Name: 쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 학습하세요 쥐 중추신경계 질환 치료를 위한 정맥주사, 복강주사, 경구투여 및 CED 뇌내 투여법. 형광 표지 화합물을 활용한 생체 영상으로 투여 확인이 가능합니다.

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1. 체계적 전달 방법 약물의 전신 배달 CNS 높은 약물 농도를 달성하기위한 가장 효율적인 방법은 아니지만, 체계 배달이 편리하고 잘 환자로 받아들였습니다. 정맥 주사, intraperitoneal 주사 및 경구 gavage : 여기, 우리는 세 일상적으로 사용하는 조직 관리 방식에 대한 적절한 절차를 보여줄 것입니다. A. 정맥 주입 (타일 베인 사출) <ol><li> 절차를 시작하기 전에, 각 마우스의 체중이 기록되어야합니다. 모든 잠복기 연구와 마찬가지로, 체중은 잠재적 약물 독성을 평가하기 위해 (일주일에 두 번 이상) 정기적으로 모니터링해야합니다. 볼륨에서 마우스의 체중의 2 개 이상의 %는 한 번에 주입해야합니다. 예를 들어, 더 이상 유체의 0.2mL 이상은 20g 마우스에 주입해서는 안됩니다. 정맥 주입 모든 유체는 적절한 방법으로 소독하여야한다. </li><li> 마우스는 가열 패드 또는 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 가열 램프을 사용 5~10분위한 워밍업해야합니다. 가열 램프를 사용하는 경우 고열을 피하기 위해 항상 마우스를 모니터합니다. </li><li> 마우스는 꼬리 정맥 (동영상 참조)에 대한 액세스를 허용하는 동안 마우스를 멈출 들고 장치로 전송됩니다. 마우스 꼬리 네 개의 보이는 선박이 있습니다 지느러미와 측면 양쪽에있는 혈관은 정맥, 그리고 복부 측면에있는 혈관은 동맥이다. 꼬리 정맥에 액세스하려면 마우스의 꼬리가 가장 말초 지점에서 개최하고, 정맥은 위쪽에 직면하고 있다고 90도 너무 회전합니다. 사출 사이트는 알코올 면봉과 함께 청소하고 28g 인슐린 주사기는 (동영상 참조) 정맥에, beveled 측면을 삽입됩니다. 바늘이 제대로 정맥에 배치하는 경우, 그것은 자유롭고 부담없이 이동해야합니다. 천천히 5-10초여도 압력과 마약을 주입. 물집이 꼬리에 나타나면 이것은 바늘이 혈관에 더 이상 없다는 것을 나타냅니다로, 주입을 중지합니다. </li><li> 출혈이 멈출 때까지 주사 후 주사 사이트에 부드러운 압력을 적용합니다. 이것은 일반적으로 30~60초 걸립니다. 더 이상의 출혈이 없다는 것을 막기 위해 사출 후 50-10분 마우스를 모니터합니다. </li></ol> B. Intraperitoneal 사출 <ol><li> 주입을 시작하기 전에 약물은 28g 바늘에 연결된 주사기에로드해야합니다. 공간 (예, 200μL를 주입하면 주사기 용량 300μL 이상 있는지 확인) 사출하기 전에 플런저를 다시 그리기 위해 주사기 안에 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스 손잡이에 뭔가가있다 있도록 꼬리로 새장에서 마우스를 제거하고 거친 표면에 그것을 놓으십시오. 케이지 뚜껑은 대개 충분합니다. 마우스는 몸을 스트레칭하고 다음 비 지배적인 손을 사용하는 허용 가볍게 당신의 엄지와 검지와 가운데 손가락 (동영상 참조) 사이에 최대한 피부를 꼬집어보고를 돌보는 마우스의 뒷면에있는 피부를 파악. 그래서 마우스의 복부가 위쪽에 직면하고 있다고 위로 마우스를 켭니다. 마우스가 자유롭게 머리를 이동할 수있다면, 사출 동안 물리지 않도록을 줄 수있는만큼, 손잡이를 해제하고 다시 시도하십시오. </li><li> 당신의 지배적인 손으로 주사기를 선택하고 마우스의 왼쪽 하단 사분면 (동영상 참조)에 30도 각도로 바늘을 삽입합니다. 약간 거꾸로 마우스를 개최하는 것은 멀리 주사 사이트에서 장기를 이동하는 데 도움이됩니다. 바늘이 intraperitoneal 공간에 있는지 확인하려면 주사기의 플런저에 다시 가져옵니다. 어떤 액체 또는 혈액이 주사기에 나타나는 경우, 바늘은 intraperitoneal 공간이 아니므로 삭제되어야합니다. 어떤 유체가 주사기에 aspirated 없다면, 1~5초 이상도 압력과 주사기의 내용을 삽입하고 마우스를 놓습니다. </li><li> 마우스가 정상적인 활동 수준을 반환하기 위해 사출 후 5~10분 마우스를 모니터합니다. </li></ol> C. 구두 Gavage <ol><li> 주사를 시작하기 전에 마우스의 무게를 기록합니다. 경구 gavage에 의해 제공 수있는 최대 볼륨은 체중 kg 당 10mL입니다. 예를 들어, 20g 마우스의 최대 볼륨은 200μL 것입니다. 큰 볼륨을 삽입하려고 시도하는 것은 역류가 발생할 수 있습니다, 이것은 불완전 약물 전달의 원인이됩니다. 그것이 위에 명시된 것보다 더 큰 볼륨을 관리하는 데 필요한 경우, 많은 셋처럼 복용 24 시간 이상 실시 수 있습니다. </li><li> 식도를 펑쳐링 방지하기 위해서는 각각의 마우스에 대한 gavage 바늘의 길이를 측정하는 것이 중요합니다. 마우스의 마지막 늑골에 gavage 바늘을 곡선 18g 볼 팁을 보유하고 영구 마커 (동영상 참조)를 사용하여 마우스의 머리의 끝에 길이를 표시합니다. gavage 동안,이 마크는 마우스의 입안에 바늘을 삽입으로 막는 포인트가 될 것입니다. </li><li> intraperitoneal 주사 같은 손으로 손잡이를 사용하여 마우스를 구속. 혀여, 입안에 gavage 바늘을 삽입하고 adva인두를 통해 바늘을 제정신. 중지 마르크 과거 바늘을 삽입하지 마십시오. 바늘은 어떤 압력 (비디오 참조)없이 원활하게 진행해야합니다. 당신이 압력을 발생하면 중지하고 폐 속에 유체를 주입하지 않도록하기 위해 바늘을 철회. </li><li> 장소에 바늘로, 1~5초 통해 플런저를 우울하게하고 그것이 삽입된 것을 동일한 각도로 바늘을 제거합니다. 그 액체가 폐에를 입력했습니다 나타낼 수 있습니다 고심한 흔적이있는 호흡의 흔적에 가까운주의를 기울이고, 50-10분 마우스를 모니터합니다. </li></ol> 2. 로컬 배달 급성 대류 - 향상된 배달 A. 프로브 건설 설치류를위한 역류 방지 CED 정맥은 아직 상업적으로 사용할 수 없습니다. 여기 처음 Krauze 외 (Krauze 2005)에 의해 설명된 방법으로 적응했다 정맥 건설하는 방법을 설명합니다. <ul><li> 100uM 직경 실리카 튜브이를 통해 infusate 흐름, 구조 지원을위한 단단한 금속 바늘과 infusate 로딩을위한 유연한 테플론 튜브 :. 정맥은 세 부분 (그림 1)을 가지고 </li><li> 단단한 금속 바늘을 얻으려면, Surflo IV 카테터 (24g 탐침)에 플라스틱을 녹일와 족집게는 금속 바늘을 제거 사용하는 열린 불꽃을 사용합니다. 카테 테르의 나머지는 폐기 수 있습니다. 단일 에지 면도날을 사용하여 금속 바늘보다 약간 긴 실리카 튜브의 길이 (OD 0.163mm)를, 잘라. 튜브의 끝에 어떤 접착제를 못 돌보는 cyanoacrylate을 기반으로 빠른 속도로 연기 접착제 (예 : Krazy 풀로)의 작은 드롭 역할 실리카 튜빙. 금속 바늘의 실리카 튜브를 삽입하고 5 분 말리면. </li><li> 일단 건조 실리카 튜빙은 단단히 바늘에 부착된해야합니다. 이산화 규소의 끝을이 줄어들 수 있도록해야한다는 바늘과 평면 끝 (비디오 참조)로부터 실리카 튜빙의 protrudes의 3mm의 지적 끝에서 실리카 튜빙의 protrudes의 2mm. </li><li> 길이 테플론 튜브 20cm의 부분을 잘라 버릴거야. 다시 이것은 정맥을 방해할 수 있으므로 실리카 튜브의 끝에 접착제를하지 돌보는, 접착제의 작은 방울의 금속 바늘을 롤. 1cm의 깊이에 테플론 튜브에 바늘을 삽입합니다. 1 분 건조하자. 아교 총 사용하여 금속 바늘과 테플론 튜브 (동영상 참조) 사이의 공동에 뜨거운 접착제 한 방울을 적용합니다. 전체 관절이 사방에 덮여 있는지 확인하고 최소 1 시간 동안 건조하자. Cannulas 미리 주일까지 만들어 실온에서 저장할 수 있습니다. </li></ul> B. 주입 절차 <ul><li> 외과 영역을 준비하려면, 모든 표면과 같은 2 % chlorhexidine 솔루션으로 살균제와 뿌렸해야합니다. 무균 수술 장갑이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다. 표면은 다음 흡수 커튼 덮여있다. 다음과 같은 소모품은 외과 영역에 배치되어야합니다 <ul><li> 마우스 체온을 유지하기 위해 가열 패드 </li><li> 2 % chlorhexidine을 포함한 3 % 과산화수소를 포함하는 하나 하나, 2 작은 배양 접시 </li><li> 무균 거즈 및 면화 면봉 </li><li> 멸균 일회용 scalpels (번호 21) </li><li> 무균 바늘 22g </li><li> 마우스 stereotaxic 프레임 </li><li> 제어 속도 주사기 펌프 </li><li> Autoclaved 마우스 피부 스테플러, 스테이 플스, 그리고 주요 제거 </li></ul></li><li> CED 정맥을 설정하려면, 플라스틱 주사기 어댑터 세트를 사용하여 테플론 튜브에 1mL 주사기를 첨부합니다. 그것이 (비디오 참조) 수술 표면에 직각이되도록 정맥은 stereotaxic 프레임에 부착된해야합니다. 정맥을 소독하기 위해, 70 % 에탄올로 1mL 주사기를 입력하고 정맥을 통해 에탄올을 실행하는 플런저를 우울. 멸균 생리를 사용하여이 과정을 반복하고, 정맥의 관절 주변에 누출이 있는지 확인합니다. 정맥의 외부를 소독하기 위해 부드럽게 70 % 에탄올로 닦아 닦아. </li><li> 무균 식염수에 정맥을 작성하고 작은 기포가 정맥에 그려진되도록 주사기에 다시 가져옵니다. 공기 방울이의 정맥에있는 호수에서 infusate을 분리합니다. 그런 다음, backload하여 infusate (동영상 참조). 간단히 정맥을 실행하여 주사기 펌프 및 주요 펌프에 주사기를 연결합니다. </li><li> 주입 마취 및 멸균 거즈 조각으로 여러 번 (5-10 초 동안) 보라고하여 피부를 준비를 사용하여 진정 마우스는 2 % chlorhexidine 솔루션에 담근. 안과 연고는 절차를 수행하는 동안 충분한 수분을 유지하기 위해 마우스에 적용해야합니다. 멸균 메스를 사용하여 (동영상 참조) 길이 약 1.5cm, 두개골의 중심을 따라 화살 절개를 만듭니다. 두개골 표면은 다음 3 % 과산화수소 용액에 담가 면봉을 사용하여 청소합니다. 마우스의 눈에 과산화수소를 받고 않도록 조심해. 두개골의 봉합 라인이 시점에서 분명해야합니다 그들이 표시되지 않은 경우, 부드럽게 동생과 함께 두개골을 면봉에쉬 커튼 면봉 3 %의 과산화수소 용액에 담가. </li><li> 주입 사이트를 찾을 수 bregma (그림 2) 다음 오른쪽으로 2mm를 측정하고이 구조의 1mm의 후부를 식별합니다. 멸균 22g 바늘을 사용하여 부드럽게 두개골 (비디오 참조)에 대한 바늘을 복잡하게이 시점에서 두개골에 구멍을 만듭니다. 두개골에 대한 아래 바늘을 강요하지 마십시오. </li><li> 이 시점에서 마우스가 stereotaxic 프레임에 배치하고 흡입 마취제를 (비디오 참조) 전송이 시작되어야합니다. 낮은 수준 (1 %)에서 마취를 관리하고, 신중하게 따라 마취 조정, 호흡 속도의 변화에​​ 대한 마우스를 모니터합니다. </li><li> 두개골 구멍을 통해 정맥 후 두개골 표면 아래 낮은 3mm를 놓습니다. 다음과 같은 요금 및 기간이을 사용하여 주입을 시작 : <table border="0"><tbody><tr><td> 0.1 μL / 5 분 분 </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="총 10권 ul" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="총 볼륨 10 UL"></td></tr><tr><td> 0.2 μL / 5 분 분 </td></tr><tr><td> 0.5 μL / 5 분 분 </td></tr><tr><td> 0.8 μL / 7.5 분 분 </td></tr><tr><td> OFF 1 분 </td></tr></tbody></table></li><li> 주입의 끝에서 천천히 정맥 및 면봉 3 % 과산화수소로 두개골을 제거합니다. (동영​​상 참조) 구멍에 멸균 뼈 왁스를 적용합니다. 포셉을 사용하여 가까운 두개골과 주식을 통해 함께 피부를 그립니다. Buprenorphine의 게시가 수술 통증에 대한 관리해야합니다. </li><li> 그것이 의식과 이동성을 차릴 때까지 사후 operatively 마우스를 모니터합니다. 때문에 프로 시저의 길이에, 그것은 모든 활동을 회복하기 위해 마우스를위한 시간까지 걸릴 수 있습니다. 이 시간 장소 동안 가열 패드에서 마우스 케이지는 저체온증을 방지하고, 다른 적극적인 생쥐와 복구 마우스를 집에서하지 않습니다. </li><li> 스킨 스테이플은 수술 후 일주 제거되어야합니다. </li></ul> VIVO 이미징에서 C. 찬란 - 표시 infusate는 CED 관리 다음과 같은 몇 군데있을 수 있으며, 신호 강도의 변화뿐만 아니라 신호 위치를 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 마우스를 주입에서 회복하도록 않도록, 이미지에 주입 후 2~3시간를 기다리는 것이 좋습니다. <ul><li> 이미징 동안 마취 들어, 흡입 마취의 낮은 수준을 사용합니다. 위치 마우스, 이미징 역에서 지느러미 측면 (예, IVIS 루미나, 칼리퍼 생명 과학, 알라 메다, CA). 몇 군데되는 플루어에 적절한 필터 설정을 사용하여 이미지를 획득. CED 들어, 성공적인 주입은 주입 사이트 (그림 3) 근처에있는 두뇌에있는 물질의 대부분을 표시합니다. </li></ul> 3. 대표 결과 치료의 행정 불리한 반응의 부족 성공적으로 분사의 중요한 지표이다. 예를 들어, 꼬리 정맥 주사 다음과 꼬리 모양의 변화 (예, 크기, 색상)가 없어야합니다. 꼬리 정맥 주입 다음 거품이나 물집은 피하 아닌 치료의 정맥, 납품을 나타내는 것입니다. intraperitoneal 주사 들어, 복부의 피부 변색의 충돌은 피하 주사 또는 내부 구조에 손상을 나타낼 수 있습니다. 경구 gavage에서와 마우스가 호흡이나 기침하는 것을 유체가 오히려 위장으로보다 폐에 주입되었다 나타낼 수 있습니다 보람. CED 들어, neurologic 기능은 치료의 성공적인 관리를 평가하기위한 중요합니다. 발작 또는 hemiparesis을 전시됩니다 마우스 부적 절한 주입을 받으셨을 것입니다. 형광 infusate를 사용하는 경우, 생체내 이미징 성공적으로 관리합니다 (그림 3) 평가에 대해 적용할 수 있습니다. infusate가 주사의 사이트 언어 있지 않다면, 주입은 성공적으로 완료되지 않은 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : CED 정맥 및 설정 외과. 대류 강화된 전달의 기본 요소는 수술이 설정 표시됩니다. microinfusion 펌프 (A)는 (B, 상단에있는 확대 그림 참조) 주입관에 첨부되어 있습니다. stereotaxic 프레임 (C)는 프로브를 위치로 사용됩니다. 이 이미지는 난방을 포함하지 않으며 마취 장비는 또한 절차를 수행하는 동안 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 마우스 스컬 봉합해 라인. CED 주입 사이트 (레드 스타)은 화살과 코로나 봉합 (bregma)의 교차로를 식별하고 bregma의 2mm 수평 및 1mm는 사후 측정하여 찾을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 성공 CED의 대표 결과. 리멀리 붉은 형광 염료로 분류 posomes는 CED에 의한 마우스 뇌에 주입 및 생체내 및 전직의 생체내 두 군데 있었다. 성공적인 주입은 생체내 (A)와 예 생체내 (B) 두 주입의 사이트 언어 형광 신호를 보여줍니다. 신호는 contralateral 북반구에 누설하지 않고 주입 뇌를 현지해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : 랫 Brainstem에 성공 CED 대표 이미지. 찬란 - 표시 liposomes은 쥐의 brainstem에 주입했다. 쥐에서 많은 20μL로이 들어갈 수 있습니다. 쥐의 두개골과 생체내 이미징에서 배제 주입 깊이 있지만, 올바른 주입 위치의 증가 두께는 해부하는 뇌의 전 생체내 이미징에서 확인할 수 있습니다.

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</ol>

모든 절차를 여기서 보여주는 UCSF 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

어떤 치료 요원의 효능의 잠복기 평가 에이전트 계정의 약리 특성과 관심의 대상 조직으로해야합니다. 행정 체계적 방법 일반적으로보다 손쉬운 더 나은 환자에 의해 용납되지만, 혈액 뇌 장벽의 선택도는 종종 CNS 질환 치료를위한 치료의 로컬 배달을 요구. CED : 여기, 우리는 두뇌에 직접 전달 방법 중 하나를 증명하고있다. 뇌에 로컬 배달의 다른 형태의 뇌척수, intratumoral 볼러스 주입하고, 심실 사출에 직접 관리를 포함합니다. 이러한 방법의 경우, 치료의 diffusibility는 가난한 확산은 사출 사이트 (쟁 1989, 보보 1994)에서 몇 mm로 적용 범위의 영역을 제한 함께 매우 중요합니다. 반대로, CED는 아직 구체적인 치료 neuroanatomical 구조 타겟팅을 사용하면서, 마약 유통 (보보 1994)의 영역을 높이기 위해 긍정적인 압력을 사용합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 성공적으로 수행 brainstem에뿐만 아니라 설치류에 꼬리가있는 putamen (그림 4)에 CED있다. 설치류 모델에서 CED 수행하는 능력은 CNS 질환의 다양한 유형을 치료하면 치료 효능을 극대화 증가 관심과 공동으로 점점 더 중요 해지고있다. CED는 정화 단백질, 작은 분자 약물 및 바이러스 (길 2003, Degen 2003 Szerlip 2007)을 포함한 에이전트의 다양한, 전달하는 데 사용할 수 있습니다. CED로 치료할 수 질병의 범위는 CNS의 암 (야마시타 2007)뿐만 아니라 파킨슨병 (길 2003)로 neurodegenerative 질병을 포함하고 있습니다. CED 연구, CED 관리 치료의 생체내 이미징에의 ​​필요성을 확대 지속으로 유사하게 증가하고 있습니다. 형광 이미징 가능성이 인간의 두개골을 통해 보이지 않을 여기를 시연하는 동안 MRI 대비 요원의 공동 주입 (디킨슨 2008) 채용 다른 방법 CNS 질환 환자에서 infusates을 모니터링에 대한 적용을 평가에 대한 관심을 받고있다.

<table><tbody><tr><td>2% 클로르헥시딘(Chlorhexidine)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td>Nolvasan으로도 알려짐&amp;#8221;</td></tr><tr><td>20g 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>28g 바늘 (주사기 포함)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-004-270</td><td>인슐린 주사기로도 알려짐</td></tr><tr><td>3% 과산화수소</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td>차광 보관</td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td>사용 전 오토클레이브 멸균</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 기반 접착제</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9592632</td><td>Krazy Glue로도 알려짐&amp;#8221;</td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>거즈</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td>사용 전 오토클레이브 멸균</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>정맥 카테터(I.V. Catheter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-20</td><td></td></tr><tr><td>인퓨전 펌프</td><td>BASi</td><td>MD-1000, MD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 소프트웨어</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>견적 문의</td><td></td></tr><tr><td>안연고</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>Akwa Tears로도 알려짐&amp;#8221;</td></tr><tr><td>플라스틱 주사기 어댑터</td><td>Upchurch Scientific</td><td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td><td>루어 락(Luer Lock) 주사기용</td></tr><tr><td>실리카 튜빙</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000020</td><td></td></tr><tr><td>피부 스테이플러, 스테이플, 제거기</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>정위 고정 장치(Stereotaxic Frame)</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>테플론 튜빙</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>견적 문의</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

중추 신경계 (CNS)의 철저한 테스트 잠복기 치료제는 치료 효능을 평가 관리 및 에이전트 biodistribution의 노선의 고려를 포함합니다. 행정의 두 가지 주요 분류 사이에, 지역 대 체계, 체계 배달 방법은 종종 관리의 용이성으로 인해 선호하고 있습니다. 그러나, 체계 배달은 CNS에 달성되는 suboptimal 약물 농도의 결과 및 에이전트 효능에 관한 잘못된 결론으로​​ 이어질 수 있습니다. 지역 약물 전달 방법은 더 침략하지만, 치료 CNS 마약 수준을 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 정맥 주사, intraperitoneal 주사 및 경구 gavage : 여기, 우리는 체계적 약물 전달의 세 노선에 대한 적절한 방법을 보여줍니다. 대류 향상된 배달 (CED) : 또한, 우리는 두뇌로 로컬 배달하는 방법을 보여줍니다. 찬란 - 분류 화합물의 사용은 적절한 약물 관리의 생체내 이미징 및 검증에 대해 포함되어 있습니다. 방법 murine 모델을 사용하여 제공됩니다,하지만 쉽게 쥐에 사용하기 위해 적용할 수 있습니다.

중추 신경계의 행동 약물의 철저한 잠복기 테스트는 종종 평가 및 관리의 구체적인 노선과 공동으로 마약 biodistribution을 비교를 포함합니다. 여기 세 일반적으로 사용되는 체계 배달 방법 (정맥 intraperitoneal, 그리고 구두)뿐만 아니라 로컬 배달하는 방법 (대류 향상된 전송)은 생쥐에서 증명하고 있습니다.

중추신경계(CNS) 치료제에 대한 철저한 전임상 시험에는 투여 경로와 약물의 생체 내 분포에 대한 고려가 포함됩니다...

본 비디오 기사에서는 중추신경계로 약물을 전달하는 네 가지 방법을 시연합니다. 처음 세 가지 방법은 정맥 주사, 복강 내 주사, 그리고 경구 투여입니다. 이 세 가지 방법은 모두 약물의 전신 투여로 이어집니다.마지막 방법은 마우스의 뇌에 약물을 국소적으로 주입하는 것입니다. 이 방법의 경우, 적절한 주입 여부를 확인하기 위해 생체 내(in vivo) 광학 이미징이 사용됩니다. 이 세 가지 전신 투여 기술은 전임상 환경에서 널리 사용되는 표준 절차입니다.국소 투여 기술은 다소 까다롭지만, 혈뇌장벽(blood brain barrier)을 우회하여 약물을 뇌에 직접 투여할 수 있게 해줍니다. 이러한 방법들은 새로운 종양학 분야에서 신규 치료제의 효능 및 분포와 같은 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이러한 방법들은 뇌종양의 새로운 치료법에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이 방법들은 신경퇴행성 질환 및 정신 질환과 같은 중추신경계의 다른 질병에도 적용될 수 있습니다. 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열등을 사용하여 마우스를 5~10분 동안 가온하며, 가온하는 동안 저체온증이 발생하지 않도록 마우스를 지속적으로 세심히 관찰하십시오. 28 gauge 인슐린 주사기에 약물을 충전하십시오.한 번에 마우스 체중의 1%를 초과하는 부피를 주입해서는 안 됩니다. 5분에서 10분이 지난 후, 마우스를 고정 장치로 옮깁니다. 마우스 꼬리에는 4개의 눈에 보이는 혈관이 있습니다.등쪽 및 가쪽 혈관은 정맥입니다. 배쪽 혈관은 동맥입니다. 가쪽 꼬리 정맥에 접근하려면, 마우스 꼬리의 가장 말단 부분을 잡고 정맥이 위를 향하도록 90도 회전시킵니다. 알코올 솜으로 주사 부위를 소독합니다.다음으로, 준비된 주사기의 바늘 절삭면(bevel)이 위를 향하도록 하여 정맥에 삽입합니다. 바늘이 정맥에 정확하게 위치했다면, 저항 없이 부드럽게 들어갑니다. 5~10초 동안 일정한 압력으로 약물을 천천히 주입합니다.꼬리가 부어오르면 바늘이 더 이상 정맥에 있지 않다는 표시이므로 주입을 중단하십시오. 주입 후에는 출혈이 멈출 때까지 주입 부위를 가볍게 압박하십시오. 이는 보통 30에서 60초 정도 소요됩니다.추가 출혈이 없는지 확인하기 위해 5분에서 10분 동안 마우스를 관찰하십시오. 28게이지 바늘이 장착된 주사기에 약물을 충전하여 본 실험을 준비합니다. 꼬리를 잡아 마우스를 케이지에서 꺼낸 뒤, 마우스가 잡고 버틸 수 있도록 케이지 덮개와 같은 표면 질감이 있는 바닥 위에 올려놓으십시오.마우스가 몸을 쭉 펴게 합니다. 다음으로, 엄지와 검지 및 중지 사이에 가능한 한 많은 피부가 가볍게 집히도록 주의하며 마우스의 등 쪽 피부를 잡습니다. 마우스의 복부가 위를 향하도록 마우스를 뒤집습니다.마우스가 머리를 자유롭게 움직일 수 있다면, 잡고 있던 손을 놓았다가 다시 시도하십시오. 주사 도중 물리는 것을 방지하기 위해, 마우스를 약간 뒤집어 잡아 장기들이 주사 부위에서 멀어지도록 유도합니다. 준비된 주사기 바늘을 마우스의 왼쪽 하단 사분면에 30도 각도로 삽입하여 바늘이 복강 내 공간에 위치하도록 합니다.주사기 플런저를 뒤로 당깁니다. 주사기 내부로 흡입된 액체가 없다면, 1~5초 동안 일정한 압력으로 주사기 내용물을 주입합니다. 마우스를 놓아줍니다.주사 후 5~10분 동안 마우스의 상태를 관찰하여 정상적인 활동 수준으로 회복되는지 확인합니다. 바늘이 마우스의 입안으로 어느 정도까지 삽입될 수 있는지 확인하여 경구 투여를 시작합니다. 18 G 볼 팁 곡선형 존데 바늘을 마지막 갈비뼈 위치에 맞추어 잡습니다.유성 마커를 사용하여 길이를 표시합니다. 마우스의 체중을 측정하여 주입량을 결정합니다. 경구 투여(oral gavage)로 전달할 수 있는 최대 부피는 체중 kg당 10 milliliters입니다.그 다음 바늘에 약물을 충전합니다. 이어서 복강 내 투여 시와 동일한 방법으로 마우스를 고정합니다. 가바지 바늘을 혀 위쪽의 입안으로 삽입하고, 식도를 찌르지 않도록 주의하며 인후를 통해 바늘을 진입시킵니다.바늘을 정지 표시선 너머로 삽입하지 마십시오. 바늘은 압력 없이 부드럽게 진입해야 합니다. 바늘이 제자리에 위치하면 플런저를 천천히 누르십시오.바늘을 삽입했을 때와 동일한 각도로 제거하십시오. 권장량보다 더 많은 양을 주입하려고 하지 마십시오. 이는 역류를 유발하여 약물이 불완전하게 전달될 수 있기 때문입니다.마우스를 다시 케이지에 넣고 5분에서 10분 동안 관찰합니다. 이때 폐로 액체가 들어갔음을 나타낼 수 있는 호흡 곤란 징후가 있는지 세심히 살핍니다. 필요에 따라 이 절차를 반복합니다.설치류용 역류 방지 CED 캐뉼라가 아직 상용화되지 않았으므로, 24시간 동안 최대 3회까지 투여할 수 있습니다. 세 부분으로 구성된 캐뉼라를 제작하십시오. 주입액이 흐르는 직경 100 micron의 실리카 튜브 조각을 준비합니다.구조적 지지를 위한 견고한 금속 바늘과 주입액 로딩을 위한 유연한 Teflon 튜브입니다. 수술 부위를 준비하기 위해, 모든 표면에 2% chlorhexidine 소독제를 분무하십시오. 그 후 표면을 흡수성 드레이프로 덮으십시오.다음 준비물을 수술 구역에 배치하십시오. 3% hydrogen peroxide가 담긴 페트리 접시 하나와 2% Chlorhexidine이 담긴 페트리 접시 하나를 포함하여 충분한 양의 페트리 접시, 멸균 거즈와 면봉을 준비합니다. 멸균 일회용 21번 메스, 오토클레이브, 마우스 피부 스테이플러, 스테이플 및 스테이플 제거기를 준비하십시오.멸균된 20게이지 바늘, 마우스의 체온 유지를 위한 가열 패드, 마우스 정위 고정틀 및 정밀 제어 주입 펌프를 준비합니다. 캐뉼라를 설치하려면 1mL 주사기를 테플론 튜브에 연결하십시오. 플라스틱 주사기 어댑터 세트를 사용하여 캐뉼라가 수술 표면에 수직이 되도록 정위 고정틀에 고정합니다.1 mL 주사기를 사용하여 70% ethanol을 흘려보내 캐뉼라를 소독하십시오. 멸균 식염수를 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 그런 다음 캐뉼라 연결 부위에 누출이 있는지 확인하십시오.시린지를 뒤로 당겨 캐뉼라 안으로 작은 공기 방울이 들어가게 합니다. 이 공기 방울은 infuse eight과 식염수를 분리하는 역할을 합니다. 그다음 infuse eight을 다시 충전합니다.캐뉼라를 잠시 작동시켜 펌프를 프라이밍합니다. 마취된 마우스의 피부를 2% Chlorhexidine에 적신 멸균 거즈로 닦아내고, 시술 중 적절한 안구 습도를 유지하기 위해 안연고를 도포합니다. 멸균 메스를 사용하여 두개골 중앙을 따라 약 1.5 centimeters 길이의 시상 절개를 실시합니다.3% 과산화수소 용액에 적신 면봉을 사용하여 두개골 표면을 깨끗이 닦아냅니다. 이 시점에서 두개골의 봉합선이 분명하게 보여야 합니다. 보이지 않을 경우, 3% 과산화수소 용액에 적신 새 면봉으로 두개골을 부드럽게 닦아냅니다.bgma를 확인한 다음, 오른쪽으로 2 mm, 후방으로 1 mm 지점을 측정하여 주입 부위를 지정합니다. 멸균된 20 gauge 바늘을 사용하여, 바늘을 두개골에 대고 회전시키며 이 지점에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 바늘을 두개골 방향으로 강하게 밀어 넣지 않도록 주의하십시오.이 단계에서 마우스를 정위 고정틀(stereotaxic frame)로 옮기고 흡입 마취제 투여를 시작하십시오. 낮은 농도로 투여하며, 마우스의 호흡수 변화를 주의 깊게 관찰하고 그에 따라 마취제 양을 조절하십시오.다음 단계는 아마도 전체 방법에서 가장 어려운 부분일 것입니다. 캐뉼라를 배치할 때 구멍의 중앙에 맞게 위치시켜야 합니다. 이를 위해 모든 각도에서 캐뉼라 배치 상태를 확인하십시오.다음으로, 캐뉼라를 두개골 구멍 위에 배치한 후 두개골 표면에서 3 mm 아래로 내립니다. 여기에 표시된 속도와 지속 시간을 사용하여 시린지 펌프를 켜고 주입을 시작하십시오. 주입이 끝나면 캐뉼라를 천천히 제거하고 두개골을 3% 과산화수소로 닦아냅니다.포셉을 사용하여 구멍에 멸균 골왁스를 바릅니다. 피부를 모아 스테이플러로 봉합하여 닫습니다. 수술 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀을 피하 투여합니다.저체온증을 방지하기 위해 마우스를 가열 패드가 깔린 케이지에 넣습니다. 회복 중인 마우스를 활동성이 있는 다른 마우스와 함께 사육하지 마십시오. 마우스가 의식과 운동 능력을 회복할 때까지 수술 후 상태를 모니터링하십시오.절차의 길이가 길기 때문에, 생쥐가 완전히 활동을 회복하는 데 최대 한 시간이 걸릴 수 있습니다. 이미징을 수행할 예정이라면, 형광 표지된 infuse.Eight의 이미징을 수행하기 위해 2~3시간 정도 기다리는 것이 가장 좋습니다. CED 투여 후, 마취된 생쥐를 이미징 스테이션에 배측이 위로 오도록 배치하고, 이미징하려는 형광에 맞는 적절한 필터 설정을 사용하십시오.CED를 위한 영상을 획득합니다. 성공적인 주입 시 대부분의 물질이 주입 부위 근처의 두개골 내에 있는 것으로 나타나야 합니다. 치료제 투여 후 이상 반응이 없는 것은 성공적인 주입을 나타내는 중요한 지표입니다.꼬리 주입 시 부적절한 주입의 지표는 다음과 같으며, 꼬리의 크기나 색상 변화, 꼬리 내의 기포 또는 수포는 정맥 내 투여가 아닌 피하 투여가 되었음을 나타냅니다. 복강 내 주입의 경우, 피부의 돌출이나 복부의 변색은 피하 주입 또는 내부 구조의 손상을 나타낼 수 있습니다.경구 투여 시, 쥐가 호흡 곤란을 겪거나 기침을 한다면 액체가 위가 아닌 폐로 주입되었음을 나타낼 수 있습니다. CED의 경우, 치료제의 성공적인 투여 여부를 평가하기 위해 신경학적 기능이 중요합니다. 발작이나 편마비를 보이는 쥐는 주입이 부적절하게 이루어졌을 가능성이 있습니다.여기서는 왼쪽의 성공적인 CED 주입과 오른쪽의 실패한 주입이 나타난 마우스를 대상으로 생체 내(in vivo) 이미징을 수행하였습니다. 성공적인 주입의 경우 이미징 신호가 뇌에 국한되어 있는 반면, 실패한 주입의 경우에는 신호가 신경축을 따라 퍼져 나갔음을 알 수 있습니다.보신 바와 같이, 이 절차에서 가장 까다로운 부분은 적절한 투여 경로를 선택하는 것입니다. 중추신경계에 약물을 전달할 때는 최적의 투여 부하를 선택하기 위해 약물의 약리학적 특성을 고려하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.이 발표 내용이 유용했기를 바라며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

페트리 접시의 인공 뇌척수액에 담근 채취한 쥐 뇌로 시작합니다.자기 밀리로봇을 뇌 피질에 증착합니다.MANiAC라고 불리는 밀리로봇은 생체 적합성 하이드로겔 알긴산염으로 구성된 마이크로캡슐 내에 내장되고 모델 약물로 염료가 로드된 자기 정렬 니켈 나노로드로 구성됩니다.페트리 접시 아래에 외부 자기장 발생기를 배치하여 균일한 회전 자기장을 생성합니다.니켈 나노로드는 자기장과 정렬되고 회전하여 MANiAC를 피질 표면 위로 추진합니다.MANiAC가 피질 표면을 가로지르도록 하고 제어된 약물 방출을 위해 표적 부위에서 일시 중지하도록 합니다.약물은 알지네이트 캡슐을 통해 뇌의 세포외 기질로 확산되어 뉴런과 신경교세포에 도달합니다.세포는 수용체 매개 엔도사이토시스를 통해 약물 분자를 흡수합니다.실행 및 일시 중지 동작은 국소적인 약물 침착을 보장하면서 표적 이탈 전달을 최소화하고 이전에 처리된 부위에서 재배치를 허용합니다.

쥐 중추신경계의 지역특이적 약물 전달을 위한 자기 밀리로봇

출처: Poland, R. et al. 동기 부여된 행동의 분자 기질을 연구하기 위한 설치류 뇌 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오에서는 주사기와 마이크로인젝터 튜브로 구성된 물로 채워진 미세 주입 설정이 정확한 약물 전달을 위해 사용됩니다. 사전 이식된 가이드 캐뉼라가 있는 쥐는 표적 뇌 미세 주사를 받아 조직 손상을 최소화하면서 깨어 있는 동물에게 치료제를 정확하게 투여할 수 있습니다.

깨어 있는 설치류 뇌에 치료제의 미세 주입 기반 전달

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

우리는 카테터를 이식하거나 마우스의 오른쪽 측면 뇌실에 알약 주입을 수행하여 중추 신경계에 약물을 대상으로하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 특히 초점을 맞 춥니 다. 이 기술은 다른 약물과 쥐에 쉽게 적응할 수있다.

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

본 프로토콜은 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 직접 효과적으로 전달하는 마우스 미세 수술 주입 기술을 설명합니다.

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥

여기서, 우리는 중추 신경계에서 효과적인 유전자 침묵이 가능하게 하는 뇌 표적화 펩티드-siRNA 제제의 비강 내 투여를 위한 마우스의 적절한 배치를 가능하게 하는 마우스 포지셔닝 장치를 이용한 프로토콜을 제시한다.

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

여기서, 우리는 척추의 요추 내 공간에 카테터를 이식하여 쥐 중추 신경계에 약물을 전달하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 초점을 맞추고, 이 방법은 뿐만 아니라 다른 치료 양식의 전달에 적합 하지만.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

요추 척추내 주사는 중추 신경계에 유전자 요법을 전달하기 위한 번역적으로 관련된 투여 경로를 나타냅니다. 신생아, 청소년 및 성인 마우스와 쥐의 요추 척추 내 주사에 대한 이 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 연구자들이 전임상 유전자 치료 연구에 이 기술을 채택하도록 안내하는 것을 목표로 합니다.

마우스와 쥐에서 중추 신경계 표적화를 위한 유전자 치료 벡터의 요추 내 주입

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

학습하세요 쥐 중추신경계 질환 치료를 위한 정맥주사, 복강주사, 경구투여 및 CED 뇌내 투여법. 형광 표지 화합물을 활용한 생체 영상으로 투여 확인이 가능합니다.

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

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