해 어느 표면을 절제해야 하는지 알 수 있고 조직을 살짝 밀기만 하면 됩니다. 그리고 다시 말하지만, 때때로 거품이 생기면 거품이 조직과 함께 얼지 않도록 거품을 밀어내고 싶을 때가 있습니다. 따라서 거품이 있는 것은 주로 얼어붙을 때 조직 거품이 일관되지 않은 동결을 유발할 수 있기 때문에 좋지 않습니다.

급속 동결의 목적은 모든 것을 한 번에 동결시키는 것입니다. 또한, 조직과 저온 유지 장치를 절단할 때, 칼날이 OCT나 조직이 아닌 기포를 통과하면 걸림돌이나 찢어짐이 생길 수 있고, 조직을 파괴하거나 부러뜨릴 수 있습니다. 그래서 당신은 어떤 대가를 치르더라도 이러한 거품을 피하고 싶습니다.

특히 큰 것들. 그래서 저는 여전히 여기에서 방향을 잡고 있습니다. 이 조직은 24시간 동안 고정되어 있어 내 조작에 꽤 견고합니다.

다른 조직은 조금 더 부드러울 수 있으므로 매우 부드럽기를 원합니다. 따라서 얼굴이 왼쪽, 머리 상단이 위로 향하도록 스코프 아래에 배치한 후에는 다른 방향 평면에서도 올바른지 확인해야 합니다. 그래서 저는 큐브의 모든 면을 들어 올려 살펴보고 제대로 작동하는지 확인할 것입니다.

그리고 약간 기울어져 있는 것을 볼 수 있으므로 집게로 들어 올리기만 하면 됩니다. 그래? 그리고 이것은 확실히 많은 연습이 필요합니다. 좋아, 좋아 보인다.

이제 여기로 걸어가서 액체 질소에 얼릴 것입니다. 자, 이제 조직이 극저온 주형에서 적절한 방향을 잡았으므로 여기 이 접시에 액체 질소를 부을 것입니다. 이것은 조직 배양을 위한 일반 플라스틱 페트리 접시입니다.

그것은 꽤 빨리 증발합니다. 집게를 가지고 크라이오 몰드를 내릴 것입니다. 보시다시피 저는 실제로 아랫입술을 구부렸습니다.

그것은 확실히 더 좋고 더 나은 핸들링을 허용합니다. 얼려버릴 거야. 그리고 조직과 OCT가 얼면 단색으로 흰색으로 변합니다.

그리고 일단 완성되면 모두 흰색이 될 것입니다. 그런 다음 냉동 조직을 영하 80도 냉동고에 재빨리 넣어 보관해야 합니다. 조직이 물에 잠기지 않도록 잡고 싶습니다.

따라서 액체 질소의 상단 표면에 잡는 것만으로도 매우 조심해야 합니다. 좋아, 이제 얼었습니다. 마이너스 80으로 가기 전에 몇 초 더 누르고 있습니다.

자, 이제 마이너스 80으로 가져갈 것입니다. 그래서 저는 마이너스 80에서 조직을 가져와서 여기 이 저온 유지 장치에 넣었습니다. 챔버는 실제로 섭씨 영하 24도까지 내려갑니다.

지금 당장은 절편을 시작하기 전에 약 30분에서 1시간 동안 조직이 평형을 이루도록 해야 합니다. 그렇지 않으면 너무 부서지기 쉽습니다. 따라서 모든 cryos 통계는 다르지만 여기에서 이 기계에 대한 몇 가지 기본 사항을 지적

그래서 우리는 라이카 CM 30 50 s를 사용합니다. 시편 자체를 위한 별도의 냉각 장치가 있기 때문에 좋은 기계이며, 이는 좋은 추가 이점입니다. 시편 온도를 설정할 수 있으며 조직마다 절단에 다른 온도가 필요합니다.

따라서 조직을 처음 로드할 때 몇 가지 조정을 해야 합니다. 그리고 이것들은 모든 극저온 통계에서 유사합니다. 이것들은 전자 제품이며 그 중 일부는 손으로 작동됩니다.

예를 들어, 저온 유지 장치의 암을 집어넣거나 블레이드에 더 멀리 또는 더 가깝게 배치하기 위해 전진해야 합니다. 빠르거나 느리게 할 수 있습니다. 여기에서 이 플러스 또는 마이너스로 절단 두께를 설정할 수 있습니다.

그리고 여기 중간 버튼에 표시된 트림 또는 단면 두께 중에서 선택합니다. 이 디지털 디스플레이 옆에 있는 챔버 또는 표본 자체의 온도를 설정하고 이 버튼을 누르고 위 또는 아래 화살표를 사용하여 온도를 조정하기만 하면 됩니다. 그래서 우리는 냉동 절편을 할 때 이 물고기 낚시꾼 브랜드의 Super frosts plus 현미경 슬라이드를 사용합니다.

그들은 가공 중 조직이 벗겨지지 않도록 약간의 접착제로 코팅되어 있습니다. 때때로 절편하는 동안 조직이 약간 부드러워 보이는 것을 알 수 있으며 그 징후는 칼날에 부딪혀 뭉치는 경우입니다. 그리고 그것을 고치기 위해 사용할 수 있는 것은 이 Fisher 브랜드의 매우 친근한 동결입니다.

그것은, 그것은, 그것은, 그것이 조직을 순식간에 얼려버리고 당신이 그것을 당신의 조직에 겨누고 방아쇠를 누르기만 하면 조직이 너무 부드러우면 조직을 빠르게 다시 얼릴 것입니다. 절단을 위해 조직을 척에 장착하기 전에 여기 기계에 있는 몇 가지 사항을 간략하게 안내해 드리고자 합니다. 그래서 이것은 이 금속판으로 고정된 블레이드를 실제로 적재하는 곳입니다.

이 암을 위로 당기면 실제로 필요에 따라 블레이드를 제거하고 교체할 수 있습니다. 깔끔하고 안전한지 확인하세요. 칼날을 과도하게 고정하고 싶지 않으면 실제로 뒤틀리게 됩니다.

그리고 절편에서 조직 두께가 일관되지 않고 일관되지 않다는 것을 알 수 있습니다. 그래서 당신은 이 팔을 끝까지 밀고 싶지 않습니다. 당신은 칼날 자체를 가지고도 그것이 있는 곳으로 그것을 가져가고 싶어합니다.

이것은 단면화 중에 조정해야 할 수 있는 또 다른 사항입니다. 안티롤 플레이트라고 합니다. 여기 이 홀더에 맞는 유리 조각이며 여기에서 이 스프링이 장착된 나사를 사용하여 조정할 수 있습니다.

그리고 기본적으로 앞뒤로 움직입니다. 그리고 그것은 당신이 슬라이드에 장착할 수 있도록 당신의 조직이나 부분을 평평하게 유지할 것입니다. 단면 중에 조정하고 싶은 또 다른 사항은 실제 절단을 수행하는 블레이드의 위치입니다.

그래서 어떻게 조정합니까, 즉 이 레버를 올리기만 하면 이 전체 장치를 왼쪽이나 오른쪽으로 밀 수 있습니다. 그리고 당신은 당신의 조직이 블레이드의 특정 부분에 걸린 것을 발견하거나 블레이드가 다소 비싸기 때문에 블레이드를 저장하려는 경우에만 실제로 사용합니다. 따라서 이것을 앞뒤로 움직이는 것만으로도 멋진 깨끗한 영역을 찾을 수 있습니다.

조정할 수 있는 또 다른 사항은 절단 각도입니다. 이제 여기 보시지 못할 측면에는 세 가지 다른 위치가 있습니다. 우리는 중간 위치를 사용하고 다른 레버를 들어 올려 조정합니다.

그리고, 그것은 할 수 있습니다, 당신은 이 장치를 위아래로 움직일 수 있습니다. 우리는 항상 중간에 둡니다. 그래서 저는 지금 그 상태를 유지

여기 저온 유지 장치의 머리가 있습니다. 그것은 실제로 절편화되는 냉동 조직 표본을 잡을 것입니다. 그것은 위아래로 흔들리며 칼날을 향해 전진합니다.

그리고 기본적으로 여기 이 척에 조직을 장착하고 척을 머리에 놓고 조인 다음 뒤쪽에 있는 이 손잡이를 사용하여 각도를 조정하여 더 직선으로 절단할 수 있습니다. 이제 조직을 척에 장착하겠습니다. 먼저 OCT 층을 추가하기 때문에 척을 실온에서 유지하고 싶고 멋진 평평한 층이 되기를 원하기 때문에 즉시 동결되는 것을 원하지 않기 때문입니다.

그리고 우리는 여기에서 이 장치를 사용하여 열 추출기라고 합니다. 사실, OCT가 얼어붙을 때 평평하게 만드는 데 사용됩니다. 그래서 제가 가장 먼저 하는 일은 실내 온도를 확인하고 여기 이 홀더에 넣

내 OCT 버블을 가져 가라. 그들은 짜낼 것이기 때문에 여기서는 중요하지 않습니다. 조금만 추가하면 많이 필요하지 않습니다.

추출기를 가져다가 바로 거기에 앉으십시오. 몇 초간 기다립니다. 그리고 거기에서 OCT가 멋지고 평평하다는 것을 알 수 있습니다.

자, 이제 티슈를 얻었고 실제 OCT를 표시해야 합니다. 자, 이제 OCT to에 위치를 표시하기 위해 점을 표시하겠습니다. 자, 저는 상단을 파란색 점으로 표시했습니다.

이제 저는 주형에서 조직 블록을 꺼내고 그 뒤쪽을 밀기만 하면 됩니다. 그래서 뒷면을 살짝 밀고 손에 밀어 넣지만 다시 말하지만 해동을 원하지 않습니다. 그래서 바로 다시 넣었습니다.

이제 보시다시피, 제가 붙인 파란 자국이 있는 조직 블록입니다. 그래서 저는 그것이 배아의 머리 꼭대기라는 것을 압니다. 그리고 저는 얼굴을 절제하고 싶은데, 이건 관상 절벽이기 때문입니다.

이제 제가 할 일은 OCTA 큰 물방울을 한 방울 더 넣는 것이고, 모든 것이 차갑기 때문에 지금 빨리 행동해야 합니다. 그리고 티슈를 가져다가 바로 가운데에 놓고 이미 만들어진 OCT 침대에 평평하게 맞는지 확인합니다. 이제 저는 그것을 얼려버리고 1-2분 정도 걸릴 것입니다.

이제 얼어붙었습니다. 그리고 저는 척에 장착된 티슈를 가져다가 머리에 넣고 가능한 한 똑바로 세운 다음 조일 것입니다. 할 수 있습니다, 멋지고 빡빡합니다.

블레이드 바로 앞에 놓고 전진시키면 몇 초가 걸릴 수 있습니다. 자, 이제 칼날의 평평한 가장자리를 사용하여 조직을 세밀하게 배치해 보겠습니다. 그래서 저는 단순히 가장자리를 보고 조직을 위아래로 흔들어 가장자리가 정렬되도록 합니다.

않다면, 아시다시피, 이렇게 보일 수 있습니다. 분명히 과장하고 있지만, 여기에서 볼 수 있듯이 칼날에 똑바로 부딪히지 않습니다. 그래서 저는 제가 할 수 있는 한 최대한 똑바르다고 느낄 때까지 계속 조정합니다.

꽤 괜찮은 것 같아요. 그래서 저는 모든 각도에서 티슈가 칼날에 똑바로 절단되는지 확인하고 칼날의 가장자리를 사용하여 이를 나타냅니다. 그래서 저는 위를 보고 있고 측면에서 보고 있는데 티슈는 실제로 꽤 좋아 보입니다.

많은 조정을 할 필요는 없지만, 조정하면 머리 뒤쪽에 있는 손잡이만 사용할 것입니다. 그리고 왼쪽이나 오른쪽으로 돌리면 그런 식으로 미세 조정을 할 수 있음을 알 수 있습니다. 하지만 꽤 좋아 보입니다.

이제, 저는, 저는 실제로 조직을 발전시키고 있습니다. 그것은, 칼날에 반대하지 않기 때문에 아직 절단되지 않았습니다. 조직은 OCT 깊숙이 박혀 있습니다.

따라서 조직에 도달하는 데 몇 분이 걸릴 수 있습니다. OCT와 조직을 잡아 깨뜨릴 수 있기 때문에 너무 빨리 가고 싶지 않지만 영원히 걸릴 수 있기 때문에 너무 느리게 가고 싶지도 않습니다. 이 기계에는 더 두꺼운 부분에서 트림을 수행할 수 있는 멋진 기능이 하나 있어 더 빨리 갈 수 있습니다.

그래서 지금 저는 사실, 10월을 통과하고 있습니다, 그래서 저는 약간 속도를 늦추고 있습니다. 그래서 저는 아직 조직에 도달하지 못했지만, 지금은 절편이 어떻게 진행될 것인지 평가하는 시간입니다. 많은 변수들이 여러분의 조직 절편을 정말 잘 진행시키거나 또는 정말 나쁘게 만들 수 있습니다.

이 저온 유지 장치에서 가장 자주 발생하는 것은 조직이 실제로 너무 차갑다는 것입니다. 온도를 낮췄지만 여전히 조금 너무 추운 것 같습니다. 그리고 무슨 일이 일어나는지 블레이드는 조직을 통해, 또는 OCT를 통해 떨릴 것입니다.

그래서 여러분은 이 작은 선들, 이 수평선들을 OCT를 통해 얻게 될 것입니다. 내가 하는 일은 엄지손가락을 잡고 가장자리를 따뜻하게 하고, 부드럽게 터치하고, 엄지손가락을 미끄러뜨리는 것만으로도 OCT를 따뜻하게 하는 것입니다. 그리고 나서 그것을 섹션링했을 때, 나는 그들이 훨씬 더 잘 나오고 수다쟁이가 멈춘다는 것을 알았습니다.

그래서 이런 것들은 제가 조직에 도달하기 전에 평가할 것들입니다. 그래서 저는 칼날이 조직을 통과할 때 실제로 OCT에 걸림돌이나 균열이 있다는 것을 알아차렸습니다. 그래서 제가 가장 먼저 하는 일 중 하나는 칼날을 교체하는 것입니다.

이 칼날이 여기에 얼마나 오래 있었는지, 누가 나보다 먼저 사용했는지 잘 모르겠기 때문에 새 칼날을 꺼내려고 합니다. 이것들은 분명히 매우 날카롭기 때문에 조심해야 합니다. 그래서 저는 안티롤 플레이트를 조정할 것이고 여기 바닥에 나사 스프링이 장착된 나사가 있는데 아래에 손을 뻗기만 하면 안팎으로 이동할 수 있습니다.

그래서 저는 이제 티슈에 들어갈 수 있을 만큼 충분히 발전하고 절편화했습니다. 그리고 불행히도 OCT 블록을 통해 균열이 생기는데, 이는 자주 발생하고 불행히도 실제로 통제할 수는 없지만 이를 해결하기 위해 할 수 있는 일이 있습니다. 균열이 조직을 통과한 경우 샘플을 버리거나 가능한 한 회수하려고 노력해야 합니다.

이 경우 균열이 조직 위에 있는 것 같습니다. 그래서 제가 할 일은 저온 유지 장치에 들어있는 면도날을 사용하는 것입니다. 그건, 차갑습니다.

그리고 OCT 블록의 맨 위에 있는 금이 간 부분을 잘라내려고 합니다. 그래서 다시 한 번, 엄지손가락을 사용하여 OCT 블록의 표면을 가열하겠습니다. 그런 다음 섹션을 잘라낼 건데, 여기 보시면 금이 간 것입니다.

그래서 거기서 티슈와 함께 조각을 떼어냈고, 방금 던져버린 10월 10월의 나머지 부분을 떼어냈는데, 금이 간 부분이었습니다. 그래서 제가 할 일은 식힌 면도날을 사용하여 금이 간 부분을 잘라내는 것입니다. 나는 매우 똑바로 들어가야 하고 양손을 사용하고 블레이드에 고르게 압력을 가해야 합니다.

그리고 저는 칼날을 OCT로 앞뒤로 흔들 것입니다. 그래서 저는 앞뒤로 흔들면서 OCT를 천천히 자르고 있습니다. 금이 간 부분을 제거하고 있기를 바랍니다.

좋아요, 이 과도한 OCT를 제거하는 방법을 줄이겠습니다. 좋아요, 좋아 보입니다. 그런 다음 블레이드에 걸릴 수 있는 가장자리를 만들었기 때문에 헤드를 약간 집어넣을 것이고, 그런 일이 발생하면 실제로 OCT와 조직이 부러져 샘플을 망칠 수 있습니다.

그래서 저는 움츠러들었고, 그래서 조직 속으로 다시 들어가려면 조금 더 전진해야 할 것이고, 바라건대 균열을 바로잡았기를 바랍니다. 자, 이제 다시 티슈 안으로 들어가겠습니다. 좋아, 내가 고친 것 같아.

따라서 더 이상 OCT에 균열이 없어 섹션을 훨씬 쉽게 캡처할 수 있습니다. 이제 제가 관심 있는 조직 부분으로 넘어가겠습니다. 바로 지금, 저는 지금 막 수면 위로 떠오르고 있고, 이 배아의 뇌 속으로 들어가 보고 싶습니다.

이것들은 제가 관심 있는 구조를 실제로 볼 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 나는 이 브러시를 사용하여 캡처할 각 섹션 사이의 블레이드를 청소한다는 것을 언급하지 못했습니다. 이 큰 것은 해당 부위를 청소하고 과도한 ooc OCT를 제거하기 위한 것입니다.

나는 또한 이 더 미세한 브러시를 사용하여 여기에서 이 냉각판에 대한 섹션을 조작하여 섹션에서 캡처할 때 위치를 지정합니다. 다시 말하지만, 이것들은 차갑게 유지되므로 OCT가 녹지 않고 브러시에 달라붙지 않습니다. 그래서 조직을 캡처하기 위해 먼저 엄지손가락으로 OCT와 조직을 가열할 것입니다.

제가 이미 라벨을 붙인 슬라이드 중 하나를 예로 들어 보겠습니다. 나는 그것을 거꾸로 들고 모든 사람이이 일을합니다. 하지만 제가 하는 방식은 슬라이드가 오른손으로 아래를 향할 때 이 오른쪽 상단 모서리를 잡는 것을 좋아합니다.

그런 다음 왼쪽 엄지 손가락을 피벗 포인트로 사용하여 플레이트를 똑바로 아래로 내려가 섹션을 캡처할 수 있습니다. OCT와 조직은 실제로 슬라이드에 부딪혀 녹아서 자체적으로 장착됩니다. 그래서 먼저 엄지손가락으로 티슈를 천천히 따뜻하게 하고, 슬라이드를 잡고, 오른손으로 오른쪽 모서리를 잡고, 플레이트를 움직여 똑바로 내려서 녹입니다.

티슈를 보고 접힌 부분이나 기포가 없는지, 보기가 좋은지 확인하겠습니다. 그리고 저는 뇌 전체를 절제할 때까지 이 작업을 계속할 것입니다. 저는 이제 해부 범위를 통해 섹션들을 살펴보고 있는데, 그것들이 보기 좋은지, 그리고 잘 보이는지, 섹션 상단에 있는 전뇌를 볼 수 있는지, 그리고 그것들이 모두 매우 멋지게 보이는지 확인합니다.

이러한 극저온 절편을 in situ hybridization과 같은 작업에 사용할 수 있습니다. 우리는 때때로 기본 조직학, h 및 e 염색을 수행합니다. 또한 면역형광을 할 수 있으며 이와 같은 여러 가지 분석을 할 수 있습니다.

특히 저의 경우, 이 섹션은 현장 혼성화를 위해 고정되고 처리되었습니다. 이것이 제가 다음에 할 일입니다.