Name: 라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 배우세요 형광 단백질 mOrange2와 Dronpa를 이용한 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기법으로 살아있는 세포에서 4가지 세포 집단을 선택적으로 표지하는 방법입니다. 이 기법은 실시간 세포 동역학 연구에 유용합니다.

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우리는 형광 단백질을 인코딩 플라스미드 DNA를 제공하는 마이크 W. 데이비슨 (플로리다 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 건강 부여 GM72048 (전자 파동 탐색)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 형광 단백질 비말 샘플 준비 형광 단백질 비말 샘플은 물에 단계에 거주하는 형광 단백질과 1-octanol/water의 에멀젼으로 구성되어 있습니다. 이 유제는 현미경의 응용 프로그램에 대한 현미경 슬라이드와 22mm 광장 커버 유리 사이에 끼워 넣으면됩니다. <ol><li> 형광 단백질 비말 샘플을하기 전에 현미경 슬라이드와 커버 안경은 소수성 요원과 함께 세척 및 코팅해야합니다. </li><li> 아세톤 5 분 세탁하여 유리를 청소하고 공기에 의해 건조에 둡니다. (선택, 유리 청소 후 최적의 코팅 결과를 얻기 위해 플라즈마 클리너에서 30 초 동안 처리 수 있습니다.) </li><li> 이 솔루션에서 2 분 동안 배양 아세톤 및 코팅 유리의 2 % methyltrimethoxysilane 솔루션을 준비합니다. 코팅 후 용액에서 유리를 제거하고 공기에 의해 건조에 둡니다. 그런 다음 스프레이 용기에서 70 % 에탄올로 씻어 다시 건조에 둡니다. (선택,이 시점에서 유리는 ° C가 covalently 유리에 코팅을 연결하는 80에서 1 시간 동안 구운 수 있습니다.) 코팅 유리는 적어도 한 달 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 형광 단백질은 E.에서 그의 6 태그 단백질로 정화 아르 대장균 1. 정화 단백질의 흡광도 스펙트럼을 측정하고 인트 버퍼 (150 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL 산도 8, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 ~ 0.1의 광학 밀도 주식 희석을 준비, 0.1 % 소 혈청 알부민을 포함 (BSA) . 또한 15 ML 원뿔 관 1 - octanol과 인트 버퍼의 1:1 혼합물 10 ML을 준비하고 적극적으로 섞는다. 혼합 휴가 후 상 분리가 완료될 때까지. 상단 단계 1 - octanol입니다. (주의 : 1 - octanol이 강한 냄새를 가지고 있기 때문에 그것은 1 - octanol과 접촉 제공 모든 폐쇄 폐기물​​ 컨테이너를 사용하는 것이 중요합니다.) </li><li> 유제 피펫 45 μl 1 - octanol과 microfuge 튜브 5 μl 형광 단백질을 만들 수 있습니다. 유제의 형성을 시작하고 다음 sonication 욕조에서 30 초 동안 튜브를 sonicate하여 손가락으로 튜브를 몇 번 누릅니다. 에서는 한편 코팅 현미경 슬라이드를 유리 준비 커버. sonication 후 유제 완전히 뿌연해야합니다. 즉시 코팅 현미경 슬라이드에 튜브의 중간에서 sonication 피펫 4 μl 유제 후 코팅 커버 유리 커버. </li><li> 절차가 완료되면 제대로 유제는 현미경 슬라이드 및 개체 유리 사이에 균등하게 분산합니다. 분 이내에 샘플 직경 변화와 함께 ~ 10 μm의 두께의 형광 방울을 구성, 안정되어야합니다. 가장 큰 방울은 샘플의 중심 가까이에 있으며 작은가 가장자리쪽으로 더 있습니다. </li></ol> 2. photoconversion 실험 설정 다음 절차는 형광 단백질 photoconversion 실험을 설정하는 일반적인 전략이다. 이 절차는 라이브 세포뿐만 아니라 단백질 투석을 위해 적용할 수 있습니다. <ol><li> 다음 매개 변수는 photoconversion 실험을 설정하는 일반적인 출발점을 제공합니다 : 40x 1.3NA 기름 침지 목표 이미지 크기 = 512 X 512 픽셀 스캔 확대 = 4 픽셀 시간 = 6 μsec 살기. Z - 해상도 (핀홀 크기) = 3 μm의 </li><li> 이 초기와 photoconverted 형광에 대한 검색 채널뿐만 아니라 "photoconversion 채널"을 구성합니다. 이 예제에서 우리는 오렌지로 붉은 photoconvertible 형광 단백질이다 mOrange2 단백질을 정화 사용합니다. 오렌지 수종은 561 나노미터 여기와 형광이 570 nm의와 630 nm의 사이에 수집된를 사용하여 감지됩니다. photoconverted 적색 종은 633 나노미터 여기와 형광이 640 nm의와 700 nm의 사이에 수집된를 사용하여 감지됩니다. "photoconversion 채널"은 488 나노미터 여기를 선택하고 490 nm의와 540 nm의 형광 사이에 수집하십시오. (참고 :. 이미징 photoconversion 채널 엄격하게 필요하지 않습니다) </li><li> 이미징 레이저 전원과 최적의 이미지 품질을위한 검출기 이득을 조정하기 위해 지속적인 검사와 함께 초기 형광을위한 채널을 사용합니다. </li><li> photoconversion 채널을 활성화하고 낮은 레이저 파워를 선택합니다. 이미지에게 시간 저속 시리즈를 시작하고 초기 형광 표백 중요한이 관찰 때까지 점차 photoconversion 레이저를 높일 수 있습니다. 초기 형광 약 75% 표백 때까지 스캔을 계속합니다. </li><li> photoconversion 채널을 비활성화하고 photoconverted 형광에 대한 검색 채널을 활성화합니다. 높은 검출기 이득과 낮은 레이저 파워 이미징을 시작하고 photoconverted 형광이 발견 될 때까지 점차적으로 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다. 일단 당신이 레이저 전원과 최적의 이미지 품질을위한 검출기 이득을 조정할 수 있습니다 photoconverted 형광을 감지. </li><li> 마지막으로 레이저 전원 사용photoconversion뿐만 아니라에 대한 photoconversion의 기간은 최적화해야합니다. photoconversion 레이저 전원을 늘리면, photoconversion의 속도를 가속 것입니다 그러나 너무 많은 레이저의 파워는 단백질 photobleach 것입니다. </li><li> 최적의 photoconversion 레이저 파워와 기간이 결정되고 나면,이 매개 변수는 표준 photobleaching 또는 FRAP 모듈과 "photoconversion 채널"더 이상 필요하지 않습니다를 구성하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. mOrange2 및 Dronpa와 함께 듀얼 - 프로브 광 하이라이트 때문에 붉은 이동 스펙트럼 특성, mOrange2 4 각 셀 (organelle) 인구의 선택적 하이라이트 수 있도록 듀얼 프로브 광학 하이라이트를 위해 녹색 형광 단백질 photoswitchable Dronpa와 함께 사용할 수 있습니다. <ol><li> 전지는 유리 바닥 MatTek 요리 재배 및 사전 표준 Lipofectamine2000 transfection 1을 사용 영상 24 시간 transfected 있습니다. </li><li> 로 제 2의 설명에 mOrange2 photoconversion에 대한 현미경을 설정합니다. </li><li> Dronpa의 photoswitching에 대한 현미경을 구성합니다. Dronpa 형광은 mOrange2 "photoconversion 채널"(단계 2.2 참조)를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. (참고 : 이미지 Dronpa에 사용되는 레이저 전원을 최소화, 너무 많은 레이저 전원이 Dronpa의 불활 성화를 일으킬 수 있기 때문에.) Dronpa의 photoactivati​​on에 대한 채널을 추가합니다. 우리는 photoactivati​​on 두 - 광자 여기 800 나노미터를 사용하지만, 또한 이것은 405 나노미터 여기를 사용하여 얻을 수 있습니다. 레이저 이미징에 필요한 전력, photoactivati​​on 및 Dronpa 형광 photoinactivati​​on를 결정합니다. </li><li> 주의 : mOrange2의 Photoconversion 및 Dronpa의 불활 성화 모두 488 나노미터 여기에 발생합니다. 때문에 mOrange2 photoconversion에 필요한 높은 레이저 전원 이것은 또한 Dronpa 형광을 inactivate 것입니다. 한편, Dronpa의 불활 성화는 훨씬 낮은 레이저 파워에서 이미 발생하고 상당한 mOrange2 photoconversion없이 수행할 수 있습니다. </li><li> mOrange2의 photoconversion 및 Dronpa의 photoswitching에 대한 매개 변수가 설정되면, 듀얼 프로브 광학 하이라이트는 다음 단계를 통해 이루어진다. 첫째, 낮은 전력 488 나노미터 여기로보기의 전체 분야에서 Dronpa 형광을 inactivate. 둘째, 관심과 높은 전력 488 나노미터 여기로 photoconvert의 mOrange2의 영역을 선택합니다. 마지막으로, Dronpa 형광을 활성화하기 위해 관심 영역을 선택합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 비말 샘플 준비.) 제대로 준비 비말 샘플. B) 샘플 코팅 현미경 슬라이드와 커버 유리없이 준비했습니다. C) 샘플 0.1 % BSA를 추가하지 않고 준비. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. mOrange2 단백질을 포함하는 mOrange2 photoconversion에 photoconversion 레이저 파워와 기간의 효력. 싱글 방울이 지속적으로 488 NM 레이저 파워의 다른 양의 사용 photoconverted되었습니다. photoconversion에 사용된 상대 레이저의 파워는 10 % (고체), 25 % (점선), 그리고 100 % (점선)되었습니다. A) 오렌지 형광 종. B) Photoconverted 적색 형광 종. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. mOrange2 및 Dronpa와 함께 듀얼 - 프로브 광학 강조. mitochondria에있는 핵 및 녹색 형광의 오렌지 형광을 보여주는 photoconversion 전에 mOrange2 - 히스톤 H2B 및 Dronpa - 미토을 표현) 세포. B) Dronpa 형광은 mOrange2의 최소한 photoconversion가 발생, 낮은 전력 488 나노미터 여기로 잠수를 탔다. C) mOrange2은 높은 전력 488 나노미터 여기로 적색으로 photoconverted되었습니다. D) Dronpa 형광 다시 800 nm의 2 광자 여기을 사용하여 전환되었습니다. 패널 차등 간섭 대비 이미지와 함께 형광 이미지를 오버레이합니다.

<ol><li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

정화 형광 단백질 비말 샘플 속도론 및 photoconversion의 속도론을 photobleaching 공부 예를 들어, 형광 단백질의 특성에 대한 photophysical 매우 편리한 샘플 형식입니다. 매우 작은 비말 볼륨 (~ 20 picoliter) photobleaching과 쿠베트 기반 시스템에서 수행하기 어려울 수 있습니다 photoconversion 실험, 용이하게합니다. 또한, 같은 비말 샘플이 이상적으로 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 현미경을 설정하는 데 적합합니다 여기에 표시됩니다. 소수성 코팅 및 BSA의 존재는 단일 방울을 얻기 위해 중요합니다. 코팅하지 않고 방울은 유리 표면 중 하나에 대한 숙청 되야하는 경향과 BSA의 부재에있는 형광 단백질은 형광의 후광 (그림 1)를 작성, 1-octanol/water 인터페이스에 축적하는 경향이있다. 형광 단백질 photoconversion들은 종종 하나도 photoconverted 종...

<table><tbody><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR international</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 커버 글라스</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>1-octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4500</td><td></td></tr><tr><td>methyltrimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6420</td><td></td></tr><tr><td>MatTek 디쉬</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 photoconversion

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible 형광 단백질 (PC - 프레임)는 형광의 색깔이 특정 파장의 빛에 노출에 의해 변경될 수있다는 것을 의미한다 &quot;광학 형광펜&quot;기능이있는 형광 단백질의 클래스입니다. 광학 강조는 비침 투 형광 분자의 subpopulation의 마킹 수 있으며, 따라서 하나의 셀 또는 organelles를 추적하기위한 이상적입니다. 효율적인 photoconversion에 대한 중요 매개 변수는 강도와 photoconversion의 빛의 노출 시간입니다. 강도가 너무 낮으면 photoconversion 전혀 발생 느리거나되지 않습니다. 반면에, 너무 강렬하거나 너무 오래 노출이 단백질을 photobleach시키고 photoconversion의 효율성을 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜은 방법 PC - FP의 photoconversion 애플 리케이션을위한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 정제된 단백질 비말 샘플 준비를위한 절차를 설명합니다. 이 예제 형식은 현미경으로 형광 단백질의 photophysical 동작을 공부 매우 편리합니다. 둘째, 우리는 photoconversion에 대한 현미경을 구성하는 방법을 보여 단백질 비말 샘플을 사용합니다. 그리고 마지막으로, 우리는 mOrange2과 Dronpa와 함께 듀얼 프로브 광 하이라이트를 포함하여 살고 세포에 광학 하이라이트를 수행하는 방법을 보여줍니다.

이 프로토콜은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 형광 단백질 photoconversion을 수행하는 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 우리는 puried 단백질 샘플 photoconversion뿐만 아니라 mOrange2과 Dronpa 살 세포의 듀얼 프로브 광학 하이라이트를위한 절차를 설명합니다.

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

광전환 형광 단백질(pc-FPs)은 "광학 하이라이터(optical highlighter)" 기능을 가진 형광 단백질의 일종으로, 이는 ...의 색상을

다음 실험의 전체적인 목적은 형광 단백질 M orange two andron을 이용한 이중 프로브 광학 하이라이팅을 통해 4가지의 개별 세포군 또는 세포 내 구획을 선택적으로 표지하는 것입니다. 이는 먼저 저강도의 488 nanometer 여기광으로 세포를 조사하여 모든 green drawn per 형광을 꺼짐 상태로 전환함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포를 고강도의 488 nanometer 여기광에 노출시키면 m orange 형광이 적색으로 광전환됩니다.다음으로, 이중 형광을 활성화하기 위해 세포를 800 nanometer 이광자 여기(two photon excitation)에 노출시킵니다. 다시 한번, M Orange two와 drawn ppa를 이용한 이중 프로브 광학 하이라이팅을 통해 세포를 네 가지 뚜렷한 조합으로 라벨링할 수 있다는 결과가 도출되었습니다. 세포 소기관 분별법(subcellular fractionation)과 같은 기존 실험과 비교했을 때 이 절차의 주요 장점은 살아있는 세포에서 수행된다는 점입니다.이 절차는 왜 인슐린 소낭의 아주 적은 부분만 분비되는지와 같이 베타 세포 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 베타 세포 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 예를 들어, 생체 내(in vivo) 암세포 추적 등이 있습니다. 형광 단백질 액적 샘플은 수상에 형광 단백질이 존재하는 O/W(oil-in-water) 에멀젼으로 구성됩니다.현미경 관찰을 위해 이 에멀젼을 현미경 슬라이드와 22 millimeter 정사각형 커버 글라스 사이에 샌드위치 구조로 배치합니다. 이 절차를 시작하기 전, 현미경 슬라이드와 커버 글라스를 세척하고 소수성 제제로 코팅해야 합니다. 유리 기구를 아세톤으로 5분 동안 세척하여 깨끗하게 닦아냅니다.세척 후, 유리 기구를 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로, 아세톤에 2% methyl trimethoxy silane 용액을 준비하고 유리 기구를 해당 용액에 2분 동안 코팅합니다. 코팅 후, 유리 기구를 용액에서 꺼내어 건조시킵니다.그 다음 분무병에 담긴 70% ethanol로 유리 기구를 헹굽니다. 헹군 후, 유리 기구를 다시 공기 중에서 건조시키고 남아 있는 액체를 제거합니다. 가압 공기를 사용하면 코팅된 유리 기구를 최소 한 달 동안 보관할 수 있습니다.초자 기구를 준비한 후, 이전에 E. coli에서 His-태그 단백질로 정제된 형광 단백질을 준비합니다. 정제된 단백질의 흡수 스펙트럼을 측정합니다. 0.1% bovine serum albumin이 포함된 pH 8의 Tris 완충 식염수(tris buffered saline solution)를 사용하여 광학 밀도가 약 0.1이 되도록 스톡 희석액을 준비합니다.또한, 15 mL 원추형 튜브에 1-octanol과 Tris 완충 식염수를 1:1 비율로 섞어 10 mL를 준비하고 격렬하게 혼합합니다. 혼합 후 층 분리가 완료될 때까지 그대로 둡니다. 상층이 octanol 층이 되므로, 에멀젼을 만들기 위해 1-octanol 45 µL와 형광 단백질 5 µL를 에피오런 튜브(Eppendorf tube)에 분주합니다.튜브를 몇 번 두드려 에멀젼 형성을 시작한 후, 초음파 세척기에서 30초 동안 튜브를 초음파 처리합니다. 그동안 초음파 처리 후 사용할 코팅된 현미경 슬라이드와 커버 글라스를 준비합니다. 에멀젼은 완전히 불투명한 상태여야 합니다.튜브 중앙에서 에멀션을 4 µL 즉시 피펫팅하여 코팅된 현미경 슬라이드 위에 올리고, 코팅된 커버 글라스로 덮습니다. 에멀션은 현미경 슬라이드와 커버 글라스 사이에 고르게 퍼져야 합니다. 수 분 이내에 샘플이 안정화됩니다.다음 절차는 공초점 레이저 주사 현미경에서 형광 단백질 광전환 실험을 설정하기 위한 일반적인 전략입니다. 이 절차는 정제된 단백질뿐만 아니라 살아있는 세포에도 적용할 수 있습니다. 본 실험에서는 정제된 m orange two 단백질이 포함된 액적 시료를 광전환 실험의 일반적인 시작점으로 사용합니다.공초점 레이저 주사 현미경을 다음과 같이 설정합니다. 40 x 1.3 수치 구경의 오일 침수 렌즈와 512 by 512 픽셀의 이미지 크기를 사용하십시오. 픽셀 체류 시간은 6 µs로 설정하고, 줌은 4배로 지정하며, 핀홀 크기를 조정하여 Z 해상도를 3 µm로 맞춥니다.초기 및 광전환 형광을 위한 두 개의 검출 채널과 광전환 채널을 설정하십시오. 561 nanometer 여기광을 사용하여 오렌지색 종을 관찰하고 570에서 630 nanometer 사이의 형광을 수집하십시오. 633 nanometer 여기광을 사용하여 광전환된 적색 종을 검출하고 640에서 700 nanometer 사이의 형광을 수집하십시오.광전환 채널의 경우, 488 nanometer 레이저 라인을 선택하고 490에서 540 nanometer 사이의 형광을 수집하여 이미징합니다. 광전환 채널이 반드시 필요한 것은 아니나 유용하게 사용될 수 있습니다. 실험을 시작하려면, 검출 채널을 사용하여 초기 형광을 연속 스캐닝으로 이미징함으로써 최적의 이미지 품질을 위해 레이저 출력과 검출기 게인을 조정하십시오.그다음 광전환(photo conversion) 채널을 활성화하고 낮은 레이저 출력을 선택하십시오. 타임랩스 시리즈 촬영을 시작하고, 초기 형광의 유의미한 퇴색(bleaching)이 관찰될 때까지 광전환 레이저 강도를 점진적으로 높이십시오. 초기 형광의 약 75%가 퇴색될 때까지 스캐닝을 계속하십시오.다음으로, 광전환 채널을 비활성화하고 광전환된 형광을 위한 검출 채널을 활성화합니다. 낮은 레이저 출력에서 검출기 게인을 높게 설정하여 이미징을 시작합니다. 그런 다음 광전환 형광이 검출될 때까지 레이저 출력을 점진적으로 높입니다.검출이 완료되면 레이저 출력과 검출 또는 게인을 조정하여 최적의 이미지 품질을 확보하십시오. 마지막으로, 광전환에 사용되는 레이저 출력과 지속 시간을 최적화하십시오. 레이저 출력을 높이면 광전환 속도가 빨라집니다.하지만 레이저 출력이 너무 높으면 단백질의 광퇴색(photobleaching)이 일어납니다. 최적의 광전환 효율, 레이저 출력 및 지속 시간이 결정되면, 이러한 매개변수를 사용하여 표준 광퇴색 모듈 또는 광퇴색 후 형광 회복(FRAP) 모듈을 구성할 수 있습니다. 그렇게 되면 M orange two의 적색 이동(Redshift) 스펙트럼 특성 덕분에 더 이상 광전환 채널이 필요하지 않게 됩니다.이는 이중 프로브 광학적 강조(dual probe optical highlighting)를 위해 녹색 광전환 형광 단백질인 PU와 결합하여 사용할 수 있습니다. 이중 프로브 광학적 강조를 시작하려면, 유리 바닥 매트-텍(glass bottom mat tech) 디쉬에서 HeLa 세포를 배양하고, 표준 Lipofectamine 2000 형질전환법을 사용하여 이미징 24시간 전에 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 세포에 형질전환하십시오.생존 세포를 공초점 레이저 주사 현미경에 올리고, 앞서 설명한 대로 M orange two 광전환을 위해 현미경을 설정합니다. 그 다음, DPA 광스위칭을 위해 현미경을 구성합니다. DPA는 488 nanometer 빛으로 여기되며, 그 형광은 M orange two 광전환 채널을 사용하여 이미징할 수 있습니다.MPA 이미징 시에는 과도한 레이저 출력이 mpa의 불활성화를 유발할 수 있으므로 레이저 출력을 최소화해야 합니다. 800 nm 이광자 여기를 이용한 MPA 광활성화를 위한 채널을 추가하십시오. 이어서 광활성화 및 광불활성화 OFA 형광 이미징에 필요한 레이저 출력을 결정하십시오.이 절차에서 가장 어려운 점 중 하나는 M orange의 광전환(photo converting) 없이 RPA를 불활성화하는 것입니다. 이는 두 사건이 동일한 파장에서 일어나기 때문입니다. 이를 방지하기 위해서는 광전환 과정을 세심하게 최적화하는 것이 매우 중요합니다.레이저 출력 및 지속 시간: M orange two의 광전환과 PU의 불활성화가 모두 488 nm 광 여기 시 발생하므로 주의하십시오. M orange two의 유의미한 광전환 없이 PU를 불활성화해야 합니다. M orange two 광전환 및 DPA 광스위칭을 위한 파라미터가 설정되면 더 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.이중 프로브 광학 하이라이팅을 구현할 수 있습니다. 먼저 저출력 488 nanometer 여기광으로 전체 시야의 DPA 형광을 비활성화합니다. 그 다음 관심 영역을 선택하고 고출력 488 nanometer 여기광으로 m orange two를 전환합니다.마지막으로, 관심 영역을 선택하고 800 nm 이광자 여기를 사용하여 DPA 형광을 활성화합니다. 형광 단백질 액적 샘플은 공초점 현미경 광전환 응용 프로그램을 설정하는 데 매우 적합합니다. 액적 샘플이 올바르게 준비되면, 액적들이 매우 균질하게 나타납니다.하지만 커버 글라스를 사용하여 현미경 슬라이드를 코팅하지 않고 시료를 준비하면, 준비된 시료 내의 액적들이 유리 표면 중 하나에 눌리는 경향이 있습니다. 0.1%BSA가 없으면 형광 단백질이 하나의 수성 계면에 축적되는 경향이 있습니다. 형광 광전환 헤일로를 생성하는 것은 레이저 출력과 노출 시간에 결정적으로 의존합니다.레이저 출력이 너무 높거나 노출 시간이 너무 길면 광퇴색(photobleaching)이 발생하여 광전환된 적색 형광이 감소합니다. M orange two와 PHO의 뚜렷한 스펙트럼 특성 덕분에 광전환 전에 두 프로브를 광학적으로 구분하여 강조할 수 있습니다. M orange two, histone H two B 및 DPA mito를 발현하는 세포는 핵에서 오렌지색 형광을, 미토콘드리아에서 녹색 형광을 나타냅니다. 낮은 출력의 488 nanometer 여기광으로 모든 형광을 껐을 때, M orange의 광전환은 최소한으로 일어납니다.M orange two는 고출력 488 nm 여기를 통해 적색으로 광전환될 수 있습니다. M orange two가 광전환되면, 800 nm 이광자 여기를 사용하여 형광을 다시 켤 수 있습니다. 이중 프로브 광학 표적화를 통해 세포를 네 가지 서로 다른 방식으로 라벨링할 수 있습니다.이 기술을 사용하면 네 가지 서로 다른 세포 집단을 특이적으로 표지할 수 있습니다. 보신 바와 같이, 이 절차에서 가장 어려운 부분 중 하나는 m orange를 광전환시키지 않고 MPA를 비활성화하는 것입니다. 이 기술을 숙달하면, 예를 들어 췌장 베타 세포에서 여러 집단을 추적하는 것과 같은 추가 실험을 이 시스템을 사용하여 수행할 수 있습니다.이상입니다. 이번 프레젠테이션이 유용했기를 바라며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

배우세요 형광 단백질 mOrange2와 Dronpa를 이용한 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기법으로 살아있는 세포에서 4가지 세포 집단을 선택적으로 표지하는 방법입니다. 이 기법은 실시간 세포 동역학 연구에 유용합니다.

라이브 세포에 형광 단백질과 듀얼 프로브 광학 하이라이트 기능을 정화의 Photoconversion

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