Name: 늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 배우세요 늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 원발성 신경 세포 배양을 준비하는 방법을. 중추 뇌 영역을 배양하여 신경 돌기 성장과 칼슘 이미징을 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 신경 발달 연구에 유용합니다.

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이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. 이 작품에 대한 추가 지원은 HHMI 교수 프로그램을 통해 DKOD 지원하는 UC 어바인에 부여에 의해 제공되었다.

culturing의 하루 전에 준비 : <ol><li> 멸균 해부 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 멸균 DMEM 만들기 4 10 ML aliquots에 보관 ° C를 2 주 동안. </li><li> 1 개월 50 또는 100 μl aliquots에 살균 DDM2 보충 및 동결하십시오. </li><li> 코나 / laminin하십시오. </li><li> 외투 coverslips. 옵션 : 최대 4 개월까지 냉동 살균 CNBM하고 저장하십시오. </li></ol> culturing의 날에 나도 층류 흐름 후드의 효소 솔루션 (ES)를 준비 <ol><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브의 솔루션 (DS)를 해부 5 ML 놔. </li><li> 0.6 ML eppendorf에 L - 시스테인의 0.8 MG를 저울질하고 DS 150 μl를 추가합니다. 결정들이 갈 때까지 최대 피펫 아래로. </li><li> DS / 5 ML의 DS에 시스테인 150 ML을 추가하고 잘 섞는다. </li><li> Papain 50 U을 (부대) 추가합니다. </li><li> 0.1 N 나 OH 7 ML을 추가하고 잘 섞는다. Solution은 30 분 이내에 삭제됩니다. 활성화되면. </li><li> 멸균 1.5 ML 스크류 캡 microfuge 관에 0.2 mm의 주사기 필터와 필터 효소 솔루션 Papain : 5 ML의 DS 50 U를 원하십니까. 각 배치는 약간의 차이이므로, 얼마나 계산해야합니다 : 37.3 MG / ML 및 28.3 U / MG 37.3 X 28.3 = 1055.59 U / ML (1000 ML) 50 U = 47.4 ML </li></ol> II. DDM2 미디어 만들기 culturing의 당일 : DDM2를 만들기 위해 다음과 같은 보충제를 추가 DMEM의 10 ML은 culturing 전에 보충제를 추가합니다 : <ol><li> 100μl 트랜스페린 </li><li> 100μl Putrescine </li><li> 100μl 셀레늄 </li><li> 100μl Progesterone </li><li> 50μl 인슐린 </li><li> 10μl 20 Hydroxyecdysone </li></ol> 참고 : 계획 모두 문화 (각 두뇌 개인 35mm 페트리 접시에 하나 coverslip, 1.5 미디어 MS / 문화 도금)에 대한 충분한 DDM2 확인 단계 III - VI는 한 nonsterile 실험실 벤치에있을 수있는 45 분 이내에 완료해야합니다. III. Pupae 콜렉션 <ol><li> 해부 현미경 유리병의 측면 10-15 pupae을 선택합니다. </li><li> 마른 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 플레이스 pupae. </li></ol> 참고 : 우리가 일반적으로 번데기 형성 (APF) 이후 55-78시간 사이 pupae의 두뇌를 사용합니다. neurite 가지의 전반적인 수준이 가장 오래된 pupae에서 약간 낮은 상태에서 머리 캡슐이 붕괴하는 경향 때문에 이것은 젊은 pupae에서 두뇌를 해부하다하는 약간 어렵습니다. 캔턴 - S wildtype 스트레인에서 다음 단계가 다른 작은 안료와 약간 붉은 갈색 빛을 아르 색소 눈이 인정하고 있습니다. IV. 해부 현미경으로 잘린 <ol><li> 플레이스 다음 페트리 접시의 뚜껑에 살균 해부 솔루션의 두 방울은 pupae 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 왼손에 좋은 포셉로 단일 번데기를 개최하고 번데기의 앞쪽에 끝에있는 표피를 제거하려면 오른쪽에있는 1 CC의 주사기에 부착된 27 게이지 주사 바늘을 사용합니다. </li><li> 포셉와 약간 번데기를 당기 머리가 나온다으로 목을 자르다 27 게이지 바늘을 사용합니다. </li><li> 바늘이나 집게의 끝부분으로 솔루션을 해부의 드롭에 머리를 전송할 수 있습니다. </li><li> 당신은 한 방울의 10-15 고개를 때까지 반복합니다. </li></ol> 해부 현미경으로 머리에서 두뇌의 V. 제거 <ol><li> 각 손에 27 게이지 바늘로 1 CC의 주사기를 개최. </li><li> 코 당신과 머리 등의 표면 북쪽에 직면 있도록 솔루션을 해부의 드롭에있는 파리 머리의 위치를​​ 다음을 사용하십시오. </li><li> 머리를 아래로 핀과 등의 표면에 복부에서가는 오른쪽 눈에 슬릿을 수있는 권리 바늘을 사용하는 코에 왼쪽에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 코의 지역 왼쪽 부근 오른쪽 바늘을 삽입하고 오른쪽 눈 속에있는 슬릿 방향으로 머리를 밀고, 부드럽게 왼쪽 눈 위에 표피를 놓으면 왼쪽 바늘을 사용합니다. 두뇌는 종종 광학 이오 모두 상대적으로 그대로, 오른쪽에있는 슬릿에서 등장한다가 없어요 역시 여전히 붙어 때때로 색소 안구 조직. </li><li> 새로운 멸균, 35mm 페트리 접시에 멸균 생리 해부 한 방울로 바늘과 전송의 뒤쪽에 머리를 밀어. </li><li> 각각의 유전자형에 대한 10-15 두뇌를 수집합니다. </li></ol> VI. 광학 엽 (叶)의 제거 및 효소 처리 <ol><li> 각 손에 27 게이지 바늘로 1 CC의 주사기를 잡고 해부 솔루션의 드롭 중 하나를 작은 영역에있는 모든 두뇌를 수집하는 이들을 사용하여 </li><li> 문화 나머지 조직은 중앙 두뇌 지역하므로 각 두뇌의 광 엽 (叶)을 제거하는 도구를 절단과 같은 주사기를 사용합니다. </li><li> 무균 papain 솔루션 1 ML를 포함 eppendorf 튜브에 하나의 유전자형의 모든 두뇌를 전송할 5 μl에서 설정 20 μl pipetman를 사용합니다. </li><li> 뇌는 60 RPM에서 회전 세트 10~15분에 대한 papain에 incubated. </li><li> 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기. </li></ol> 무균 층류 후드 안쪽 - 조직이 공기에 노출되어있는 모든 단계의 나머지 단계에 대한 층류 후드에서 수행되어야합니다. VII. 세탁 <ol><li> 효소 솔루션을 제거하고 멸균 해부 솔루션으로 대체합니다. </li><li> 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 무균 해부 솔루션으로 3 회 총 씻으십시오. </li><li> 해부 생리를 제거하고 DDM2로 바꿉니다. </li><li> 원심 분리기와 DDM2 2 회 총 씻으십시오. </li><li> 멸균 35mm 페트리 접시에 전송 두뇌와 미디어. </li></ol> VIII. 해부 현미경으로 분쇄 및 도금 <ol><li> coverslip의 중심에 DDM2 5 UL 놓습니다. </li><li> 노란 팁과 DDM2이 드롭 1 머리를 전송합니다. </li><li> 현미경, 작은 조각 (&lt;1 분 소요됩니다)에 두뇌를 주사위 27 게이지 바늘을 사용합니다. </li><li> 영상지도 아래, 큰 조각이 부드럽게 pipet의 일각에 빨려하고 중간에 다시 퇴학 수 있도록 좋은 지점으로 뽑아왔다 유리 pipet의 팁을 휴식. 우리는 100 μl 혈소판 모세관 유리 표준으로 입 흡입 튜브를 사용합니다. 참고 : 미디어의 거품을 끌지 않기 위해 조심하고 당신이 경험적으로 사용할 수있는 최고의 크기 pipet을 결정해야합니다. 좋은 사람 당신이 무슨 30초 / 두뇌의 일부 개별 세포도 일부 대형 대단히 짧은 시간과 머리를 떼어 놓다 수 있습니다. 당신은 높은 전력이 볼 때, 뉴런의 약 10~20%는 여전히 남아있는 일부 프로세스를해야하고 여전히 일부 대형 대단히 짧은 시간있을 것입니다. 당신이 너무 많이 떼어 놓다면 모든 세포가 원형되며, 그들은 살아남지 못할 것이다 너무 많은 피해를 입었됩니다. 이 단계는 연습이 필요하고 신속하게 변경할 수있는 큰 표면 대 부피 비율과 DDM2의 드롭의 osmolality과 산도가 있기 때문에 신속하게 할 수 있어야합니다. 조직 최대한 빨리 CO 2 배양기에 배치해야합니다. </li><li> &quot;유전자형, 날짜 및 시간&quot;페트리 접시의 뚜껑에 작성합니다. </li><li> 100mm 배양 접시에있는 35mm 페트리 접시를 (서부 유럽 표준시 kimwipe)를 넣어 30 분 CO 2 배양기에서 쉬라 구. </li><li> DDM2 1.5 ML로 35mm의 요리를 홍수. </li><li> 5% CO 2 배양기 (23 ° C)에서 보육의 문화를 유지. 참고 : 냉각 CO 2 배양기에 액세스할 수없는 경우, 표준 포유류의 조직 문화 배양기를 사용하고 중 23 시원한 공간과 더위에 넣어 ° C, 또는 실험실에 넣어 온도를 해제하고 사용 주변 주위 온도를 조절하기 위해 보육의 하단 트레이에 얼음. </li></ol> IX. 수유 셀 <ol><li> CNBM/B27 : 1 일 (다음날)에서 3시 1분 DDM2를 만들기 위해 CNBM/B27 0.5 ML (에어컨 미디어)를 추가합니다. </li><li> CNBM/B27 : 데이에 5 3시 1분 DDM2 미디어 1 ML를 교체하십시오. </li><li> CNBM/B27 모든 4-5일 : 3시 1분 DDM2와 함께 먹이를 세포 보관하십시오. 참고 : 문화가 아닌 시설의 연결 매체없이 재배하지만 뉴런 좀 더 깨지기 쉬운 표시 및 전기 생리학 실험에 사용하기 위해 더 어렵다 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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</ol>

그들이 neurites을 확장하고 기능적인 시냅스 연결을 형성 어디 배아 / 출생 후의 설치류 동물의 두뇌에서 수확 뉴런은 기본 세포 배양 재배하실 수 있습니다. 이러한 문화의 준비를위한 방법은 잘 구축하고 있으며 설치류의 연결을 문화의 연구 버렸네 형성과 기능의 조절 (뱅커와 고슬린, 1991)에 관련된 유전자와 환경 요인을 식별하는 중요한 역할을했습니다. 인류의 다양한 곤충 뉴런도 문화의 성장 수 있지만, 문화의 기능 시냅스 연결을 형성 표시된 유일한 곤충 뉴런은 Drosophila (Rohrbough 외, 2003)에서 있습니다. Neuroblasts 정의된 미디어 재배 중반 gastrula 단계 Drosophila의 배아는 전기 고르기 및 양식 기능, interneuronal 시냅스 연결 (; 리와오다 1999 년오다, 1995)입니다 뉴런을 일으키다 수확. 시냅스 형성과 우리가 늦은 단계 Drosophila (스와 및오다, 2003)의 머리에서 수확 및 culturing 뉴런이 동영상에 설명된 기술을 개발 성인 행동을 중재에 참여하는 것으로 알려져 뉴런의...

코팅 Coverslips : 60mm 배양 접시에있는 autoclaved coverslips 놔. 절약의 Pipet 5 UL 각 coverslip의 중심에 A / Laminin 믹스. 2 시간 37 C 인큐베이터에 놓습니다. autoclaved 물을 각각 100 UL과 배 coverslips 린스. 멸균 파스퇴르 pipet에 연결된 진공을 사용합니다. 헹굼 마지막 동안, 집게로 coverslip을 선택하고 양면을 건조. 35mm 페트리 접시에 coverslip을 전송합니다. 한달에 최대 상온에서 보관하십시오.

늦은 단계 drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

이 비디오에서는, 우리는 늦은 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 절차는 번데기 형성 후 70-78 시간에 동물의 두뇌의 제거와 함께 시작됩니다. 고립된 두뇌는 혈청이없는 성장 매체에 여러 세척 다음 papain의 짧은 부화 후 표시됩니다. coverslip에 대한 미디어의 5 UL 드롭의 각 두뇌의 기계적 분리의 과정을 그림입니다. 포스트 mitotic의 뉴런의 axons과 dendrites이 분리되는 동안 소마 근처에서 털을 깎으하지만 뉴런은 도금 몇 시간 이내에 프로세스를 생성하기 시작합니다. 이미지 2 일에서 살고 문화를 보여줍니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 주 동안 프로세스를 정교로 진행합니다. 특정의 연결 인구는 같은 GFP 또는 RFP 같은 형광 마커의 조직 구체적인 표현을 드라이브에 GAL4 라인을 사용하는 문화에서 확인할 수 있습니다. 전체 셀 녹음은 교양 뉴런은 기능, 자발적으로 적극적인 cholinergic 및 GABAergic 시냅스를 형성 증명하고있다. 짧은 비디오 세그먼트는 교양 뉴런의 접시에 자발적인 칼슘 과도 및 니코틴 evoked 칼슘 반응을 모니터하기 위해 칼슘 표시기 색소로 Fura - 2를 사용하여 교양 뉴런의 칼슘 역학을 보여줍니다. 이러한 pupal 뇌 문화 유전 및 약리 도구 중앙 시냅스 형성과 기능에 영향을 내장하고 외부 요인을 식별하는 데 사용될 수있는 유용한 모델 시스템입니다.

이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura - 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

본 영상에서는 후기 단계 초파리 번데기의 뇌에서 일차 신경세포 배양물을 준비하는 방법을 시연합니다. 절차는 ...로 시작합니다.

제 이름은 Diana Dowd이며, 이곳 UC Irvine의 해부학 및 신경생물학, 그리고 발달 및 세포생물학과의 교수입니다. 오늘은 Drosophila pupae에서 신경세포 배양물을 준비하는 방법에 대해 설명해 드리겠습니다. 이 과정에는 후기 단계의 pupae에서 뇌를 적출하는 과정이 포함되며, 일반적으로 중앙 뇌 영역만을 배양합니다.이 단계에서 성체 뇌에 존재하는 주요 해부학적 구조들이 이미 형성됩니다. 여기에는 투사 뉴런의 축삭이 버섯체 영역까지 뻗어 있는 촉각엽과, Alpha, beta 및 gamma 엽을 통해 표적 뉴런으로 축삭을 보낸 케니언 세포(Kenyon cells)인 버섯체 뉴런이 포함됩니다. 배양 당일, 가장 먼저 층류 정화 작업대(laminar flow hood)로 이동하여 조직을 해리하는 데 사용할 멸균 효소 용액을 준비합니다.또한 세포 배양에 사용할 배지를 조제합니다. 이는 미리 준비해둔 stock으로 만들어집니다. 다음 단계는 해리 또는 해부를 위해 사용할 pupae를 수집하는 것입니다.그리고 이 작업은 후드 밖에서 진행하는데, 이는 효모와 여러 가지 다른 물질이 포함된 바이알에서 배양되었기 때문입니다. 따라서 해부의 초기 단계는 실제로 후드 밖에서 수행합니다. 이것들은 제가 방금 바이알 벽면에서 떼어낸 유충들이며, 왼쪽 열에 있는 개체들은 눈이 붉은색을 띠고 있어 배양하기에 적절한 단계입니다.이 개체들은 약간 더 어린 PPP들입니다. 이들은 주황색 또는 노란색 눈을 가지고 있으며, 이는 1 0 7 라인입니다. 이 단계에서 눈의 색깔이 조금 더 갈색인 일반 야생형보다 눈의 색이 약간 더 밝습니다.이 모든 단계는 배양, 즉 사람 뇌 배양물을 만드는 데 적합합니다. 우선, 페트리 접시에 꺼내어 정렬해 둔 동공 옆에 해부액을 두 방울 정도 떨어뜨립니다. 저희는 35mm 페트리 접시의 덮개를 사용합니다.그 다음 왼손에는 5번 포셉을, 오른손에는 27게이지 바늘이 장착된 1 CC 투베르쿨린 주사기를 잡습니다. 이 두 가지가 제가 사용하는 해부 도구입니다. 그리고 퓨피(pupi) 또는 퓨필 케이스(pupil case)에서 머리 부분을 제거하기 위해, 왼손의 포셉으로 퓨피를 고정한 뒤 오른손의 바늘을 사용하여 퓨필 케이스의 앞부분을 제거합니다.그 다음 큐티클 덮개를 다시 씌우면 머리가 앞쪽으로 튀어나옵니다. 이때 바늘을 사용하여 목 부위를 절단한 후, 머리를 들어 올려 해부용 식염수 한 방울 속에

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

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전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

이 비디오는 초파리 뇌 신경 줄기 세포의 정지 상태에서 재활성화를 시작하는 외인성 인자를 식별하는 프로토콜을 보여줍니다. 갓 부화한 유충을 해부하여 뇌를 분리한 다음, 신경 줄기 세포의 재활성화 및 증식을 유도하는 호르몬의 잠재력을 평가하기 위해 테스트 호르몬이 있거나 없는 배지에서 배양합니다.

배양된 초파리 뇌 외식에서 신경 줄기세포 재활성화 분석

중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석​​과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

초파리 S2 세포 배양 신경 세포가 생체 내에서 모터 구동 세포 기관 수송의 이미징을위한 좋은 시스템입니다. 여기에서 우리는 두 종류의 세포를 배양에 대한 자신의 이미징 및 교통 분석을 상세한 프로토콜을 설명합니다.

교양있는 세포 기관 전송 초파리 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

이 문서는 성인 Drosophila 에 관통 외상성 뇌 손상을 입히고 결과 신경 발생을 검사하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Drosophila 중앙 두뇌에 있는 성인 신경 발생을 자극하고 분석합니다

배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.

배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화

배우세요 늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 원발성 신경 세포 배양을 준비하는 방법을. 중추 뇌 영역을 배양하여 신경 돌기 성장과 칼슘 이미징을 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 신경 발달 연구에 유용합니다.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

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