이미징 CA의 기술 ^{2 +} 인간 정자의 시그널링

본 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 칼슘 리포터 염료로 표지된 고정된 인간 정자의 이미지 시리즈를 얻는 것입니다. 먼저, 정액 혈장에서 운동성 세포를 배양 배지로 유도하여 분리합니다. 세포를 수용능화한 후 형광 칼슘 지시약으로 표지하고, 이를 도립 형광 현미경에 장착된 융합 이미징 챔버로 옮깁니다.

칼슘 이온 농도 반응을 타임랩스 이미지 시리즈로 캡처하고 분석하여 단일 세포 반응을 추출합니다. 안녕하세요, 저는 영국 버밍엄 대학교 생명과학부 Steven J. Public Cova 박사 연구실의 Edwin Andres Morales Garcia입니다. 저는 Public Overlap 연구실의 Katherine Nash입니다.

저는 Public Overlap의 Jennifer Morris입니다. 오늘은 개별 인간 정자 세포 내 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 난자와 여성 생식관에서 유래된 자극물을 이용해 정자 활성 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 정액 플라즈마로부터 운동성 세포를 분리하기 위해, 수집 시점부터 최대 30분 동안 정액 샘플을 37 °C에서 보관하십시오. 0.3% BSA가 첨가된 L'S 균형 염 용액(S-E-B-S-S로 약칭) 1 mL를 일련의 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 분주합니다. 각 튜브의 S-E-B-S-S 층 아래에 정액 0.3 mL를 조심스럽게 층분리하여 넣고 튜브 캡을 느슨하게 닫습니다.

튜브를 37 °C, 6% carbon dioxide 조건에서 1시간 동안 45도 각도로 배양합니다. 운동성 세포가 S-E-B-S-S로 헤엄쳐 올라갈 수 있도록, 상층액 0.7 mL를 조심스럽게 피펫으로 제거하고 모든 튜브의 용액을 깨끗한 15 mL 폴리스티렌 원심분리 튜브에 모읍니다. 가볍게 흔들어 혼합한 후, formalin으로 고정된 세포를 새로운 bowel counting chamber에서 계수합니다.

S-E-B-S-S에서 농도를 mL당 600만 세포로 맞춘 후, 정자를 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 200 µL씩 분주합니다. 캡을 느슨하게 닫습니다. 수정능 획득 세포의 반응을 연구하는 경우, 수정능 획득이 일어날 수 있도록 37 °C, 6% CO2 조건에서 튜브를 5~6시간 동안 배양합니다. 22 x 50 mm 슬라이드 중앙에 10% polylysine 10 µL를 여러 개의 작은 방울로 떨어뜨려 도포합니다.

커버 슬립의 한 면에 번호를 매기고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 진공 그리스를 사용하여 처리된 면이 위로 향하게 하여 해당 용도로 제작된 융합 이미징 챔버에 커버 슬립을 부착합니다.

각 이미징 실험에 대해, 수용능을 갖춘 세포가 담긴 튜브 하나를 선택하고 최종 농도가 10 $\mu\text{M}$이 되도록 DMSO에 용해된 2.5 $\text{mg/mL}$ Calcium dependent organ green 1.2 $\mu\text{L}$를 첨가합니다. 해당 튜브를 37 °C, 6% $\text{CO}_2$ 조건에서 40분 동안 배양합니다.

P 200 팁을 장착한 200 µL 피펫을 사용하여 튜브 내의 용액을 완전히 제거합니다. 유입구(inflow port)로 조심스럽게 주입하여 챔버를 채웁니다. 기포가 유출구(outflow)를 통해 빠져나갈 수 있도록 챔버를 기울입니다.

챔버 전체를 인큐베이터에 넣고 37 °C, 6% carbon dioxide 조건에서 20분 동안 추가로 배양합니다. 이는 정자가 poly D lysine에 부착되도록 하기 위함입니다. 챔버를 도립 형광 현미경에 장착하고 관류 장치에 연결합니다.

관류액이 모두 씻겨 내려가도록 준비물을 최소 10분 동안 어두운 곳에 둡니다. 40배 또는 60배 배율의 위상차 현미경으로 부유 세포와 세포 외 물질을 관찰하고, 각 세포의 형광을 개별적으로 평가할 수 있도록 세포 간 간격이 충분한 시야를 선택하십시오. 세포는 적절하게 부착되어 있어야 하며, 가급적 뚜렷한 플레저(fledger) 활성을 보이는 것이 좋습니다.

현미경을 녹색 형광 채널로 전환하십시오. 선명한 형광 이미지를 얻는 데 필요한 최소한의 노출 시간을 유지하십시오. 이는 IQ 소프트웨어에서 광퇴색을 줄이기 위함입니다.

시계열 이미지 획득을 활성화합니다. 0.1 Hz의 빈도로 이미지를 획득하고, 소프트웨어 제어 셔터를 사용하여 조명을 제한합니다. 처음 3~5분 동안 대조군 기간으로 기록한 후, 관류 시스템의 헤더에서 식염수를 교체하여 식염수의 칼슘 농도를 조절하고 약물을 투여합니다.

각 자극이 헤더에 추가된 시간을 기록하고, 본 프로토콜의 서술된 부분에 기술된 대로 챔버에 도달하는 시간을 계산하십시오. 이미지를 오프라인으로 분석하려면, 그리기 도구 중 하나를 사용하여 각 세포 또는 세포의 일부 주위에 관심 영역(ROI)을 지정하십시오. 여기서는 저장된 칼슘이 이 영역에서 동원되므로 정자 머리 후방 부위를 지정합니다. 슬라이더 바를 스크롤하여 이미지 시리즈를 확인하십시오.

ROI 범위를 완전히 벗어난 세포, 다른 세포와 겹치는 세포, 또는 세포 사멸의 특징인 형광 강도의 급격한 증가 후 급감 현상을 보인 세포를 식별하여 제거하십시오. 분석 기능을 사용하여 각 ROI에 대한 시간별 형광 강도 시리즈를 생성하십시오. 이후 해당 데이터는 스프레드시트로 내보내어 분석할 수 있습니다.

이 이미지들은 3 µM progesterone 자극 중에 얻은 일련의 영상입니다. 하단 행에는 의사색(pseudo color)이 입혀져 있습니다. 상대적인 강도 변화를 더 잘 보여주기 위해, progesterone이 이 지점에서 챔버 내부로 유입되었습니다.

이 결과들은 타임랩스 비디오로 애니메이션화되어 있습니다. 형광 강도가 급격히 상승한 후 천천히 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 세포 내 칼슘 농도의 상응하는 변화를 나타냅니다. 여기의 데이터는 세 개 세포의 후방 머리 부분의 평균 강도로부터 정량화되었습니다.

화살표로 표시된 시점에 3 µM progesterone을 첨가하였습니다. 점선은 대조군의 평균 형광값을 나타냅니다. 지금까지 고품질의 세포를 분리하고, 칼슘 민감성 염료를 로딩하며, 자극에 대한 개별 세포의 반응을 모니터링하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 가능한 최상의 세포 집단을 사용하고, 광손상을 방지하기 위해 세포의 조명을 최소화하며, 관찰하고자 하는 반응에 가장 적합한 염료를 선택하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.