플래시 동결 E12.5 마우스 브레인 Cryosectioning

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 Ed Maki 연구실 소속 Spencer Curley이며, 냉동 절편 제작 방법을 시연하겠습니다. 이를 위해 먼저 일반적으로 사용되는 시약들을 사용합니다. 제가 사용하는 임베딩 화합물 또는 임베딩 매질은 최적 절단 온도라는 의미의 OCT입니다.

이 용액은 투명하고 매우 걸쭉하며 점성이 있어, 조직의 방향을 잡는 동안 조직을 잘 고정해주며 이후에는 동결됩니다. 또한 최종적으로 수용성이므로 모든 종류의 염색 과정 중에 제거할 수 있습니다. 저는 몰드에 조직을 매립합니다. 이러한 cryo mold 생검 용기는 다양한 크기로 제공됩니다.

마우스의 배아 조직을 사용하기 때문에 여기 있는 더 작은 몰드를 사용하겠습니다. 저희는 조직을 액체 질소로 급속 냉동합니다. 먼저, 여기 있는 탱크에서 액체 질소를 가져와 이 보호 진공 플라스크를 채우겠습니다.

조직을 급속 냉동하기 전에 소위 동결 보호(cryo protect)라고 하는 과정을 거쳐야 하며, 그렇지 않으면 냉동 과정 자체가 조직을 파괴하게 됩니다. 따라서 조직을 30% sucrose 용액에 담가 하룻밤 동안 둡니다. 시간이 더 걸리더라도 조직이 바닥으로 가라앉기만 한다면 괜찮습니다.

보시는 바와 같이, 배아 12.5일차 마우스 머리가 설탕 용액 속으로 가라앉았으므로 동결 준비가 되었습니다. 이제 조직을 더 쉽게 다루기 위해 설탕 용액에 담긴 조직을 더 큰 접시에 붓겠습니다. OCT를 적당량 취해 뚜껑 위에 올려 각도를 조절한 35mm 접시에 붓겠습니다.

OCT가 깊이 조절을 위해 가장자리를 따라 고이게 됩니다. 여기서는 끝이 뭉툭한 오래된 핀셋 한 쌍을 사용하는데, 날카로울 필요가 없을 뿐더러 다른 핀셋을 망가뜨리고 싶지 않기 때문입니다. 핀셋으로 이 머리 표본 중 하나를 매우 조심스럽게 들어 올려 첫 번째 OCT 용액에 넣습니다.

배아를 OCT로 코팅하기만 하면 됩니다. 이렇게 하면 조직을 더 효과적이고 균일하게 동결할 수 있습니다. 조직 주변에 잔류 sucrose가 남거나 기포가 생기지 않도록 해야 합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하십시오. OCT를 머리 주변과 아래쪽으로 부드럽게 저어주며, 머리를 OCT 속에서 움직여 줍니다. 그 상태로 몇 초간 둔 다음 크라이오 몰드(cryo mold)를 채웁니다. 이제 다시 기포가 생기지 않도록 주의하며 크라이오 몰드에 OCT를 채우겠습니다.

그리고 몰드의 맨 윗부분까지 가득 채우겠습니다. 보시다시피 제가 몰드에 표시를 해두었기 때문에, 냉동 후에도 방향을 확인할 수 있을 것입니다.

OCT 화합물이 얼면 하얗게 변하여 조직을 더 이상 볼 수 없게 됩니다. 따라서 크라이오 몰드(cryo mold)에 유성 매직으로 반드시 표시를 해두어야 합니다.

실제로 OCT 내에 기포가 생겼으므로, 포셉을 사용하여 가장자리 밖으로 밀어내겠습니다. 기포가 조직의 동결을 방해해서는 안 되기 때문입니다. 이제 이 디쉬에 있는 머리를 몰드 안에 있는 OCT로 옮기겠습니다.

접시에서 조직을 들어 올려 몰드에 매우 조심스럽게 넣겠습니다. 그런 다음 현미경으로 이동하여 조직의 방향을 잡겠습니다. 여기 크라이오 몰드에 조직이 들어 있으며, 현미경으로 관찰하며 방향을 설정하겠습니다.

이 마우스 머리를 관상면으로 절단할 예정입니다. 따라서 관상면 절단을 위해 크라이오스탯(cryostat)에 배치할 수 있도록 방향을 잡아야 합니다. 다시 한번, 끝이 뭉툭한 핀셋을 사용하여 여기 보이는 기포들을 최대한 제거해 보겠습니다.

하지만 이러한 작은 기포들은 나쁘지 않습니다. 저는 이런 작은 기포들로 인해 발생하는 문제는 발견하지 못했습니다. 단지 큰 기포가 생기지 않도록 주의해야 합니다.

따라서 가능한 한 조심스럽게 밀어내어 옮길 것이며, 기포 발생을 더 효과적으로 방지하기 위해 핀셋을 자주 닦아주겠습니다. 이제 제가 표시한 라벨을 보시면, 위쪽에는 T가, 왼쪽에는 F가 적혀 있습니다. 이는 머리 윗부분이 위로 가고, 전면 또는 얼굴 부분이 제 왼쪽에 위치하게 됨을 의미합니다.

이렇게 하면 관상면 절단을 위해 어느 표면을 절단해야 하는지 알 수 있으며, 조직을 살짝 밀어줍니다. 또한, 때때로 기포가 발생할 수 있는데, 조직과 함께 얼지 않도록 기포를 밖으로 밀어내야 합니다. 기포가 있으면 좋지 않은데, 주된 이유는 동결 시 조직 내 기포가 불균일한 동결을 유발할 수 있기 때문입니다.

급속 동결의 목적은 모든 부분을 동시에 동결시키기 위함입니다. 또한, 크라이오스탯(cryostat)으로 조직을 절단할 때, 칼날이 OCT 화합물이나 조직이 아닌 기포를 통과하게 되면 걸림이나 찢어짐이 발생하여 조직이 손상되거나 파손될 수 있습니다. 따라서 이러한 기포는 반드시 모든 수단을 동원하여 방지해야 합니다.

특히 크기가 큰 것들이 그렇습니다. 그래서 여기서 여전히 방향을 잡고 있습니다. 이 조직은 24시간 동안 고정되었으므로, 조작 시 상당히 견고합니다.

다른 조직은 약간 더 부드러울 수 있으므로 매우 조심스럽게 다뤄야 합니다. 따라서 얼굴이 왼쪽으로 가고 머리 윗부분이 위를 향하도록 현미경 아래에 배치한 후, 다른 방향의 평면에서도 위치가 정확한지 확인해야 합니다. 그러므로 큐브의 모든 면을 들어 올려 살펴보며 제대로 배치되었는지 확인하겠습니다.

약간 아래쪽으로 기울어져 있는 것이 보이므로, 핀셋으로 살짝 들어 올려야 합니다. 아시겠죠? 이 과정은 확실히 많은 연습이 필요합니다. 네, 상태가 좋아 보입니다.

이제 이쪽으로 이동하여 액체 질소로 급속 냉각하겠습니다. 조직이 크라이오 몰드 내에 적절하게 배치되었으므로, 이제 이 접시에 액체 질소를 붓겠습니다. 이것은 일반적인 조직 배양용 플라스틱 페트리 접시이며, 상단까지 가득 채우겠습니다.

상당히 빠르게 증발합니다. 포셉을 사용하여 cryo mold를 내리겠습니다. 보시는 바와 같이, 하단 립 부분을 실제로 구부려 두었습니다.

그러면 확실히 더 원활하게 처리할 수 있습니다. 이제 이를 급속 동결시키겠습니다. 조직과 OCT가 얼면서 고체 상태의 흰색으로 변합니다.

과정이 완료되면 전체가 하얗게 변합니다. 그 후 냉동된 조직을 보관을 위해 빠르게 -80°C 냉동고에 넣어야 합니다. 이때 조직이 액체에 잠기지 않도록 잡고 있어야 합니다.

따라서 액체 질소의 표면에만 살짝 닿도록 매우 주의해서 잡아야 합니다. 이제 동결되었습니다. -80°C 냉동고로 옮기기 전, 그 상태로 몇 초 더 유지하십시오.

이제 샘플을 -80°C 보관함에서 꺼내겠습니다. -80°C에 보관했던 조직을 꺼내 여기 있는 크라이오스탯(cryostat)에 넣었습니다. 챔버의 온도는 현재 -24°C까지 내려가 있는 상태입니다.

절단을 시작하기 전에 조직을 약 30분에서 1시간 정도 평형 상태로 두어야 합니다. 그렇지 않으면 조직이 너무 잘 부서집니다. 모든 크라이오스탯(cryostat)은 서로 다르지만, 여기 있는 장비의 기본적인 사항들에 대해 설명해 드리겠습니다.

저희는 Leica CM 30 50 s를 사용합니다. 이 장비는 시료 자체를 위한 별도의 냉각 장치가 있어 매우 유용합니다. 시료 온도를 설정할 수 있으며, 조직의 종류에 따라 절편 제작에 필요한 온도가 다르기 때문입니다.

따라서 조직을 처음 로드할 때 몇 가지 조정을 해야 합니다. 이러한 조정 과정은 모든 cryostat에서 유사하며, 일부는 전자식이고 일부는 수동으로 조작합니다.

예를 들어, 크라이오스탯의 암(arm)을 후퇴시키거나 전진시켜 블레이드로부터 더 멀리 또는 더 가깝게 위치시켜야 합니다. 이 동작은 빠르게 또는 느리게 조절할 수 있습니다. 절단 두께는 여기 있는 플러스(+) 또는 마이너스(-) 버튼으로 설정할 수 있습니다.

그리고 여기 중앙 버튼에 표시된 트리밍 또는 섹션 두께 중에서 선택합니다. 이 버튼을 누른 후 상하 화살표를 사용하여 온도를 조절하면, 디지털 디스플레이 옆에 표시되는 챔버 또는 시료 자체의 온도를 설정할 수 있습니다. 저희의 경우, 동결 절편 제작 시 Fisher 브랜드의 Superfrost Plus 현미경 슬라이드를 사용합니다.

처리 과정 중에 조직이 떨어지지 않도록 접착제가 코팅되어 있습니다. 때때로 박절(sectioning) 중에 조직이 약간 부드럽게 느껴질 수 있으며, 칼날에 닿았을 때 조직이 뭉치는 현상이 그 징후일 수 있습니다. 이를 해결하기 위해 Fisher 브랜드의 super friendly freeze를 사용할 수 있습니다.

이 장치는 조직을 급속 동결시킵니다. 조직을 향해 조준하고 트리거를 누르면, 조직이 너무 부드러운 경우 빠르게 다시 동결할 수 있습니다. 절편 제작을 위해 조직을 척(chuck)에 고정하기 전에, 장비의 몇 가지 구성 요소들을 빠르게 살펴보겠습니다. 이곳이 실제로 블레이드를 장착하는 곳이며, 이 금속판으로 고정됩니다.

이 레버를 위로 당기면 필요에 따라 블레이드를 제거하고 교체할 수 있습니다. 블레이드가 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 블레이드를 너무 세게 조이면 변형될 수 있으므로 주의하십시오.

절편 제작 시 조직의 두께가 일정하지 않다는 점을 알 수 있을 것입니다. 따라서 이 암(arm)을 끝까지 아래로 밀어 내리지 마십시오. 암이 칼날 자체와 거의 수평이 되는 지점까지만 맞추어야 합니다.

절편 제작 중에 조정해야 할 수도 있는 또 다른 장치가 있습니다. 바로 안티롤 플레이트(anti-roll plate)입니다. 이것은 여기 있는 홀더에 끼워지는 유리판이며, 여기 있는 스프링 하중 나사를 사용하여 조정할 수 있습니다.

기본적으로 이를 앞뒤로 이동시킵니다. 그렇게 하면 조직이나 절편이 평평하게 유지되어 슬라이드에 고정할 수 있습니다. 절편 제작 중에 조정하고 싶을 수 있는 또 다른 부분은 실제 절단이 이루어지는 칼날의 위치입니다.

조절 방법은 간단합니다. 이 레버를 들어 올린 다음 장치 전체를 왼쪽이나 오른쪽으로 밀면 됩니다. 이 기능은 조직이 칼날의 특정 부분에 걸리는 것이 확인되었거나, 칼날의 가격이 다소 비싸므로 절약하고자 할 때에만 사용하십시오. 이렇게 앞뒤로 움직여 깨끗한 영역을 찾아 사용할 수 있습니다.

조절 가능한 또 다른 요소는 절단 각도입니다. 현재 보이지 않는 측면에는 세 가지의 서로 다른 위치가 있습니다. 여기서는 중간 위치를 사용하며, 다른 레버를 들어 올려 이를 조절할 수 있습니다.

그리고, 이 장치는 위아래로 움직일 수 있습니다. 저희는 항상 중간 위치에 둡니다. 그래서 지금은 이 상태로 유지하겠습니다.

여기 뒤쪽에 있는 부분이 크라이오스탯의 헤드입니다. 이 부분은 조직 표본을 동결시킨 상태로 고정하여 절편을 만들 때 지지하는 역할을 합니다. 헤드는 위아래로 움직이며 칼날 방향으로 전진합니다.

기본적으로 조직을 여기 있는 척에 고정하고, 척을 헤드에 넣고 조인 다음, 뒤쪽에 있는 노브를 사용하여 각도를 조절함으로써 더 직선으로 절단될 수 있게 합니다. 이제 조직을 척에 고정하겠습니다. 먼저 OCT 층을 추가해야 하는데, 이것이 즉시 얼어붙으면 평평한 층을 만들기 어렵기 때문에 척을 상온으로 유지해야 합니다.

그리고 여기 있는 이 장치를 사용할 것인데, 이것은 열 추출기라고 불립니다. 실제로 이 장치는 OCT가 얼 때 이를 평평하게 만드는 데 사용됩니다. 먼저 상온의 체크를 가져와 여기 있는 홀더에 넣습니다.

OCT 버블을 조금 취하십시오. 여기서는 어차피 짜내어 제거할 것이므로 양은 중요하지 않습니다. 아주 소량만 추가하십시오. 많이 필요하지 않습니다.

열 추출기를 가져와서 그 자리에 바로 놓으십시오. 몇 초간 기다립니다. 그러면 OCT가 평평하게 잘 펴진 것을 확인할 수 있습니다.

이제 조직을 준비했으므로 실제 OCT를 표시해야 합니다. OCT에 점을 찍어 그 위치를 나타내겠습니다. 이렇게 해서 윗부분에 파란색 점으로 표시했습니다.

이제 몰드에서 조직 블록을 꺼내겠습니다. 몰드 뒷부분을 밀어서 꺼낼 수 있습니다. 뒷면을 살짝 밀어 손으로 받아내겠습니다. 이때 조직이 해동되지 않도록 주의해야 하므로, 즉시 다시 넣어두겠습니다.

이제 제가 파란색 표시를 해둔 조직 블록을 보실 수 있습니다. 이를 통해 이곳이 배아 머리의 윗부분임을 알 수 있습니다. 지금 관상면 절단을 진행할 것이므로, 얼굴 부위를 가로질러 절편을 만들고자 합니다.

이제 OCT 대량 방울을 한 방울 더 추가하겠습니다. 모든 상태가 차갑기 때문에 지금은 빠르게 움직여야 합니다. 조직을 가져와 정중앙에 놓고, 이미 형성된 OCT 층에 조직이 평평하게 밀착되었는지 확인합니다. 이제 그대로 동결시키며, 여기에는 약 1~2분 정도가 소요됩니다.

이제 동결이 완료되었습니다. 척(chuck)에 고정된 조직을 가져와 헤드에 장착하고, 최대한 직선이 되도록 맞춘 다음 단단히 조여줍니다.

시료를 칼날 바로 앞에 배치한 다음, 수 초 정도 시간을 들여 천천히 전진시키겠습니다. 이제 칼날의 평평한 면을 사용하여 조직의 위치를 정밀하게 조정하겠습니다. 칼날의 끝부분을 확인하면서 조직을 위아래로 움직여 가장자리가 정확히 일치하는지 확인하겠습니다.

그렇지 않은 경우에는, 아시다시피 이런 모습일 수 있습니다. 분명히 과장해서 보여드리는 것이지만, 여기서 보시다시피 칼날에 일직선으로 맞지 않은 것을 알 수 있습니다. 따라서 저는 최대한 일직선이 되었다고 느껴질 때까지 계속해서 조정을 수행합니다.

이 정도면 충분한 것 같습니다. 따라서 조직이 칼날에 수직으로 정확히 절단될 수 있도록 모든 각도에서 확인하며, 칼날의 끝부분을 이용해 이를 표시합니다. 위에서 확인하고 측면에서도 확인했으며, 조직 상태가 상당히 좋아 보입니다.

많이 조정할 필요는 없지만, 조정이 필요하다면 헤드 뒷면에 있는 노브를 사용하면 됩니다. 노브를 왼쪽이나 오른쪽으로 돌리면 미세 조정이 가능하다는 것을 알 수 있습니다. 현재 상태는 꽤 좋아 보입니다.

이제 조직을 전진시키고 있습니다. 아직 칼날에 닿지 않았기 때문에 절단되지는 않습니다. 조직이 OCT 내부 깊숙이 매립되어 있기 때문입니다.

따라서 조직에 도달하는 데 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 너무 빠르게 진행하면 OCT와 조직이 걸려 균열이 생길 수 있으므로 주의해야 하며, 반대로 너무 느리게 진행하면 시간이 지나치게 오래 걸릴 수 있습니다. 이 장비에는 더 두꺼운 섹션으로 트리밍(trim)할 수 있는 유용한 기능이 있어, 이를 통해 더 빠르게 진행할 수 있습니다.

이제 실제로 OCT 화합물을 절단하고 있으므로 속도를 조금 늦추겠습니다. 아직 조직에 도달하지는 않았지만, 지금이 섹셔닝이 어떻게 진행될지 평가하는 단계입니다. 많은 변수가 조직 섹셔닝의 성공 여부에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

이 크라이오스탯(cryostat)을 사용할 때 가장 자주 발생하는 문제는 조직이 실제로 너무 차갑다는 점입니다. 온도를 낮추어 보았지만, 여전히 약간 너무 차가운 것으로 보입니다. 이 경우 칼날이 조직이나 OCT를 통과할 때 덜덜 떨리는 현상이 발생하게 됩니다.

그러면 OCT를 가로지르는 작은 가로선들이 생기게 됩니다. 제가 사용하는 방법은 엄지손가락으로 OCT의 가장자리를 가볍게 문지르며 슬라이딩하여 아주 짧은 시간 동안 살짝 데워주는 것입니다. 이렇게 한 뒤에 섹션을 하면 결과가 훨씬 더 좋게 나오고 채터링 현상이 사라지는 것을 확인할 수 있었습니다.

따라서 조직을 다루기 전에 제가 확인하는 사항들은 다음과 같습니다. 칼날이 조직을 통과할 때 OCT에 걸리거나 실제로 균열이 생기는 것을 확인했습니다. 그래서 제가 가장 먼저 하는 일 중 하나는 칼날을 교체하는 것입니다.

이 칼날이 얼마나 오래 장착되어 있었는지, 그리고 이전에 누가 사용했는지 확실하지 않으므로, 그냥 새 칼날로 교체하겠습니다. 보시다시피 칼날이 매우 날카로우므로 주의해야 합니다. 이제 안티롤 플레이트를 조정하겠습니다. 하단에 스프링이 장착된 나사가 있는데, 아래쪽으로 손을 뻗어 이 나사를 밀거나 당겨 조절할 수 있습니다.

이제 조직 내부까지 충분히 전진하여 섹션을 진행했습니다. 불행히도 OCT 블록에 균열이 생겼는데, 이는 자주 발생하는 현상이며 안타깝게도 완전히 제어할 수는 없지만, 이를 해결하기 위해 취할 수 있는 조치들이 있습니다. 만약 균열이 조직까지 관통했다면, 해당 샘플을 폐기하거나 가능한 부분을 최대한 회수해야 합니다.

이 경우에는 균열이 조직 위에 있는 것으로 보입니다. 따라서 크라이오스탯(cryostat) 안에 넣어 차갑게 식힌 면도날을 사용하겠습니다.

OCT 블록 상단에 갈라진 부분이 있는데, 이 부분만 다듬어 내겠습니다. 다시 한번 엄지손가락을 사용하여 OCT 블록의 단면을 가열하겠습니다. 그런 다음 섹션을 절단할 것인데, 보시는 것처럼 이 부분이 갈라져 있습니다.

먼저 조직이 포함된 부분을 떼어내고, 균열이 생긴 나머지 OCT 부분은 그냥 제거했습니다. 이제 냉각된 면도날을 사용하여 균열된 부분을 다듬으려고 합니다. 면도날을 매우 곧게 진입시켜야 하며, 양손을 사용하여 날에 고르게 압력을 가해야 합니다.

그 다음, 블레이드를 OCT 속에 넣고 앞뒤로 흔들겠습니다. 이렇게 앞뒤로 흔들면서 OCT를 천천히 절개합니다. 이를 통해 갈라진 부분을 제거하고자 합니다.

이제 과도한 OCT를 제거하여 절단하겠습니다. 좋습니다. 이제 머리 부분을 약간 뒤로 젖히겠습니다. 날에 걸릴 수 있는 모서리가 생겼는데, 만약 그렇게 되면 OCT와 조직이 떨어져 나가 샘플을 망칠 수 있기 때문입니다.

이제 뒤로 뺐으므로, 조직 내부로 다시 들어가기 위해 조금 더 전진해야 하며, 이를 통해 균열이 수정되었기를 바랍니다. 좋습니다, 이제 다시 조직 안으로 들어가고 있습니다. 네, 수정이 된 것으로 보입니다.

이제 OCT에 균열이 더 이상 없으므로 절편 제작이 훨씬 수월해질 것입니다. 이제 제가 관심을 가지고 있는 조직 부위로 이동하겠습니다. 현재 표면에 막 도달했으며, 이 배아의 뇌 부분까지 진입하고자 합니다.

이들은 제가 관심을 가지고 있는 구조물들을 실제로 볼 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 제가 언급하지 못한 부분이 있는데, 저는 각 섹션을 캡처하기 전에 날을 닦아내기 위해 이 브러시들을 사용합니다. 이 큰 브러시는 단순히 해당 구역을 청소하고 과도한 OCT를 제거하기 위한 것입니다.

또한, 섹션을 이 냉각판 위에 대고 위치를 조정하여 캡처할 때 이러한 더 세밀한 붓을 사용합니다. 다시 말씀드리지만, OCT가 녹아 붓에 달라붙지 않도록 이 붓들은 차갑게 유지합니다. 이제 조직을 캡처하기 위해, 먼저 엄지손가락으로 OCT와 조직을 가열하겠습니다.

이미 라벨을 붙여둔 슬라이드 중 하나를 가져오겠습니다. 슬라이드를 뒤집어서 잡는데, 사람마다 방법이 다를 수 있습니다. 제가 하는 방식은 슬라이드가 아래를 향하게 한 상태에서 오른손으로 오른쪽 상단 모서리를 잡는 것입니다.

그런 다음 왼쪽 엄지손가락을 피벗 포인트로 사용하여 플레이트를 향해 수직으로 내려가 절편을 채취합니다. OCT와 조직이 슬라이드 위에서 실제로 녹으면서 스스로 부착됩니다. 따라서 먼저 엄지손가락으로 조직을 따뜻하게 데운 뒤 천천히 절단하고, 슬라이드를 잡아 오른손으로 오른쪽 모서리를 고정한 다음, 플레이트를 이동시켜 수직으로 내린 후 녹을 때까지 둡니다.

조직에 접힘이나 기포가 없는지, 상태가 양호한지 확인하겠습니다. 뇌 전체를 절편화할 때까지 이 과정을 계속 반복합니다. 이제 해부 현미경을 통해 절편들을 확인하여 상태가 양호한지 확인하겠습니다. 절편 상단에서 전뇌를 볼 수 있으며, 모든 절편의 상태가 매우 좋습니다.

이 동결 절편은 in situ hybridization과 같은 분석에 사용할 수 있습니다. 때로는 기본적인 조직학적 분석인 H&E 염색을 수행하기도 합니다. 또한 면역형광법을 비롯하여 이와 유사한 여러 가지 분석법을 적용할 수 있습니다.

특히 저의 경우에는, 이 절편들을 고정하고 in situ hybridization을 위해 처리했습니다. 따라서 다음 단계에서 이 과정을 수행하도록 하겠습니다.