Name: Metagenomic 도서관 대규모 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: 학습하세요 메타게놈 라이브러리의 대규모 식별 방법을 로봇을 활용하여 닐론 필터에 10,000개의 콜로니를 정확하게 배양하는 기술입니다. 이 방법은 미생물 군집 연구와 게놈 과학 발전에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 하이브 리다이 제이션 절차 하나의 하이브리드화 관은 1 또는 2 세포막을 (22cm로 크기가 22) 소요됩니다. 하이브 리다이 제이션 혼합물의 50 ML 및 하이브리드화 관 당 DNA 프로브 (10 NG / ML 최종 농도) 0.5 MG를 사용하십시오. 최상의 결과를 얻으려면, 프로브로 젤 - 정화 DNA를 사용합니다. 프로브 준비 최대 배율 경우, 튜브의 개수보다는 튜브 당 시약의 양을 증가를 향상시킬 수 있습니다. 프로브 준비 (0.5 MG DNA) : <ol><li> 물 60 μl와 가교제 용액 15 μl를 희석. </li><li> DNA 10 NG / 나사 덮인 microtube에 50 μl 전체 볼륨에 물을 μl를 희석. </li><li> 끓는 물에 5 분 변성의 DNA. </li><li> 신속하게 얼음을 전송하고 5 분 식지. 간단히 스핀. </li><li> 반응 완충액 50 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 시약 라벨 10 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 1 단계의 희석 가교제 용액 50 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. 부드럽게 소용돌이와 짧게 스핀. </li><li> 37 ° C 30 분 알을 품다. </li><li> 최대 2 H 위해 얼음에 보관 또는 -20 ° C. 100 %의 글리세롤과 저장소의 동일한 음량을 추가 참고 : 키트와 함께 제공된 물을 사용하십시오. 달리 명시되지 않는 한 얼음의 모든 시약 보관하십시오. </li></ol> 막 준비와 하이브리드화 <ol><li> 60 하이브 리다이 제이션 버퍼와 하이브리드화 관 앞서 열을 가하다 50 ML은 ° C. </li><li> 하이브리드화 튜브에 하이브리드화 버퍼를 추가합니다. 멤브레인 (S)을 올리고 하이브리드화 튜브에 추가합니다. (튜브 당 두 세포막, 완벽 한 멤브레인 첫번째 롤을 추가한다면, 같은 방향으로 상단에있는 다른 멤브레인을 롤.) </li><li> 60 하이브 리다이 제이션 튜브를 품어 ° 이상에 대한 C ½ H. (멤브레인 (S)가 완전히 젖었을 확인하십시오.) </li><li> 하이브 리다이 제이션 관에서 라벨 프로브를 포함하는 튜브에 긴 피펫과 하이브리드화 버퍼의 약 1 ML을 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 짧게 스핀. 하이브 리다이 제이션 튜브로 혼합물을 전송합니다. </li><li> ° C 하루 60 알을 품다. 참고 : 사용 포셉 및 장갑 세포막을 취급. 하이브리드화 튜브의 혼합 내용을 부드럽게하기 때문에 너무 많은 동요가 원하지 않는 거품의 영구적인 형성을 초래하게됩니다. 세포막은 서부 유럽 표준시 조건에 추가되어야, 하이브 리다이 제이션 버퍼 또는 물 필요한 경우에 담그다 및 추가하기 전에 여분의 액체를 배수. </li></ol> 2. 검색 절차 워싱 세포막 <ol><li> 60 ° C.에 앞서 열을 가하다 주 세척 버퍼 (전자렌지 및 / 또는 열판을 사용합니다.) </li><li> 한 하이브리드화 튜브 2 점막이있다면, 깨끗하고, preheated, 빈 하이브리드화 관 한 멤브레인을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 간단히 차 세척 버퍼의 약 50 ML과 하이브리드화 튜브를 헹굴. </li><li> 60 하이브리드화 튜브와 부화 ° 10 분 C로 기본 세척 버퍼의 약 100 ML을 추가합니다. </li><li> 3, 4 단계를 반복합니다. </li><li> 5 분 실온에서 차 세척 버퍼 최소한 250 ML과 컨테이너와 부화를 세탁하기 위해 막을 전송. </li><li> 6 단계를 반복합니다. 참고 : 점막이 신호 생성하기 전에 ½ H로 최대 상온에서 보조 씻어 버퍼에 보관 수 있습니다. </li></ol> 신호 생성 및 검출 (한 막 절차) <ol><li> 탁상에 SaranWrap 평면의 테이프 두 조각 (2 단계에 대해 하나와 4 단계에 대해 하나). </li><li> 조심스럽게 용기의 측면에 대한 막의 모서리를 만져 멤브레인에서 여분의 버퍼를 분출과 SaranWrap (최대 샘플 사이드)에 멤브레인를 전송합니다. </li><li> 막 이상의 막, 접이식 비닐랩을 통해 ECF 시약의 6-7 ML 하거라. 조심스럽게 부드럽게 SaranWrap 통해 Kimwipe를 이동하여 막 이상 ECF 시약을 배포합니다. 5 분 알을 품다. </li><li> 멤브레인에서 초과 ECF 시약을 드레인과 새로운 SaranWrap, 멤브레인 위에 접어 버리고,에 그것을 전송하고 테이프로 가장자리를 밀봉. 알루미늄 호일로 멤브레인 표지. 1-2시간을위한 부화. </li><li> 유리 접시 이상의 ECF 시약 1-2 ML을 배포하여 스캐너 유리 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 유리 플레이트 (아래 샘플 사이드)에 멤브레인를 전송하고 멤브레인 이상 ECF 시약의 또 다른 1-2 ML을 배포합니다. SaranWrap와 오버레이 조심스럽게 거리 멤브레인에서 공기 방울을 밀어. (당신은 유리 플레이트에 대한 누르면 막을 유지 SaranWrap 위에 성실히 접시를 배치할 수 있습니다.) </li><li> 여기 473 NM, 탐지 필터 LPB (510 NM), 해상도 50 μm의, 16 비트 신호를 졸업, CH1 400 V. (스캔 다음 설정으로 후지 FLA - 5100 형광 스캐너 ( &quot;1 레이저 한 이미지&quot;모드)를 사용 22cm의 크기는 22 멤브레인 당 약 15-20 분 정도 소요됩니다.) 옵션 : </li><li> 2~4시간 (이상)에 앉아 보자. </li><li> 6 단계 같이 스캔 반복합니다. </li></ol> 3. (NUF 버전) 스트립과 절차를 저장할 <ol><li> 백퍼센트 동부 표준시로 막을 전송부드러운 교반 10 분 실온에서 hanol와 부화. </li><li> 신선한 100 % 에탄올로 대체하고 실온에서 하룻밤 품어. (분리막은 며칠 동안 에탄올에 남아있을 수 있습니다.) </li><li> 증류수와 에탄올로 교체 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> SDS (최종 0.5 % SDS) 하이브리드화 튜브 100 ML 물 10 % 5 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다. 멤브레인를 추가합니다. </li><li> 80 ° C 1 H.위한 부화 </li><li> 깨끗한 빈 컨테이너로 막은을 전송. </li><li> 10% SDS 500 ML 물 5 ML (최종 0.1 % SDS)을 전자렌지에 활발한 끓일 수있는 비커와 열을 추가합니다. </li><li> 멤브레인 위에 가까운 끓는 0.1 % SDS 용액을 붓고 부드럽게 몇 분 동안 선동. 실온으로 냉각하도록 허용합니다. </li><li> 적어도 10 분 멸균 100 MM 트리스 산도 8 적어도 250 ML에 씻어. </li><li> 랩 SaranWrap에 막과 테이프로 조심스럽게 닫습니다 가장자리. 4 스토어 ° C. (세포막 밖으로 건조 절대 필요합니다.) </li></ol>

스트립 절차는 최적화되지 않았습니다. 그러나, 제조 업체의 지침 (2 세척 각각 100 % 에탄올에 10 분, 60 ° C 0.5 %의 SDS 1 H 1 씻어)에 주어진 스트립 절차가 부족합니다. 100 % 에탄올에 적어도 하룻밤 배양은 ECF의 반응 생성물을 분해하는 데 필요한, ​​100 % 에탄올에 며칠 보육은 막을 reprobe 수있는 능력에 아무런 악영향이없는 것으로 나타납니다. 제조 업체의 SDS 치료도 부족 것으로 보인다. NUF 80 1 H를 시도했다 ° C 0.5 % SDS는 성공에 가까운 끓는 0.1 % SDS 한 치료를 다음과. 트레이시 한 시간이 거의 끓는 0.1 % SDS로 오버 붓는 것은 충분 것으로 나타났습니다. 유용한 힌트 : 하이브 리다이 제이션 버퍼, 하이브리드화 튜브, 세척 및 기본 버퍼는 60 preheated해야 ° C 사전을 사용하고, 실험을하는 동안 그 온도에서 보관해야합니다. 예를 들어, 포장되어 온도계와 열판에 버퍼를 유지, 코닝 열판, 60 약 3 결과의 설정 ° C.에

metagenomic 도서관 대규모 화면

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

이전 경작하지 않고 미생물의 게놈 시퀀스의 연속 Metagenomic 라이브러리 아카이브 큰 조각. metagenomic 라이브러리를 생성하고 검사를위한 간소화된 절차를 생성하는 것은 미개한 미생물 assemblages의 유전과 신진 대사 특성에 효율적으로 높은 처리량을 수사 따라서 유용합니다. 여기, 주요 프로토콜은 우리가 정확하게 교대 로봇 계측과 (인간) 수동 개입에 따라 긴 프로세스를 설명하기위한 가장 유용한 형식입니다 제안 비디오에 제공됩니다. 첫째, 우리는 스물네 384 자 도서관 접시에서 중복 식민지를 포함할 수 있습니다 각각의 고밀도 macroarray의 점막에 라이브러리 클론을 지점으로 로봇을 고용. 자동화는 또한 매우 치밀한 공간 준비로 도서관 클론의 다수에 맞게 필요한 규모의 소형화에 의해뿐만 아니라 정확성과 속도에 대해이 절차를 위해 필수적입니다,하지만. 일단 생성, 우리는 다음 macroarray의 점막이 프로브 라벨, 멤브레인 하이브리드화, 및 신호 감지를위한 표준 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 관심있는 유전자에 대한 검사를 할 수있는 방법을 보여주었다. 우리는 비디오와 함께 온라인으로 제공되는 모든하는 상세한 서면 관련된 단계에 대한 설명과 필요한 자료와 절차의 시각 데모를 보완.

Metagenomic 도서관 대규모 화면

메타게놈 라이브러리는 사전 배양 없이도 미생물로부터 유래한 연속적인 게놈 서열의 거대 단편들을 보관합니다. ...을 생성하는 것은

여기서 우리의 목표는 이러한 메타게놈 라이브러리의 콜로니를 멤브레인 필터에 접종하는 것이며, 각 필터에는 10,000개의 콜로니를 수용할 수 있습니다. 현재 하고 있는 작업은 이 나일론 필터를 블록 위에 올려놓고 평평하게 펴는 것입니다. 필터는 약간의 액체에 잠겨 있는데, 이는 단순히 배양 배지인 luria broth입니다.그런 다음 연구자는 습윤 처리된 이 막을 로봇으로 옮길 것이며, 로봇은 이 막에 10,000개의 콜로니를 자동으로 접종하게 됩니다. 이러한 절차에는 로봇 공학이 필수적인데, 10,000개의 콜로니를 하나의 막에 점적할 수 있는 인내심이나 정확성을 가진 사람은 사실상 없기 때문입니다. 로봇은 매우 반복적이고 미세한 공간적 규모의 작업을 높은 정확도로 수행할 수 있게 함으로써 유전체 과학을 실제로 발전시킨 요소 중 하나입니다.현재 로봇이 이 3개의 84웰 플레이트를 처리하도록 설정하는 중입니다. 이 3개의 84웰 플레이트의 각 웰에는 메타게놈 라이브러리에서 유래한 개별 콜로니가 들어 있습니다. 현재 로봇은 멤브레인에 스폿팅하는 데 사용할 접종 바늘을 멸균하고 있습니다. 바늘은 70% ethanol을 포함하여 여러 가지 용액을 거치며 멸균되며, 그 후 접종 바늘이 모든 콜로니가 담긴 3 84웰 플레이트에 담기게 됩니다.현재 빛을 이용해 멸균 및 건조가 진행되고 있습니다. 접종 바늘이 건조되면 로봇을 통해 플레이트가 공급됩니다. 각 콜로니는 실제로 블롯팅되어 복제되며, 이는 대조군으로서 도움이 됩니다.따라서 하이브리다이제이션 신호를 나타내는 동일한 두 개의 콜로니를 찾는 것입니다. 모든 콜로니를 필터에 스팟팅한 후, 여기 보이는 아가로스 플레이트에 다시 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.각 콜로니가 성장하게 되며, 화면의 어레이에서 필터 위에 10,000개의 콜로니가 형성된 것을 볼 수 있습니다. 물론 이러한 각 콜로니에는 재조합 DNA, 즉 이 경우에는 메타게놈 DNA의 수많은 복제본이 포함되어 있습니다. 이것은 우리가 제작한 중북태평양 해양 유래 샘플입니다.Saltram이 다음에 수행할 작업은 해당 멤브레인을 일련의 용액으로 옮기는 것입니다. 처음으로 옮기는 용액은 수산화나트륨 기본 용액이며, 이는 콜로니를 용해시킵니다. 기본적으로 세포벽을 녹여 DNA를 유리시킴으로써 DNA가 필터에 접촉할 수 있게 합니다.따라서 여기서는 해당 콜로니 내 모든 박테리아의 세포벽이 용해되어 DNA가

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

출처: Kim, H. 외, 고처리량 유전효소 스크리닝 시스템을 이용한 다효소 스크리닝. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 메타게놈 포스미드 라이브러리와 염색 기질을 이용한 효소 발현을 검출하는 유전적 스크리닝 방법을 시연합니다. 유세포분석은 색소 생성물을 생성하는 단일 세포를 식별하고 분리하여 활성 효소 발현 세포의 고처리량 선택을 가능하게 합니다.

유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

메타유전체학(Metagenomics)을 사용하여 사일리지 소 사료의 마이크로바이옴을 조사했습니다. 분석은 샷건 염기서열분석(shotgun sequencing)으로 수행하였다. 이 접근법은 소 사료 내 미생물 군집의 구성을 특성화하는 데 사용되었습니다.

목초의 군 유전체학 분석

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 메타게놈 라이브러리의 대규모 식별 방법을 로봇을 활용하여 닐론 필터에 10,000개의 콜로니를 정확하게 배양하는 기술입니다. 이 방법은 미생물 군집 연구와 게놈 과학 발전에 필수적입니다.

Metagenomic 도서관 대규모 화면

더 많은 동영상 탐색