Name: 이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 인간 정자의 칼슘 신호 전달을 형광 염료와 타임랩스 현미경으로 측정하는 방법을. 이 기술은 생식 생물학 연구와 난자 유래 자극에 대한 정자 반응 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트, 의학 연구위원회, 더 로열 학회, 버밍엄 과학 도시와 불임 연구 신탁에 의해 투자입니다. 우리는 이미징 rigs 구축 및 통합에 케언 연구의 전문가 도움을 인정하고 싶습니다.

정상적인 정액 분석과 건강한 비옥한 남성의 정자는 일반적으로 다음과 같은 이미지 준비하고 있습니다. <ol><li> 정액 샘플은 더 이상 30 분 37 ° C에 저장됩니다. 1.8 CaCl 2 0.2 H 2 O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO 4 0.7 H 2 O, 26.2 NaHCO 3, 1.0 아니 2 PO 4 : MM, 세포 보충 얼의 균형 소금 솔루션 (sEBSS에까지 수영을하여 정액 플라즈마에서 격리됩니다. 2 시간 2 O, NaCl 116.4, 55.6 D - 글루코오스, 2.73 나의 pyruvate, 41.8 나의 락트 산)은 0.3 % 숯 de-lipidated/fatty 산성 무료 분수 V BSA (BSA의 품질은 정자의 성공 capacitation 중요합니다)과 보완. sEBBS 1 ML 5 ML 튜브 일련의 각각에 pipetted 부드럽게 정액의 0.3 ML로 underlayered 있습니다. 상단 0.7 ML이 부드럽게 각 튜브에서 제거하고 풀링됩니다.; 1시간 (6 % CO 2가 37 ° C)에 대한 부화 후 정자 정지 10 μl가 세포를 고정하기 위해 포르말린 1% (V / V) 90 μl에 희석되어 그 정자는 노이 바 우어 챔버에 포함됩니다. 서스펜션의 셀 밀도는 다음 6,000,000 세포 / ML로 (sEBSS)를 조정됩니다. </li><li> 5-6 H 위해 capacitation 수 있습니다.; 예제는 다음 느슨하게 덮인 튜브와 incubated (6 % CO 2 37 ° C)는 200 μl의 aliquots으로 나뉘어져 있습니다 </li><li> Coverslips (22x50 mm)는 이전에 폴리 - D - 라이신과 함께 취급하고 있습니다. 폴리 - D - 라이신 용액 (10 % W / V) 10 μl는 coverslip의 중심에 작은 방울의 숫자로 적용됩니다. 폴리 - D - 라이신은 다음 건조 공기를 허용됩니다. 이것은 가열 무대에서 수 있으며 건조를 완료해야합니다. . 워너 RC20 챔버와 비슷한 폴리 - D - 라이신 -; coverslip는 동봉된, 목적 - 건설, perfusable, 폴리 카보 네이트 이미징 챔버 (≈ 180 μl 용량 크기 35mm X 20mm X 5mm)를하기 위해 진공 그리스와 함께 첨부되어 있습니다 코팅 coverslip은 세포가 거꾸로 현미경에서 볼 수 있으며 12mm 직경 원형 coverslip 빛의 전송을 허용, 챔버의 상부 표면을 형성하는 챔버의 기초를 형성합니다. </li><li> 오레곤 그린 BAPTA1 - AM (OGB) 또는 칼슘 그린 1 - AM은 세포를 라벨에 사용됩니다. OGB은 DMSO에 용해에 의해 준비가되어 있습니다. Pluronic F127은 산성 (세제) 염료의 'clumping'을 방지하기 위해 DMSO에 포함되어 있습니다. 이것은 실험실 (0.5 ML DMSO 100 MG의 Pluronic)에서 준비할 수, 즉시 사용하기 전에, 또는 미리 준비를 구입할 수 있습니다. 20 μl는 OGB (2.5 MG / ML)의 50 μg의 나누어지는에 추가됩니다. 유리병은 다음 동결하고 나중에 사용하기 위해 해동 저장할 수 있습니다. </li><li> 정자의 capacitation 후 (sEBBS에 5-6 H, 37 ° C, 6 % CO 2) 튜브가 이미징 및 OGB 솔루션 1.2 μl를 위해 선택되어이 10 μm의의 최종 농도를 제공, 추가됩니다. 튜브는 다음 세포 현탁액이 부드럽게 P1000 (파란색) 피펫 팁과 이미징 챔버의 유입 포트에 주입되는 후, 추가로 40 분 incubated입니다. 챔버 20 분, 아래 보육, 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip 측면에 배치됩니다. 세포는 챔버의 표면을 따라 수영하는 경향과 폴리 - D - 라이신 - 코팅 영역을 준수합니다. </li><li> 챔버 이제 재관류 장치에 연결되어 약 0.5 ML / 분 perfused, 현미경에 장착됩니다. 롤러 펌프 출구 포트에서 챔버 및 오버플로 생리가 함정과 흡입 펌프에 의해 제거됩니다 피드. 느슨한 세포와​​ 세포외 염료는 챔버의 재관류에 의해 제거 반면 준비는 적어도 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 남아 있습니다. 온도 안정성 작은 변동은 세포 칼슘 2 + 항상성에 영향을 미치지 않을 수도 있기 때문에 결정적인 중요하지만 또한 염료의 K D에 영향을 줄 수 있습니다. 실험은 일반적으로 25 수행됩니다 ° C,이 수준의 어두운 방의 온도를 유지하여 달성했습니다. 우리는 필요한 수준의 실내 온도를 유지하는 것은 온도 조절 단계 또는 호수 유입에 thermostatically 제어 히터를 사용하여보다 온도와 초점 안정성을 제공하는 것으로 확인되었습니다. </li><li> 전지는 위상 대비 (40x 또는 기름 침지 60x) 목적 및 이미징을위한 영역이 선택에 따라 볼 수 있습니다. 생리 흐름 판상하고 일관성이 어디 입구 포트 근처에있는 폴리 - D - 라이신 코팅 영역의 부분은 좋습니다. 세포 밀도가 적절한 영역을 사용하는 것도 중요합니다 (과도한 밀도는 인접한 세포에서 신호의 픽업을 통해 데이터의 품질과 무결성에 영향을)과 세포가 적절하게 연결되어 있지만 flagellar 활동이보고 알 수있는입니다. 위상 콘트라스트 이미지가 저장됩니다. 시간이 명확한 형광 이미지를 (일반적으로 50-200 MS) 취득에 필요한 최소한으로 감소 및 노출, 현미경은 다음 형광 모드 (방출 540 nm의 여기 480 NM)로 전환됩니다. </li><li> 실험은 시간 시리즈 이미지 수집 소프트웨어 (IQ)를 활성화하여 시작합니다. 일반적으로 이미지는 0.1 Hz에서에서 취득하고 조명은 softwa를 사용하여 이미지 수집의 기간으로 제한됩니다제어 셔터를 다시. 훨씬 더 이미지 수집 요금을 사용할 수 있지만 수당은 표백의 문제와 세포 (토론 참조) 사진 손상에 의한 유물 세대하셔야합니다. IQ (및 대부분의 다른 수집 소프트웨어 플랫폼) 실험 중 형광 실시간 그래프를 허용합니다. </li><li> 3~5분 기간 염분 성분의 조작 (예 : [칼슘 2 +] O) 및 약물의 응용 프로그램의 제어 기간 후 재관류 헤더에 호수의 교체에 의해 이루어진다. 각 자극의 이외의 시간은 이미징 챔버 도착의 시간이 느리게 응답 (0.1 Hz에서에서 샘플) 여기에 설명된 평가에 대한 충분한 정확도를 제공하는 계산 수 있도록 기록됩니다. 더 빠른 응답보다 정확도가로 워너 RC20 챔버에서 제공하는 두 번째 유입 포트를 통해 직접 생리 흐름에 자극을 추가하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 이미지 IQ를 사용하여 오프라인 분석하고 있습니다. (이자 (로아)의 영역은 각각의 셀 (또는 셀의 일부) 원형 그려되고 또한 세포 자유 구역은 소프트웨어 (자동 배경 제거를 위해 선택됩니다. 이미지 시리즈는 다음 acrosome 반응을 사망 또는 받았습니다 세포를 제거하는 검사 이것은 실험과 시계열로 분석하면 아티팩트를 일으킬 수있는 충분한 운동을 보여주었다 그 동안 세포질 염색의 손실) 형광 다음에 크고 급속한 증가로 나타납니다. </li><li> 시간 형광 강도 시리즈는 다음 각 투자 수익 (ROI)에 대한 취득하고 이러한 데이터는 Excel에서 오프라인 분석하고 있습니다. 처음에는 형광이 방정식을 사용하여 컨트롤 기간 동안 얻은 평균 값을 정규화는 R = [(FF 레스트) / F 휴식] X 100 %, R은 관리 기간에 비해 형광의 % 변화가 어디 있는지, F 형광 강도는 시간 T와 F의 나머지 부분에서 제어 기간 동안 얻은 F의 최소 30 결정의 의미입니다. </li></ol> 대표 결과 그림 1은 세포가 3 μm의 제품 progesterone과 자극했다하는 실험에서 이미지의 일련을 보여줍니다. 상단과 영화 1 회색 규모의 형광 이미지를 표시하고 멋진 '색상 낮은 형광 강도를 나타내는 같은 mages'는 어디에 (이미지 J의 테이블 '16_colors 조회) 'pseudocolor에서 (그리고 영화 2) 다음과 같습니다 '따뜻한'색상 높은 형광 강도를 나타냅니다. 세포는 IQ의 조회 테이블을 사용하여 실험 도중 pseudocolor에서 볼지만, 그레이 스케일을 사용하는 것이 일반적 평가에 대한 더 유익합니다. 세포가 잘 표시 여부를하실 수 있습니다. 첫 번째 두 이미지 0 S 100 S 녹음 시작 후에서 수집된 있었다. 형광은 안정 및 게시물 acrosomal 영역과 정자의 목을 강하게하는 경향이 있습니다. Progesterone은 약 175 S에서 이미징 챔버를 입력하고 3 차 및 4 번째 이미지 (180 S와 220 S) [+ 칼슘 2] I (형광) 후부 머리와 세포의 목 지역에서 발생의 급속한 증가를 보여줍니다. 이후 이미지가 290에서 초기의 붕괴를 보여주는 360, 740, 990 및 1440 S입니다 [칼슘 2 +] 나는 과도하고 지속적인 보조 고도의 개발. 그림 2는 표준 형광 각 ROI (제어 기간에 비해 형광의 % 변화)에 대한 원료 형광 값을 변환, 스프레드 시트 분석을 보여주는 그림 3은 3 μm의의 progesterone의 '전형적인'반응을 보여주는 3 셀 시간 - 표준 형광 플롯을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. 전지에서 예제 데이터 progesterone과 자극. 그레이 스케일 (상단)와 pseudocolor (하단 행)의 형광 이미지의 일련 표시됩니다. 타임 포인트가 0, 180, 220, 290, 360과 990s입니다. 3 μm의의 progesterone은 175에서 이미징 챔버를 입력 S. 로아는 첫 번째 패널에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. Excel의 단일 세포 형광 데이터의 분석. 검은 수치 형광 데이터의 시계열 있으며, 수직으로 배열. 빨간색 숫자는 (아래)의 텍스트에서 주어진 방정식을 사용하여 얻은 정규화된 데이터입니다. 그래프는 자극에 따라, 작은 oscillations의 속도가 느린 상승 및 시리즈 다음 형광의 과도 상승을 보여주는이 실험에서 세포 64 표준 형광 시간 플롯을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3. 3 각 세포에 대한 형광 시간 흔적이 가치를 제어에 관한 %의 변화로 표현 .. 3 μm의의 progesterone은 화살표로 표시된 시간에 추가되었습니다. 점선 프로그램은 제어 형광을 뜻합니다.

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공적으로 수행되면,이 기술은 인간의 정자의 수 및 자발적인 유도 칼슘 2 + 신호의 배포 및 반응 속도론의 기록. 응답은 인간의 정자들이 자연과 칼슘 2 + 자극 신호의 변화를 많이 보여줄 수 있기 때문에 중요합니다 세포의 다수 (최대 200)에서 얻을 수 있습니다. 성공적인 분류 및 녹음하는 동안 세포의 생존은 샘플의 품질에 크게 의존하고 있습니다. 나쁨 샘플 가난한 라벨, 가난한 반응과 세포가 녹음 도중에 죽을 수도를 제공합니다. 인간의 정자는 사진 손상에 민감하고 따라서 세포의 생존을 극대화하고 세포를 파괴로 인해 유물을 최소화하기 위해 최소한의 필요한 조명 (강도와 노출 시간 모두)을 사용합니다. 카메라가 약한 형광을 데리러 때문에 높은 민감도 카메라 (낮은 강도 조명의 사용을 허용) 큰 도움이됩니다. 백 - 조명, EM - CCD 카메라는 매우 비싸지만, 특히 잘 적합합니다. LED 조명 (대신 여기 필터 크세논이나 수은 램프를 사용하여 또한 세포의 생존 (Nishigaki 외, 2006)을 향상시킵니다. 그것이 각각의 비율이 두 가지 이미지를 데리고 필요하기 때문에 Fura은 자외선과 여진을 필요로하고 있기 때문에 우리는 비율 - 메트 릭 영상의 명백한 이점에도 불구하고, Fura - 2를 사용하지 마십시오. 단일 파장, 가시 광선의 염료, 형광 강도의 정상화 주로 세포 사이에 염료를 로딩의 차이에 대한 보상, 아니라 개별 세포 내에 염료 배포하고, 이것을 염두에 부담하셔야와 함께 얻은 데이터. 단일 파장의 염료는, 원칙적으로 보정 수 있지만, 기술의 정확성이 떨어집니다 우리는이 작업을 수행하지 마십시오. 심지어 교정없이 Fura - 2 (또는 방출 비율 염색 인도)로 얻은 비율 데이터,의 상대 변화의 acceptably 충실 표현하다 반면에 [칼슘 2 +] I, 단일 파장 염료의 형광 강도는 훨씬 선형 출신 [칼슘 2 +] I. 관련 포화 곡선의 가장 유용한 부분 단일 파장 염료에 대한 관계는 일반적으로 로그에 대략. 우리는 현재 사용 오레곤 그린 BAPTA - 1 (그림 4)는 작은 변화에 민감하기 때문에 [칼슘 2 +] 나는 가까이 수준의 S (50-100 NM)을 쉬고 있습니다. 언제 [칼슘 2 +] 1 μm의 응답이 포화 수 있습니다 형광 변화와 염료의 관점에서 세 이하 대표한다 위 나 상승합니다. UV 여기에 resorting없이 기술 향상을 위해 옵션은 같은 Fluo - 3 및 Fura 빨강으로 염료와 부하 셀을 두 번하는 것입니다. 둘 다 488 NM에 흥분하지만, 동시에 그들의 반응은 매우 다릅니다 수 있습니다. 540 650 nm의에서 방출의 녹음의 정확한 모니터링을위한 더 나은 방법을 제공할 수있는 비율을 제공하는 [칼슘 2 +] I (Haughland, 2002)과 정자 (Nisigaki 외, 2006)에 적용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="그림 4"> 그림 4. 오레곤 그린 BAPTA - 1과 오레곤 그린 BAPTA - 2 무료 [칼슘 2 +] (NM)와 피크 파장 (약 525 nm의)에서 형광 방출 간의 관계. OGB1 쉬고에서 높은 형광 제공 [칼슘 2 +] 그러므로하지만, 낮은 레벨에서 saturates 그리고이 작은 유용한 범위를하고 있습니다. 이러한 플롯에 대한 데이터는 분자 프로브 핸드북 (Haughland, 2002)에서 얻은되었습니다.

<table><tbody><tr><td>저조도 카메라</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Andor</td><td>지능 지수</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>미국 국립보건원</td><td>Image J</td><td>퍼블릭 도메인 소프트웨어</td></tr><tr><td>LED 조명 시스템</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (DMSO 내 20% 용액)</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 ca의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

형광등, CA 탑재 세포의 형광 현미경<sup&gt; 2 +</sup&gt;에 민감한 염료는 칼슘의 공간과 시간적 측면의 측정에 사용됩니다<sup&gt; 2 +</sup&gt; 라이브 세포에 신호. 여기 우리는 CA와 인간의 정자의 suspensions 로딩을위한 실험실에서 사용되는 방법을 설명<sup&gt; 2 +</sup염료&gt;를 -보고 및 생리적 자극 동안 형광 신호를 측정. 운동성이있는 세포는 직접 수영을 접속하여 분리 실험에 따라 0-24 H에 대한 capacitating 조건 하에서 incubated 있습니다. 칼슘의 세포 permeant AM (acetoxy 메틸 에스테르) 에스테르 형태<sup&gt; 2 +</sup&gt; -보고 염료는 다음 H는 세포질에 염색의 로딩에 사용할 수있는 전지 나누어지는 1의 기간에 추가됩니다. 우리는 세포에 사진 피해를 최소화하기 위해 보이는 파장 염료를 사용하여, 그러나 이것은 ratiometric 녹음이 가능하지 않습니다. 이 방법의 장점과 단점을 설명합니다. 로딩 기간 동안 세포 이미징 챔버로 도입 폴리 - D - 라이신 코팅 coverslip을 준수 사용할 수 있습니다. 로딩 기간 초과 색소와 느슨한 세포의 끝에 재관류 장치에 대한 챔버의 연결에 의해 제거됩니다. 챔버가 지속 perfused이며, 자극 및 수정된 살린스은 다음 재관류 헤더에 추가됩니다. 실험 형광 이미지의 시간 경과 수집하여 기록하고 수동으로 관심 영역을 그림으로써, 세부 오프라인에서 분석하고 있습니다. 데이터는 각각의 셀 (또는 셀의 일부), 그래프가 CA를 보여주는 동안 그러한 사전 자극 수준으로 정규화<sup&gt; 2 +</sup형광의 % 변화로&gt; 응답이 얻어진다.

자극 - evoked [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 개별 인간의 정자] 나는 신호를 평가하고 있습니다. 운동성이있는 세포는 칼슘과 함께로드됩니다<sup&gt; 2 +</sup&gt; 구분 형광 염료 (AM - 에스테르 방법) 및 perfusable 챔버에 고정. 세포는 시간이 경과 형광 현미경으로 몇 군데와 perfusing 매체를 통해 자극하고 있습니다. 하나의 세포 (또는 지역)의 응답은 Excel을 사용하여 오프라인 분석하고 있습니다.

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

형광 Ca2+ 민감성 염료가 로딩된 세포의 형광 현미경 관찰은 ... 내 Ca2+ 신호 전달의 공간적 및 시간적 양상을 측정하는 데 사용됩니다.

본 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 칼슘 리포터 염료로 표지된 고정된 인간 정자의 이미지 시리즈를 얻는 것입니다. 먼저, 정액 혈장에서 운동성 세포를 배양 배지로 유도하여 분리합니다. 세포를 수용능화한 후 형광 칼슘 지시약으로 표지하고, 이를 도립 형광 현미경에 장착된 융합 이미징 챔버로 옮깁니다.칼슘 이온 농도 반응을 타임랩스 이미지 시리즈로 캡처하고 분석하여 단일 세포 반응을 추출합니다. 안녕하세요, 저는 영국 버밍엄 대학교 생명과학부 Steven J. Public Cova 박사 연구실의 Edwin Andres Morales Garcia입니다. 저는 Public Overlap 연구실의 Katherine Nash입니다.저는 Public Overlap의 Jennifer Morris입니다. 오늘은 개별 인간 정자 세포 내 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 난자와 여성 생식관에서 유래된 자극물을 이용해 정자 활성 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 정액 플라즈마로부터 운동성 세포를 분리하기 위해, 수집 시점부터 최대 30분 동안 정액 샘플을 37 °C에서 보관하십시오. 0.3% BSA가 첨가된 L'S 균형 염 용액(S-E-B-S-S로 약칭) 1 mL를 일련의 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 분주합니다. 각 튜브의 S-E-B-S-S 층 아래에 정액 0.3 mL를 조심스럽게 층분리하여 넣고 튜브 캡을 느슨하게 닫습니다.튜브를 37 °C, 6% carbon dioxide 조건에서 1시간 동안 45도 각도로 배양합니다. 운동성 세포가 S-E-B-S-S로 헤엄쳐 올라갈 수 있도록, 상층액 0.7 mL를 조심스럽게 피펫으로 제거하고 모든 튜브의 용액을 깨끗한 15 mL 폴리스티렌 원심분리 튜브에 모읍니다. 가볍게 흔들어 혼합한 후, formalin으로 고정된 세포를 새로운 bowel counting chamber에서 계수합니다.S-E-B-S-S에서 농도를 mL당 600만 세포로 맞춘 후, 정자를 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 200 µL씩 분주합니다. 캡을 느슨하게 닫습니다. 수정능 획득 세포의 반응을 연구하는 경우, 수정능 획득이 일어날 수 있도록 37 °C, 6% CO2 조건에서 튜브를 5~6시간 동안 배양합니다. 22 x 50 mm 슬라이드 중앙에 10% polylysine 10 µL를 여러 개의 작은 방울로 떨어뜨려 도포합니다.커버 슬립의 한 면에 번호를 매기고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 진공 그리스를 사용하여 처리된 면이 위로 향하게 하여 해당 용도로 제작된 융합 이미징 챔버에 커버 슬립을 부착합니다.각 이미징 실험에 대해, 수용능을 갖춘 세포가 담긴 튜브 하나를 선택하고 최종 농도가 10 $\mu\text{M}$이 되도록 DMSO에 용해된 2.5 $\text{mg/mL}$ Calcium dependent organ green 1.2 $\mu\text{L}$를 첨가합니다. 해당 튜브를 37 °C, 6% $\text{CO}_2$ 조건에서 40분 동안 배양합니다.P 200 팁을 장착한 200 µL 피펫을 사용하여 튜브 내의 용액을 완전히 제거합니다. 유입구(inflow port)로 조심스럽게 주입하여 챔버를 채웁니다. 기포가 유출구(outflow)를 통해 빠져나갈 수 있도록 챔버를 기울입니다.챔버 전체를 인큐베이터에 넣고 37 °C, 6% carbon dioxide 조건에서 20분 동안 추가로 배양합니다. 이는 정자가 poly D lysine에 부착되도록 하기 위함입니다. 챔버를 도립 형광 현미경에 장착하고 관류 장치에 연결합니다.관류액이 모두 씻겨 내려가도록 준비물을 최소 10분 동안 어두운 곳에 둡니다. 40배 또는 60배 배율의 위상차 현미경으로 부유 세포와 세포 외 물질을 관찰하고, 각 세포의 형광을 개별적으로 평가할 수 있도록 세포 간 간격이 충분한 시야를 선택하십시오. 세포는 적절하게 부착되어 있어야 하며, 가급적 뚜렷한 플레저(fledger) 활성을 보이는 것이 좋습니다.현미경을 녹색 형광 채널로 전환하십시오. 선명한 형광 이미지를 얻는 데 필요한 최소한의 노출 시간을 유지하십시오. 이는 IQ 소프트웨어에서 광퇴색을 줄이기 위함입니다.시계열 이미지 획득을 활성화합니다. 0.1 Hz의 빈도로 이미지를 획득하고, 소프트웨어 제어 셔터를 사용하여 조명을 제한합니다. 처음 3~5분 동안 대조군 기간으로 기록한 후, 관류 시스템의 헤더에서 식염수를 교체하여 식염수의 칼슘 농도를 조절하고 약물을 투여합니다.각 자극이 헤더에 추가된 시간을 기록하고, 본 프로토콜의 서술된 부분에 기술된 대로 챔버에 도달하는 시간을 계산하십시오. 이미지를 오프라인으로 분석하려면, 그리기 도구 중 하나를 사용하여 각 세포 또는 세포의 일부 주위에 관심 영역(ROI)을 지정하십시오. 여기서는 저장된 칼슘이 이 영역에서 동원되므로 정자 머리 후방 부위를 지정합니다. 슬라이더 바를 스크롤하여 이미지 시리즈를 확인하십시오.ROI 범위를 완전히 벗어난 세포, 다른 세포와 겹치는 세포, 또는 세포 사멸의 특징인 형광 강도의 급격한 증가 후 급감 현상을 보인 세포를 식별하여 제거하십시오. 분석 기능을 사용하여 각 ROI에 대한 시간별 형광 강도 시리즈를 생성하십시오. 이후 해당 데이터는 스프레드시트로 내보내어 분석할 수 있습니다.이 이미지들은 3 µM progesterone 자극 중에 얻은 일련의 영상입니다. 하단 행에는 의사색(pseudo color)이 입혀져 있습니다. 상대적인 강도 변화를 더 잘 보여주기 위해, progesterone이 이 지점에서 챔버 내부로 유입되었습니다.이 결과들은 타임랩스 비디오로 애니메이션화되어 있습니다. 형광 강도가 급격히 상승한 후 천천히 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 세포 내 칼슘 농도의 상응하는 변화를 나타냅니다. 여기의 데이터는 세 개 세포의 후방 머리 부분의 평균 강도로부터 정량화되었습니다.화살표로 표시된 시점에 3 µM progesterone을 첨가하였습니다. 점선은 대조군의 평균 형광값을 나타냅니다. 지금까지 고품질의 세포를 분리하고, 칼슘 민감성 염료를 로딩하며, 자극에 대한 개별 세포의 반응을 모니터링하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때는 가능한 최상의 세포 집단을 사용하고, 광손상을 방지하기 위해 세포의 조명을 최소화하며, 관찰하고자 하는 반응에 가장 적합한 염료를 선택하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

여기, 캘리포니아2 +에 효과의 평가 대 한 두 개의 중간 처리량 분석-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응 같습니다. 이 분석 실험은 신속 하 고 쉽게 화면에 캘리포니아2 +효과 대 한 화합물의 큰 금액을 사용할 수 있습니다-인간의 정자에서 신호 및 acrosome 반응.

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

이 프로토콜은 이온 채널 활동을 직접 기록하는 것을 목표로 전체 세포 구성에서 포유류 정자 세포의 전기 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 정자 이온 채널의 전기 생리학적 프로파일을 설명하는 데 중요한 역할을 했으며 분자 정체성과 조절을 밝히는 데 도움이 되었습니다.

포유류 정자 세포의 원형질막을 가로지르는 전기 전류 기록

본 프로토콜은 단일 세포분석기로 인간 정자의 세포사멸, 미토콘드리아 막 전위 및 DNA 손상을 측정할 수 있는 실용적인 솔루션을 제공합니다.

인간 정자의 기능적 결함을 검출하기 위한 바이오마커의 유세포 분석

여기에 설명된 AcroSensE 마우스 모델 및 살아있는 세포 이미징 방법은 정자 아크로솜의 세포 내 구획에서 칼슘 역학을 연구하고 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.

실시간 이미징 of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

이 비디오 기사는 양질의 형광을 달성하기 위해 정액 샘플을 처리하는 방법을 단계적으로,...

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

학습하세요 인간 정자의 칼슘 신호 전달을 형광 염료와 타임랩스 현미경으로 측정하는 방법을. 이 기술은 생식 생물학 연구와 난자 유래 자극에 대한 정자 반응 분석에 활용됩니다.

이미징 CA의 기술^{2 +} 인간 정자의 시그널링

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