Name: 늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 배우세요 늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 원발성 신경 세포 배양을 준비하는 방법을. 중추 뇌 영역을 배양하여 신경 돌기 성장과 칼슘 이미징을 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 신경 발달 연구에 유용합니다.

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이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. 이 작품에 대한 추가 지원은 HHMI 교수 프로그램을 통해 DKOD 지원하는 UC 어바인에 부여에 의해 제공되었다.

culturing의 하루 전에 준비 : <ol><li> 멸균 해부 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 멸균 DMEM 만들기 4 10 ML aliquots에 보관 ° C를 2 주 동안. </li><li> 1 개월 50 또는 100 μl aliquots에 살균 DDM2 보충 및 동결하십시오. </li><li> 코나 / laminin하십시오. </li><li> 외투 coverslips. 옵션 : 최대 4 개월까지 냉동 살균 CNBM하고 저장하십시오. </li></ol> culturing의 날에 나도 층류 흐름 후드의 효소 솔루션 (ES)를 준비 <ol><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브의 솔루션 (DS)를 해부 5 ML 놔. </li><li> 0.6 ML eppendorf에 L - 시스테인의 0.8 MG를 저울질하고 DS 150 μl를 추가합니다. 결정들이 갈 때까지 최대 피펫 아래로. </li><li> DS / 5 ML의 DS에 시스테인 150 ML을 추가하고 잘 섞는다. </li><li> Papain 50 U을 (부대) 추가합니다. </li><li> 0.1 N 나 OH 7 ML을 추가하고 잘 섞는다. Solution은 30 분 이내에 삭제됩니다. 활성화되면. </li><li> 멸균 1.5 ML 스크류 캡 microfuge 관에 0.2 mm의 주사기 필터와 필터 효소 솔루션 Papain : 5 ML의 DS 50 U를 원하십니까. 각 배치는 약간의 차이이므로, 얼마나 계산해야합니다 : 37.3 MG / ML 및 28.3 U / MG 37.3 X 28.3 = 1055.59 U / ML (1000 ML) 50 U = 47.4 ML </li></ol> II. DDM2 미디어 만들기 culturing의 당일 : DDM2를 만들기 위해 다음과 같은 보충제를 추가 DMEM의 10 ML은 culturing 전에 보충제를 추가합니다 : <ol><li> 100μl 트랜스페린 </li><li> 100μl Putrescine </li><li> 100μl 셀레늄 </li><li> 100μl Progesterone </li><li> 50μl 인슐린 </li><li> 10μl 20 Hydroxyecdysone </li></ol> 참고 : 계획 모두 문화 (각 두뇌 개인 35mm 페트리 접시에 하나 coverslip, 1.5 미디어 MS / 문화 도금)에 대한 충분한 DDM2 확인 단계 III - VI는 한 nonsterile 실험실 벤치에있을 수있는 45 분 이내에 완료해야합니다. III. Pupae 콜렉션 <ol><li> 해부 현미경 유리병의 측면 10-15 pupae을 선택합니다. </li><li> 마른 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 플레이스 pupae. </li></ol> 참고 : 우리가 일반적으로 번데기 형성 (APF) 이후 55-78시간 사이 pupae의 두뇌를 사용합니다. neurite 가지의 전반적인 수준이 가장 오래된 pupae에서 약간 낮은 상태에서 머리 캡슐이 붕괴하는 경향 때문에 이것은 젊은 pupae에서 두뇌를 해부하다하는 약간 어렵습니다. 캔턴 - S wildtype 스트레인에서 다음 단계가 다른 작은 안료와 약간 붉은 갈색 빛을 아르 색소 눈이 인정하고 있습니다. IV. 해부 현미경으로 잘린 <ol><li> 플레이스 다음 페트리 접시의 뚜껑에 살균 해부 솔루션의 두 방울은 pupae 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 왼손에 좋은 포셉로 단일 번데기를 개최하고 번데기의 앞쪽에 끝에있는 표피를 제거하려면 오른쪽에있는 1 CC의 주사기에 부착된 27 게이지 주사 바늘을 사용합니다. </li><li> 포셉와 약간 번데기를 당기 머리가 나온다으로 목을 자르다 27 게이지 바늘을 사용합니다. </li><li> 바늘이나 집게의 끝부분으로 솔루션을 해부의 드롭에 머리를 전송할 수 있습니다. </li><li> 당신은 한 방울의 10-15 고개를 때까지 반복합니다. </li></ol> 해부 현미경으로 머리에서 두뇌의 V. 제거 <ol><li> 각 손에 27 게이지 바늘로 1 CC의 주사기를 개최. </li><li> 코 당신과 머리 등의 표면 북쪽에 직면 있도록 솔루션을 해부의 드롭에있는 파리 머리의 위치를​​ 다음을 사용하십시오. </li><li> 머리를 아래로 핀과 등의 표면에 복부에서가는 오른쪽 눈에 슬릿을 수있는 권리 바늘을 사용하는 코에 왼쪽에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 코의 지역 왼쪽 부근 오른쪽 바늘을 삽입하고 오른쪽 눈 속에있는 슬릿 방향으로 머리를 밀고, 부드럽게 왼쪽 눈 위에 표피를 놓으면 왼쪽 바늘을 사용합니다. 두뇌는 종종 광학 이오 모두 상대적으로 그대로, 오른쪽에있는 슬릿에서 등장한다가 없어요 역시 여전히 붙어 때때로 색소 안구 조직. </li><li> 새로운 멸균, 35mm 페트리 접시에 멸균 생리 해부 한 방울로 바늘과 전송의 뒤쪽에 머리를 밀어. </li><li> 각각의 유전자형에 대한 10-15 두뇌를 수집합니다. </li></ol> VI. 광학 엽 (叶)의 제거 및 효소 처리 <ol><li> 각 손에 27 게이지 바늘로 1 CC의 주사기를 잡고 해부 솔루션의 드롭 중 하나를 작은 영역에있는 모든 두뇌를 수집하는 이들을 사용하여 </li><li> 문화 나머지 조직은 중앙 두뇌 지역하므로 각 두뇌의 광 엽 (叶)을 제거하는 도구를 절단과 같은 주사기를 사용합니다. </li><li> 무균 papain 솔루션 1 ML를 포함 eppendorf 튜브에 하나의 유전자형의 모든 두뇌를 전송할 5 μl에서 설정 20 μl pipetman를 사용합니다. </li><li> 뇌는 60 RPM에서 회전 세트 10~15분에 대한 papain에 incubated. </li><li> 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기. </li></ol> 무균 층류 후드 안쪽 - 조직이 공기에 노출되어있는 모든 단계의 나머지 단계에 대한 층류 후드에서 수행되어야합니다. VII. 세탁 <ol><li> 효소 솔루션을 제거하고 멸균 해부 솔루션으로 대체합니다. </li><li> 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 무균 해부 솔루션으로 3 회 총 씻으십시오. </li><li> 해부 생리를 제거하고 DDM2로 바꿉니다. </li><li> 원심 분리기와 DDM2 2 회 총 씻으십시오. </li><li> 멸균 35mm 페트리 접시에 전송 두뇌와 미디어. </li></ol> VIII. 해부 현미경으로 분쇄 및 도금 <ol><li> coverslip의 중심에 DDM2 5 UL 놓습니다. </li><li> 노란 팁과 DDM2이 드롭 1 머리를 전송합니다. </li><li> 현미경, 작은 조각 (&lt;1 분 소요됩니다)에 두뇌를 주사위 27 게이지 바늘을 사용합니다. </li><li> 영상지도 아래, 큰 조각이 부드럽게 pipet의 일각에 빨려하고 중간에 다시 퇴학 수 있도록 좋은 지점으로 뽑아왔다 유리 pipet의 팁을 휴식. 우리는 100 μl 혈소판 모세관 유리 표준으로 입 흡입 튜브를 사용합니다. 참고 : 미디어의 거품을 끌지 않기 위해 조심하고 당신이 경험적으로 사용할 수있는 최고의 크기 pipet을 결정해야합니다. 좋은 사람 당신이 무슨 30초 / 두뇌의 일부 개별 세포도 일부 대형 대단히 짧은 시간과 머리를 떼어 놓다 수 있습니다. 당신은 높은 전력이 볼 때, 뉴런의 약 10~20%는 여전히 남아있는 일부 프로세스를해야하고 여전히 일부 대형 대단히 짧은 시간있을 것입니다. 당신이 너무 많이 떼어 놓다면 모든 세포가 원형되며, 그들은 살아남지 못할 것이다 너무 많은 피해를 입었됩니다. 이 단계는 연습이 필요하고 신속하게 변경할 수있는 큰 표면 대 부피 비율과 DDM2의 드롭의 osmolality과 산도가 있기 때문에 신속하게 할 수 있어야합니다. 조직 최대한 빨리 CO 2 배양기에 배치해야합니다. </li><li> &quot;유전자형, 날짜 및 시간&quot;페트리 접시의 뚜껑에 작성합니다. </li><li> 100mm 배양 접시에있는 35mm 페트리 접시를 (서부 유럽 표준시 kimwipe)를 넣어 30 분 CO 2 배양기에서 쉬라 구. </li><li> DDM2 1.5 ML로 35mm의 요리를 홍수. </li><li> 5% CO 2 배양기 (23 ° C)에서 보육의 문화를 유지. 참고 : 냉각 CO 2 배양기에 액세스할 수없는 경우, 표준 포유류의 조직 문화 배양기를 사용하고 중 23 시원한 공간과 더위에 넣어 ° C, 또는 실험실에 넣어 온도를 해제하고 사용 주변 주위 온도를 조절하기 위해 보육의 하단 트레이에 얼음. </li></ol> IX. 수유 셀 <ol><li> CNBM/B27 : 1 일 (다음날)에서 3시 1분 DDM2를 만들기 위해 CNBM/B27 0.5 ML (에어컨 미디어)를 추가합니다. </li><li> CNBM/B27 : 데이에 5 3시 1분 DDM2 미디어 1 ML를 교체하십시오. </li><li> CNBM/B27 모든 4-5일 : 3시 1분 DDM2와 함께 먹이를 세포 보관하십시오. 참고 : 문화가 아닌 시설의 연결 매체없이 재배하지만 뉴런 좀 더 깨지기 쉬운 표시 및 전기 생리학 실험에 사용하기 위해 더 어렵다 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

그들이 neurites을 확장하고 기능적인 시냅스 연결을 형성 어디 배아 / 출생 후의 설치류 동물의 두뇌에서 수확 뉴런은 기본 세포 배양 재배하실 수 있습니다. 이러한 문화의 준비를위한 방법은 잘 구축하고 있으며 설치류의 연결을 문화의 연구 버렸네 형성과 기능의 조절 (뱅커와 고슬린, 1991)에 관련된 유전자와 환경 요인을 식별하는 중요한 역할을했습니다. 인류의 다양한 곤충 뉴런도 문화의 성장 수 있지만, 문화의 기능 시냅스 연결을 형성 표시된 유일한 곤충 뉴런은 Drosophila (Rohrbough 외, 2003)에서 있습니다. Neuroblasts 정의된 미디어 재배 중반 gastrula 단계 Drosophila의 배아는 전기 고르기 및 양식 기능, interneuronal 시냅스 연결 (; 리와오다 1999 년오다, 1995)입니다 뉴런을 일으키다 수확. 시냅스 형성과 우리가 늦은 단계 Drosophila (스와 및오다, 2003)의 머리에서 수확 및 culturing 뉴런이 동영상에 설명된 기술을 개발 성인 행동을 중재에 참여하는 것으로 알려져 뉴런의...

코팅 Coverslips : 60mm 배양 접시에있는 autoclaved coverslips 놔. 절약의 Pipet 5 UL 각 coverslip의 중심에 A / Laminin 믹스. 2 시간 37 C 인큐베이터에 놓습니다. autoclaved 물을 각각 100 UL과 배 coverslips 린스. 멸균 파스퇴르 pipet에 연결된 진공을 사용합니다. 헹굼 마지막 동안, 집게로 coverslip을 선택하고 양면을 건조. 35mm 페트리 접시에 coverslip을 전송합니다. 한달에 최대 상온에서 보관하십시오.

늦은 단계 drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

이 비디오에서는, 우리는 늦은 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 절차는 번데기 형성 후 70-78 시간에 동물의 두뇌의 제거와 함께 시작됩니다. 고립된 두뇌는 혈청이없는 성장 매체에 여러 세척 다음 papain의 짧은 부화 후 표시됩니다. coverslip에 대한 미디어의 5 UL 드롭의 각 두뇌의 기계적 분리의 과정을 그림입니다. 포스트 mitotic의 뉴런의 axons과 dendrites이 분리되는 동안 소마 근처에서 털을 깎으하지만 뉴런은 도금 몇 시간 이내에 프로세스를 생성하기 시작합니다. 이미지 2 일에서 살고 문화를 보여줍니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 주 동안 프로세스를 정교로 진행합니다. 특정의 연결 인구는 같은 GFP 또는 RFP 같은 형광 마커의 조직 구체적인 표현을 드라이브에 GAL4 라인을 사용하는 문화에서 확인할 수 있습니다. 전체 셀 녹음은 교양 뉴런은 기능, 자발적으로 적극적인 cholinergic 및 GABAergic 시냅스를 형성 증명하고있다. 짧은 비디오 세그먼트는 교양 뉴런의 접시에 자발적인 칼슘 과도 및 니코틴 evoked 칼슘 반응을 모니터하기 위해 칼슘 표시기 색소로 Fura - 2를 사용하여 교양 뉴런의 칼슘 역학을 보여줍니다. 이러한 pupal 뇌 문화 유전 및 약리 도구 중앙 시냅스 형성과 기능에 영향을 내장하고 외부 요인을 식별하는 데 사용될 수있는 유용한 모델 시스템입니다.

이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura - 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

본 영상에서는 후기 단계 초파리 번데기의 뇌에서 일차 신경세포 배양물을 준비하는 방법을 시연합니다. 절차는 ...로 시작합니다.

제 이름은 Diana Dowd이며, 이곳 UC Irvine의 해부학 및 신경생물학, 그리고 발달 및 세포생물학과의 교수입니다. 오늘은 Drosophila pupae에서 신경세포 배양물을 준비하는 방법에 대해 설명해 드리겠습니다. 이 과정에는 후기 단계의 pupae에서 뇌를 적출하는 과정이 포함되며, 일반적으로 중앙 뇌 영역만을 배양합니다.이 단계에서 성체 뇌에 존재하는 주요 해부학적 구조들이 이미 형성됩니다. 여기에는 투사 뉴런의 축삭이 버섯체 영역까지 뻗어 있는 촉각엽과, Alpha, beta 및 gamma 엽을 통해 표적 뉴런으로 축삭을 보낸 케니언 세포(Kenyon cells)인 버섯체 뉴런이 포함됩니다. 배양 당일, 가장 먼저 층류 정화 작업대(laminar flow hood)로 이동하여 조직을 해리하는 데 사용할 멸균 효소 용액을 준비합니다.또한 세포 배양에 사용할 배지를 조제합니다. 이는 미리 준비해둔 stock으로 만들어집니다. 다음 단계는 해리 또는 해부를 위해 사용할 pupae를 수집하는 것입니다.그리고 이 작업은 후드 밖에서 진행하는데, 이는 효모와 여러 가지 다른 물질이 포함된 바이알에서 배양되었기 때문입니다. 따라서 해부의 초기 단계는 실제로 후드 밖에서 수행합니다. 이것들은 제가 방금 바이알 벽면에서 떼어낸 유충들이며, 왼쪽 열에 있는 개체들은 눈이 붉은색을 띠고 있어 배양하기에 적절한 단계입니다.이 개체들은 약간 더 어린 PPP들입니다. 이들은 주황색 또는 노란색 눈을 가지고 있으며, 이는 1 0 7 라인입니다. 이 단계에서 눈의 색깔이 조금 더 갈색인 일반 야생형보다 눈의 색이 약간 더 밝습니다.이 모든 단계는 배양, 즉 사람 뇌 배양물을 만드는 데 적합합니다. 우선, 페트리 접시에 꺼내어 정렬해 둔 동공 옆에 해부액을 두 방울 정도 떨어뜨립니다. 저희는 35mm 페트리 접시의 덮개를 사용합니다.그 다음 왼손에는 5번 포셉을, 오른손에는 27게이지 바늘이 장착된 1 CC 투베르쿨린 주사기를 잡습니다. 이 두 가지가 제가 사용하는 해부 도구입니다. 그리고 퓨피(pupi) 또는 퓨필 케이스(pupil case)에서 머리 부분을 제거하기 위해, 왼손의 포셉으로 퓨피를 고정한 뒤 오른손의 바늘을 사용하여 퓨필 케이스의 앞부분을 제거합니다.그 다음 큐티클 덮개를 다시 씌우면 머리가 앞쪽으로 튀어나옵니다. 이때 바늘을 사용하여 목 부위를 절단한 후, 머리를 들어 올려 해부용 식염수 한 방울 속에 넣습니다. 양질의 배양물을 만들기 위해 각 유전자형당 10~15마리의 개체가 필요하므로, 이 과정을 10~15회 반복합니다.이제 동물의 머리에서 뇌를 제거하겠습니다. 이를 위해 27 gauge 바늘이 장착된 투베르쿨린 주사기 두 개를 사용합니다. 왼쪽 바늘을 동물의 psis를 통해 꽂아 머리를 페트리 접시 바닥에 고정합니다.그런 다음 오른쪽 바늘을 사용하여 우측에 절개창을 만들며, 이곳을 통해 뇌를 밀어낼 것입니다. 이제 다음 단계로 왼쪽 바늘을 왼쪽 눈 위에 놓습니다. 그리고 이제 실제로 밀어내면 뇌가 오른쪽의 절개창을 통해 밖으로 나오게 됩니다.이제 나타났습니다. 오른쪽에 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이제 오른쪽 바늘을 사용하여 이를 머리 캡슐의 나머지 부분 및 눈과 분리하겠습니다. 좋습니다. 이제 시각엽을 제거하는 최종 해부를 수행하기 전, 뇌를 깨끗한 식염수 방울로 옮깁니다.피펫맨을 사용하여 이를 수행할 수 있는데, 20 µL 피펫맨의 팁 끝부분으로 뇌를 집어 올린 후 5 µL로 설정하여 사용하거나, 바늘로 직접 옮길 수도 있습니다. 이것이 해부 절차의 마지막 단계입니다. 이 작업은 신선한 식염수 방울 내에서 이루어지며, 일반적으로 여기에는 약 10~15개의 뇌가 들어있게 됩니다.그런 다음 27 gauge 바늘을 절단 도구로 사용하여 각각의 시각엽을 제거하며, 각 뇌의 왼쪽 시각엽을 절단한 후 오른쪽 시각엽을 절단합니다. 이 단계에서 이렇게 처리된 모든 뇌는 효소 분해에 사용될 효소 용액이 들어 있는 튜브로 옮겨집니다. 단일 유전자형의 모든 뇌는 1 mL의 효소 용액이 들어 있는 단일 epi screw cap einor 튜브에 넣습니다.그런 다음 시험관 홀더에 넣고 회전 혼합기에 배치하여 상온에서 10분에서 15분 동안 유지합니다. 이것이 실제 해리 시간입니다. 효소 해리 단계를 완료하려면 실제로 효소를 제거해야 합니다.이제 튜브를 EOR 원심분리기로 옮겨 원심분리기에 넣고, 3000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 뇌 조직을 원심분리한 후, 이를 층류 후드(laminar flow hood)로 옮깁니다. 여기서부터 절차의 멸균 단계가 시작됩니다.이제 층류 후드 내에 있을 때만 튜브를 열며, 효소 용액을 제거하겠습니다. 이를 해부 용액으로 교체한 후, 해부 용액과 세포 배양에 사용하는 Defined medium을 사용하여 여러 번 원심분리와 세척을 반복하겠습니다. 좋습니다.먼저 각 페트리 접시에 들어있는 커버슬립 위에 생리식염수 5 µL 한 방울을 떨어뜨려야 합니다. 페트리 접시당 하나의 커버슬립이 들어 있으며, 이는 라미닌으로 코팅되어 있습니다. 따라서 커버슬립 정중앙에 5 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 그곳이 라미닌이 처리된 지점입니다.뇌 하나당 약 10,000개의 세포를 얻어 단일 배양을 진행하므로, 세포를 시야의 정중앙에 농축시키는 것이 매우 중요합니다. 이제 현미경으로 살펴보면, 여기 효소 해리 과정을 이미 거친 9개의 뇌가 있습니다. 보시다시피 여전히 거의 온전한 상태입니다.이들은 시엽(optic lobes)이 없습니다. 시엽은 제거되었으며, 현재 중앙 뇌 영역만 남아 있습니다. 이제 피펫으로 뇌 하나를 빨아들여 커버슬립 위의 5 µL 방울로 옮기겠습니다. 이 과정을 총 4회 반복합니다.27 gauge 바늘을 장착한 1 CC 주사기 두 개를 준비합니다. 다시 한번 강조하지만, 이것들은 매우 저렴한 일회용 해부 도구이므로 학부생들도 예산 걱정 없이 실험을 수행할 수 있습니다. 이제 두 개의 바늘을 사용하여 일차적인 기계적 해리를 진행하겠습니다. 뇌를 여러 조각으로 자르는 과정이며, 이렇게 하면 잠시 후 최종 해리를 완료하기 위해 유리 피펫으로 이 조각들을 흡입할 수 있습니다.이 과정을 수행할 때, 조직을 아주 작은 조각으로 완전히 분쇄하지는 않고, 전체적인 크기를 줄여서 해리 과정에서 피펫으로 흡입할 때 전체 뇌보다는 약간 더 작은 조각들이 올라올 수 있도록 합니다. 또한, 배지 방울의 크기가 작기 때문에 이 작업을 비교적 빠르게 진행해야 합니다. 이는 표면적 대비 부피 비율이 높다는 것을 의미하며, 용액을 오랫동안 방치할 경우 용액의 pH와 삼투압이 모두 변할 수 있기 때문입니다.처음 이 작업을 수행했을 때는 한 번에 뇌 두 개, 배양 두 개만 실제로 진행했습니다. 지금은 보통 네 개를 진행하는데, 이제 피펫을 망가뜨릴 것 같지만 이에 대해 이야기하거나 그럴 수는 없겠죠? 이 것은 방금 마쳤습니다.해리 과정에서 피펫의 크기가 매우 적절했습니다. 조직을 흡입하여 몇 번 위아래로 피펫팅할 수 있었으며, 개별 세포들을 확인할 수 있습니다. 아직 덩어리들이 남아있지만, 이는 괜찮으며 세척 과정에서 제거될 것입니다.이제 배양물을 플레이팅하는 즉시 두 번째 페트리 접시에 넣고, pH와 삼투압을 생존 가능한 수준으로 유지하기 위해 수 분 이내에 CO2 배양기에 넣습니다. 그다음 접시에 용액을 채우기 전까지 이곳에서 30분 동안 유지합니다. 이 배양물들은 후기 단계 번데기의 뇌를 이용하여 준비되었습니다.배양물은 CO2 인큐베이터에서 이틀 동안 배양되었으며, 돌기가 확장된 개별 세포들을 확인할 수 있습니다. 돌기의 정교함 정도는 5일 차에 관찰되는 것보다는 낮고 1일 차에 관찰되는 것보다는 높습니다. 제 이름은 Jorge Ano입니다.저는 Doubts 연구실에서 근무하고 있습니다. 방금 준비한 pupil 배양액에서 칼슘 이미징 실험을 수행하는 방법을 지금부터 보여드리겠습니다. 이것은 칼슘 이미징 실험 영상으로, 파란색 세포는 낮은 칼슘 수치를, 빨간색 세포는 높은 칼슘 수치를 나타냅니다.일부 세포가 붉은색으로 변하는 것을 볼 수 있는데, 이는 세포 내 칼슘 수치가 증가하고 있음을 나타냅니다. 이러한 현상은 자발적이며 일시적입니다. 시간이 지나면 다시 기저 칼슘 수치로 돌아가며, 잠시 후 니코틴과 같은 약물을 처리하면 세포 내 칼슘 수치가 증가하는 것을 확인하실 수 있습니다.니코틴을 100초 동안 처리한 후, 니코틴을 제거하면 세포가 기저 칼슘 수준으로 돌아갑니다. 이 배양 시스템의 진정한 장점은 형광 단백질(GFP)로 서로 다른 신경세포 하위 집단이 표지된 초파리의 형질전환 및 돌연변이 라인 모두를 이용해 배양할 수 있다는 점입니다. 이것은 우리가 사용한 라인 중 하나에서 추출한 뇌로, 학습과 기억을 포함한 복잡한 행동을 매개하는 신경세포인 버섯체(mushroom body)의 케니안 세포(Kenyon cells)에서 GFP가 발현되었습니다.세포체는 빨간색 화살표가 표시된 영역 주변인 뇌의 등쪽 측면에 위치합니다. 그리고 GFP 양성을 띠는 이 L자형 구조들은 실제로 이 버섯체 Kenyon 세포로부터 뻗어 나온 축삭 돌기입니다. 이 뇌 조직을 해리한 후의 모습입니다.뉴런은 배양 상태에서 돌기를 재생하며, 이 경우 GFP 양성 Kenyan 세포를 쉽게 식별할 수 있습니다. 이러한 세포들은 표준 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징 연구 모두에 활용 가능합니다. 따라서 이러한 배양 시스템은 성체 동물에서 복잡한 행동을 매개하는 것으로 알려진 뉴런의 기능을 조절하는 데 중요한 유전적 및 환경적 요인을 탐구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

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