Name: 의 준비 Drosophila S2 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 Drosophila S2 세포를 광학 현미경 관찰을 위해 준비하는 방법을. 렉틴 코팅을 통한 세포 부착 및 평탄화 기술을 활용하여 유전자 기능 연구와 세포 구조 시각화를 효과적으로 수행할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 암 연구소 P30 CA23074, 미국 암 학회 연구 기관 그랜트 74-001-31, 그리고 대학에 의해 부분적으로 지원되었다. 애리조나 GI 스포어 (NCI / NIH CA9506O)의.

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 생물학 분야의 경우, 이상적인 시스템은 조작하기 쉬운 유지하기 위해 저렴한 것이고, 기술의 다양한 의무. Drosophila S2 세포는 이러한 요구 사항을 만족하고, 그래서 그들은 빠르게 세포의 증가에 대한 선택의 시스템이되었습니다 생물학 실험실. 우리는 현미경에 대한 S2 세포를 준비하는 방법에 대한 간략한 개요를 제시했습니다. S2 세포의 주목할만한 미덕들은 정상적인 분위기와 실내 온도에서 잘 성장한다는 사실이다, 그러므로, 그들은 특별한 유지 보수 요구하지 않고 오랜 시간 동안 현미경에 남아 있습니다. 그들이 일반적으로 다소 반올림 및 일반 culturing 조건에서 느슨하게 자기편에도 불구하고, S2 세포가 광범위하게 이미징을위한 버리고 유도하실 수 있습니다. S2 세포는 그들이 뛰어난 현미경 표본 제작, 표지 용지에 첨부하여 얇게 퍼져 것입니다 concanavalin 사전 코팅되었습니다 유리 바닥 요리에 대한 교양.

<table><tbody><tr><td>S2 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 세포</td><td>DGRC</td><td>stock number 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2 세포</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>무혈청 배지</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>무혈청 배지</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>무혈청 배지</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>완전 배지를 만들기 위해 열불활성화 FBS를 10% (최종 농도) 첨가한다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>열불활성화</td></tr><tr><td>100x 항생제 용액</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>penicillin (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomycin (10000 &amp;#x03BC;g/mL), 및&lt;br/&gt;amphotericin B (25 &amp;#x03BC;g/mL) 포함</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32% 용액</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>무수, ACS 등급</td></tr><tr><td>분자체</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>type 3A</td></tr></tbody></table>

의 준비 drosophila</em라이트 현미경을 위해> s2 세포

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

이상적인 실험 시스템은 기술의 다양한 의무 유지하기 위해 저렴하고 쉽게 될, 그리고 광범위한 문학 게놈 시퀀스 데이터베이스에 의해 지원됩니다. 교양 Drosophila S2 세포, 정신을 20-24시간 오래된 태아 1의 제품은 이러한 모든 속성을 보유하고 있습니다. 따라서, S2 세포는 매우 분자 과정의 구성 요소 또는 관심 메커니즘을 인코딩 유전자의 발견을 포함하여 세포 프로세스의 분석에 적합합니다. 그들의 유틸리티에 대한 대부분의 책임이 S2 세포의 기능은 라이브 또는 고정 형식으로 그들이 유지하고있는 용이성을 두 번 좌초 (DS) RNA - 중재 간섭 (RNAi)들의 아름다운 감성과 형광 현미경 자신 tractability 아르 세포. S2 세포는 저렴한, 상용 - 가능, 완벽한 정의, 혈청 프리 미디어 2의 숫자를 포함하여, 다양한 미디어로 성장하실 수 있습니다. 또한, 그들은 21-24 ° C에서 최적으로 빠르게 성장하고 컨테이너의 다양한 교양 수 있습니다. 포유 동물 세포와는 달리, S2 전지는 규제 분위기를 필요로하지 않지만, 대신에 일반 공기와 잘 심지어 밀폐 flasks 유지하실 수 있습니다. S2 세포에서 RNAi의 용이성을 보완하는 것은 쉽게 위상 또는 고정 또는 라이브 세포의 형광 현미경에 의해 실험적으로 유도된 phenotypes을 분석하는 능력입니다. S2 세포는 단일 monolayer로 문화의 성장하지만, 연락처 억제를 표시하지 않습니다. 대신, 세포는 짙은 문화의 식민지에서 성장하는 경향이있다. 저밀도에서 S2 문화 원형과 느슨하게 연결된 아르 유리 또는 조직 문화 처리 플라스틱에서 성장. 그러나, S2 세포의 세포학은 크게 렉틴, concanavalin A (코나) 3 코팅 표면에 간단히 culturing 그들에 의해 광범위하게 버리고 그들을 유도하여 향상시킬 수 있습니다. S2 세포도 안정 레이블 구조 또는 거주 또는 고정 세포에 대한 관심의 organelles에 찬란 - 태그 마커와 transfected 수 있습니다. 따라서, 세포의 미세한 분석을위한 일반적인 시나리오는 이것입니다 : 우선, S2 전지 (태그 마커를 표현하는 transgenes을 가지고 수) 대상 단백질 (들)를 제거하는 RNAi에 의해 처리됩니다. RNAi 치료 시간은 단백질의 차이 수 있도록 조정할 수 있습니다 대상 단백질은 생존에 중요한 경우 속도론을 넘겨주 및 세포 외상 / 죽음을 최소화하기 위해. 다음 치료 세포가 확산 세포를 유도하고 단단히 유리에 준수하는 코나 사전 코팅 coverslip을 포함하는 음식으로 전송됩니다. 마지막으로, 세포는 현미경 모드의 연구자의 선택과 몇 군데 있습니다. 이러한 세포가 실내 온도와 정상적인 분위기에서 건강을 유지 이후 S2 세포 사는 세포의 확장 시각화를 필요로하는 연구에 특히 좋다.

Drosophila 슈나이더 (S2) 세포가 유전자의 발견과 기능 분석을위한 점점 인기있는 시스템입니다. 우리의 목표는 점점 더 중요한 실험 시스템 S2 세포를 만드는 미세한 기법 중 일부를 설명하는 것입니다.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

이상적인 실험 시스템은 비용이 저렴하고 유지관리가 용이하며, 다양한 기법을 적용할 수 있고, 방대한 문헌의 뒷받침을 받는 시스템일 것입니다...

본 절차의 전반적인 목표는 광학 현미경 관찰을 위한 Drosophila S2 세포의 준비 과정을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 유리 바닥 배양 접시를 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 유리 바닥을 lectin conval로 코팅하는 것입니다.S two 세포의 부착과 평탄화를 촉진하기 위한 과정입니다. 절차의 세 번째 단계는 배양 접시에 배양액과 S two 세포를 첨가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 배양 접시 내의 S two 세포를 고정하고 면역 염색하는 것입니다.최종적으로, 각각 살아있거나 고정된 S two 세포의 형광 현미경 관찰을 통해 fluoro four가 태그되었거나 면역 표지된 표적 단백질의 국소화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 애리조나 대학교 세포생물학 해부학과의 Greg Rogers 연구실 소속 Joey Club입니다. 저는 역시 Rogers 연구실 소속인 John Nye입니다.그리고 저는 Dan Buster입니다. Greg Rogers 연구실 소속입니다. 오늘은 광학 현미경 관찰을 위한 Drosophila S2 세포 준비 과정을 보여드리겠습니다.당사 연구실에서는 주요 조절 단백질의 제거 또는 과발현 이후 중심체 수와 구조의 변화를 관찰함으로써, Drosophila의 중심체 복제 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 유리 바닥 접시를 제작하기 위해 표준 35 밀리미터 페트리 접시를 사용합니다.이 유리 바닥 디시는 세포를 일반적인 배양 조건과 매우 유사한 상태로 유지하며, 현미경용 등급의 유리를 통해 살아있는 세포를 관찰할 수 있게 해줍니다. 유리 바닥 디시를 조립하기 위해, 두꺼운 벽을 가진 스티로폼 박스의 테이프 처리된 표면을 천공 작업대로 사용합니다. 35mm 페트리 디시의 하단부를 천공 작업대 위에 놓고, 디시의 바닥면이 스티로폼 박스에 닿게 한 상태에서 디시의 측면을 단단히 잡고 3/4인치 스페이드 드릴 비트가 장착된 핸드 드릴을 사용하여 디시에 구멍을 뚫습니다.모든 플레이트에 구멍을 뚫은 후, 거친 입자를 가진 원뿔 모양의 그라인딩 드릴 비트를 사용하여 구멍의 바깥쪽 테두리를 매끄럽게 다듬습니다. 이때 비트의 직경은 스페이드 비트와 거의 동일한 것을 사용하십시오. 전동 드릴을 옆으로 눕혀 비트가 카운터 가장자리 밖으로 돌출되게 놓습니다. 10 kilograms의 모래가 담긴 고강도 플라스틱 백과 같이 무거우면서도 유연한 물건을 드릴 위에 올려 고정하십시오.드릴을 계속 작동시키려면 잠금 버튼을 사용하십시오. 접시의 가장자리를 그라인딩 비트에 대고 움직여 새로 뚫린 구멍의 거친 부분을 매끄럽게 다듬으십시오. 구멍의 바깥쪽 테두리를 모두 다듬은 후, 접시 바닥면들을 큰 비커에 넣고 증류수로 여러 번 헹굽니다.이렇게 하면 작은 플라스틱이나 스티로폼 조각들이 제거되며, 이후에 이 조각들은 표면에 뜰 것입니다. 디쉬 바닥을 펼쳐서 건조시키십시오. 디쉬가 마르면 Sard 180 4 접착제를 준비하십시오.수지와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하고 충분히 섞습니다. 각 디쉬의 바깥쪽 표면에 있는 드릴 구멍 주위에 접착제를 작은 원형으로 도포합니다. 그다음, 접착제가 닿도록 구멍 위에 커버 글라스를 덮습니다.커버 글라스는 페트리 접시에 뚫린 구멍보다 최소 약 1mm 더 커야 하며, 접시의 직경보다는 작아야 합니다. 커버 글라스가 접시에 부드럽고 고르게 밀착되어야 합니다. 이제 접시들을 옆으로 치워 둡니다.바닥면이 위로 향하게 하여 건조시킵니다. 이는 상온에서 하루 또는 그 이상 걸릴 수 있으나, 디쉬를 따뜻한 인큐베이터에 넣어 경화 속도를 높일 수 있습니다. 디쉬가 건조되면 lectin conent A 또는 con A로 코팅할 수 있습니다. con A 코팅된 커버슬립 위에 안착된 S two 세포는 광범위하게 퍼지며, 이는 현미경 관찰을 위한 매우 훌륭한 표본이 되므로 con A를 사용합니다.유리 바닥 디쉬를 코팅하려면, conne 용액 10 microliters를 유리의 윗면에 도포합니다. 건조 후, UV 램프를 사용하여 디쉬와 커버를 멸균합니다. 조직 배양 후드 내에서 각 부품의 내측 표면이 UV 전구를 직접 향하도록 배치한 뒤, 멸균 UV 램프를 최소 45분 동안 켭니다.S two 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있습니다. 본 실험에서는 in VITROGEN SF 902 배지를 사용합니다. 현미경 관찰을 위해 RNAi 처리된 S two 세포를 준비하려면, 세포를 부드럽게 재현탁하여 2 mL의 배지가 담긴 conne 코팅 유리 바닥 디쉬로 옮깁니다. conne 코팅된 커버슬립에 접촉한 건강한 세포들은 표면에 단단히 부착되어 퍼지기 시작할 것입니다.이 과정은 약 15분 후에 나타나기 시작하며, 45분에서 1시간 정도면 완료됩니다. S two 세포는 일반적인 실험실 온도 및 대기 조건에서 쉽게 유지되므로, 세포를 현미경으로 관찰할 때 탈수를 방지하기 위한 특별한 조건이나 장비는 필요하지 않으며, 현미경 위의 디쉬에 충분한 배지를 유지해주면 됩니다. S two 세포의 장시간 라이브 이미징이 가능합니다.이 실험의 실행 시간은 일반적인 광퇴색(photobleaching) 및 광독성(phototoxicity) 문제에 의해서만 제한됩니다. S two 세포는 유리 바닥 배양 접시(glass bottom dish) 또는 일반 커버슬립에 고정할 수 있습니다. 본 영상에서는 유리 바닥 배양 접시에서 세포를 고정하고 면역염색하는 과정을 시연하겠습니다.메탄올과 포름알데히드는 S two 세포 고정을 위해 흔히 사용되는 두 가지 고정액입니다. 메탄올을 이용한 세포 고정 방법은 다음과 같습니다. 먼저 뚜껑이 덮인 1L 유리 비커에 무수 메탄올 약 300mL를 넣고, 폭발 방지 기능이 있는 -20°C 냉동고에서 충분히 냉각시킵니다. 메탄올이 차가워지면 냉동고에서 꺼냅니다. 유리 바닥 접시(glass bottom dish)에서 배지를 빠르게 제거한 후, 접시를 메탄올에 신속하게 담급니다.디쉬가 들어 있는 비커를 즉시 냉동고로 다시 옮겨 10~15분 동안 세포를 고정합니다. 10분 후 비커에서 디쉬를 꺼내 남은 메탄올을 따라내고 세포를 재수화합니다. PBST를 추가하면, 이후 세포 고정 단계에서 시연될 표준 염색 절차를 진행할 준비가 완료됩니다.포름알데히드의 경우, 10% 포름알데히드와 완충액을 사용합니다. S two 세포는 세포질 중간 필라멘트가 부족하여 고정 과정 중 세포 형태와 구조를 유지하기 어렵기 때문에, 비교적 고농도의 포름알데히드를 사용합니다. 세포를 10% 포름알데히드에 10분에서 15분 동안 고정하십시오.고정이 완료되면, 포름알데히드를 폐기물 비커에 따라 버리고 고정된 세포를 PBST로 세 번 짧게 세척합니다. 고정된 세포에 블로킹 용액 1mL를 넣고 15분 동안 처리하여 면역 염색 절차를 시작합니다. 본 실험실에서는 평소 PBST에 희석한 5% normal goat serum을 사용합니다.블로킹 용액을 따라내고 1차 항체를 세포 위에 직접 첨가합니다. 항체 용액의 증발을 막기 위해 페트리 뚜껑을 다시 닫고, 상온에서 30분 동안 항체를 세포와 함께 배양합니다. 30분 후, 1차 항체 용액을 제거합니다.전달 피펫을 사용하여 디쉬에 2 mL의 PBST를 넣고 5분 동안 기다린 후 PBST를 교체합니다. 그다음 PBST로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 100 µL의 2차 항체를 세포 위에 직접 첨가합니다.페트리 접시 뚜껑을 다시 덮고 항체를 세포와 함께 30분 동안 배양합니다. 상온에서 진행하십시오. 30분이 지나면 2차 항체를 제거하고 PBST로 5분씩 세 번 세척합니다.마지막으로, 마운팅 매질 몇 방울을 세포 위에 직접 첨가합니다. 페트리 접시 뚜껑을 닫고, 필요한 경우 4 °C의 암소에 보관하십시오. 여기 제시된 이미지는 코니발(conval) 및 코팅된 유리 바닥 접시에 플레이팅한 후의 S two 세포의 대표적인 위상차 이미지이며, 숫자는 플레이팅 후 경과 시간을 분 단위로 나타냅니다.세포의 자가 평탄화(self flattening)는 15분 정도면 나타나기 시작하며, 60분이면 기본적으로 완료됩니다. 코팅된 커버슬립 위에서 세포가 평탄해짐에 따라 위상차 현상으로 인해 어둡게 변하는 것을 확인하십시오. 부착된 세포의 확대 이미지에서 화살표로 표시된 확장 및 평탄화된 가장자리를 명확하게 볼 수 있습니다.S two 세포를 트랜스펙션하여 고정 세포 또는 살아있는 세포 내의 관심 구조를 표시하는 형광 표지 단백질을 발현시킬 수 있습니다. 본 예시에서는 핵 마커인 nucleo foin과 형광 단백질 fluoro four EGFP가 융합된 융합 컨스트럭트를 S two 세포에 일시적으로 트랜스펙션하였습니다. 이 세포들을 conna 코팅된 글라스 바텀 디쉬에 플레이팅한 후, DIC 및 에피 형광 현미경으로 이미징하였습니다.RNAI 처리된 S two 세포 또한 고정하여 면역형광법으로 분석할 수 있습니다. 이 이미지들은 중심 마커인 PLP(녹색)와 미세소관(적색)에 대해 면역 염색된 고정 S two 세포와, 염색체(청색)에 대해 HOOKED 염색이 된 모습을 보여줍니다. 고정 및 면역 염색에 앞서, 세포를 대조군, RNAi 또는 방추사 극 집중을 촉진하는 NCDA KINESIN 유사 단백질을 넉다운시키기 위한 RNAi로 4일 동안 처리하였습니다.NCD RNAi 처리를 통해 방추사 극이 벌어지고 방추사가 무질서하게 배열된 세포가 관찰되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 배양 접시에 구멍을 뚫을 때 매우 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두입니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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