Name: Metagenomic 도서관 대규모 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: 학습하세요 메타게놈 라이브러리의 대규모 식별 방법을 로봇을 활용하여 닐론 필터에 10,000개의 콜로니를 정확하게 배양하는 기술입니다. 이 방법은 미생물 군집 연구와 게놈 과학 발전에 필수적입니다.

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1. 하이브 리다이 제이션 절차 하나의 하이브리드화 관은 1 또는 2 세포막을 (22cm로 크기가 22) 소요됩니다. 하이브 리다이 제이션 혼합물의 50 ML 및 하이브리드화 관 당 DNA 프로브 (10 NG / ML 최종 농도) 0.5 MG를 사용하십시오. 최상의 결과를 얻으려면, 프로브로 젤 - 정화 DNA를 사용합니다. 프로브 준비 최대 배율 경우, 튜브의 개수보다는 튜브 당 시약의 양을 증가를 향상시킬 수 있습니다. 프로브 준비 (0.5 MG DNA) : <ol><li> 물 60 μl와 가교제 용액 15 μl를 희석. </li><li> DNA 10 NG / 나사 덮인 microtube에 50 μl 전체 볼륨에 물을 μl를 희석. </li><li> 끓는 물에 5 분 변성의 DNA. </li><li> 신속하게 얼음을 전송하고 5 분 식지. 간단히 스핀. </li><li> 반응 완충액 50 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 시약 라벨 10 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 1 단계의 희석 가교제 용액 50 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. 부드럽게 소용돌이와 짧게 스핀. </li><li> 37 ° C 30 분 알을 품다. </li><li> 최대 2 H 위해 얼음에 보관 또는 -20 ° C. 100 %의 글리세롤과 저장소의 동일한 음량을 추가 참고 : 키트와 함께 제공된 물을 사용하십시오. 달리 명시되지 않는 한 얼음의 모든 시약 보관하십시오. </li></ol> 막 준비와 하이브리드화 <ol><li> 60 하이브 리다이 제이션 버퍼와 하이브리드화 관 앞서 열을 가하다 50 ML은 ° C. </li><li> 하이브리드화 튜브에 하이브리드화 버퍼를 추가합니다. 멤브레인 (S)을 올리고 하이브리드화 튜브에 추가합니다. (튜브 당 두 세포막, 완벽 한 멤브레인 첫번째 롤을 추가한다면, 같은 방향으로 상단에있는 다른 멤브레인을 롤.) </li><li> 60 하이브 리다이 제이션 튜브를 품어 ° 이상에 대한 C ½ H. (멤브레인 (S)가 완전히 젖었을 확인하십시오.) </li><li> 하이브 리다이 제이션 관에서 라벨 프로브를 포함하는 튜브에 긴 피펫과 하이브리드화 버퍼의 약 1 ML을 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 짧게 스핀. 하이브 리다이 제이션 튜브로 혼합물을 전송합니다. </li><li> ° C 하루 60 알을 품다. 참고 : 사용 포셉 및 장갑 세포막을 취급. 하이브리드화 튜브의 혼합 내용을 부드럽게하기 때문에 너무 많은 동요가 원하지 않는 거품의 영구적인 형성을 초래하게됩니다. 세포막은 서부 유럽 표준시 조건에 추가되어야, 하이브 리다이 제이션 버퍼 또는 물 필요한 경우에 담그다 및 추가하기 전에 여분의 액체를 배수. </li></ol> 2. 검색 절차 워싱 세포막 <ol><li> 60 ° C.에 앞서 열을 가하다 주 세척 버퍼 (전자렌지 및 / 또는 열판을 사용합니다.) </li><li> 한 하이브리드화 튜브 2 점막이있다면, 깨끗하고, preheated, 빈 하이브리드화 관 한 멤브레인을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 간단히 차 세척 버퍼의 약 50 ML과 하이브리드화 튜브를 헹굴. </li><li> 60 하이브리드화 튜브와 부화 ° 10 분 C로 기본 세척 버퍼의 약 100 ML을 추가합니다. </li><li> 3, 4 단계를 반복합니다. </li><li> 5 분 실온에서 차 세척 버퍼 최소한 250 ML과 컨테이너와 부화를 세탁하기 위해 막을 전송. </li><li> 6 단계를 반복합니다. 참고 : 점막이 신호 생성하기 전에 ½ H로 최대 상온에서 보조 씻어 버퍼에 보관 수 있습니다. </li></ol> 신호 생성 및 검출 (한 막 절차) <ol><li> 탁상에 SaranWrap 평면의 테이프 두 조각 (2 단계에 대해 하나와 4 단계에 대해 하나). </li><li> 조심스럽게 용기의 측면에 대한 막의 모서리를 만져 멤브레인에서 여분의 버퍼를 분출과 SaranWrap (최대 샘플 사이드)에 멤브레인를 전송합니다. </li><li> 막 이상의 막, 접이식 비닐랩을 통해 ECF 시약의 6-7 ML 하거라. 조심스럽게 부드럽게 SaranWrap 통해 Kimwipe를 이동하여 막 이상 ECF 시약을 배포합니다. 5 분 알을 품다. </li><li> 멤브레인에서 초과 ECF 시약을 드레인과 새로운 SaranWrap, 멤브레인 위에 접어 버리고,에 그것을 전송하고 테이프로 가장자리를 밀봉. 알루미늄 호일로 멤브레인 표지. 1-2시간을위한 부화. </li><li> 유리 접시 이상의 ECF 시약 1-2 ML을 배포하여 스캐너 유리 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 유리 플레이트 (아래 샘플 사이드)에 멤브레인를 전송하고 멤브레인 이상 ECF 시약의 또 다른 1-2 ML을 배포합니다. SaranWrap와 오버레이 조심스럽게 거리 멤브레인에서 공기 방울을 밀어. (당신은 유리 플레이트에 대한 누르면 막을 유지 SaranWrap 위에 성실히 접시를 배치할 수 있습니다.) </li><li> 여기 473 NM, 탐지 필터 LPB (510 NM), 해상도 50 μm의, 16 비트 신호를 졸업, CH1 400 V. (스캔 다음 설정으로 후지 FLA - 5100 형광 스캐너 ( &quot;1 레이저 한 이미지&quot;모드)를 사용 22cm의 크기는 22 멤브레인 당 약 15-20 분 정도 소요됩니다.) 옵션 : </li><li> 2~4시간 (이상)에 앉아 보자. </li><li> 6 단계 같이 스캔 반복합니다. </li></ol> 3. (NUF 버전) 스트립과 절차를 저장할 <ol><li> 백퍼센트 동부 표준시로 막을 전송부드러운 교반 10 분 실온에서 hanol와 부화. </li><li> 신선한 100 % 에탄올로 대체하고 실온에서 하룻밤 품어. (분리막은 며칠 동안 에탄올에 남아있을 수 있습니다.) </li><li> 증류수와 에탄올로 교체 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> SDS (최종 0.5 % SDS) 하이브리드화 튜브 100 ML 물 10 % 5 ML을 추가하고 부드럽게 섞는다. 멤브레인를 추가합니다. </li><li> 80 ° C 1 H.위한 부화 </li><li> 깨끗한 빈 컨테이너로 막은을 전송. </li><li> 10% SDS 500 ML 물 5 ML (최종 0.1 % SDS)을 전자렌지에 활발한 끓일 수있는 비커와 열을 추가합니다. </li><li> 멤브레인 위에 가까운 끓는 0.1 % SDS 용액을 붓고 부드럽게 몇 분 동안 선동. 실온으로 냉각하도록 허용합니다. </li><li> 적어도 10 분 멸균 100 MM 트리스 산도 8 적어도 250 ML에 씻어. </li><li> 랩 SaranWrap에 막과 테이프로 조심스럽게 닫습니다 가장자리. 4 스토어 ° C. (세포막 밖으로 건조 절대 필요합니다.) </li></ol>

스트립 절차는 최적화되지 않았습니다. 그러나, 제조 업체의 지침 (2 세척 각각 100 % 에탄올에 10 분, 60 ° C 0.5 %의 SDS 1 H 1 씻어)에 주어진 스트립 절차가 부족합니다. 100 % 에탄올에 적어도 하룻밤 배양은 ECF의 반응 생성물을 분해하는 데 필요한, ​​100 % 에탄올에 며칠 보육은 막을 reprobe 수있는 능력에 아무런 악영향이없는 것으로 나타납니다. 제조 업체의 SDS 치료도 부족 것으로 보인다. NUF 80 1 H를 시도했다 ° C 0.5 % SDS는 성공에 가까운 끓는 0.1 % SDS 한 치료를 다음과. 트레이시 한 시간이 거의 끓는 0.1 % SDS로 오버 붓는 것은 충분 것으로 나타났습니다. 유용한 힌트 : 하이브 리다이 제이션 버퍼, 하이브리드화 튜브, 세척 및 기본 버퍼는 60 preheated해야 ° C 사전을 사용하고, 실험을하는 동안 그 온도에서 보관해야합니다. 예를 들어, 포장되어 온도계와 열판에 버퍼를 유지, 코닝 열판, 60 약 3 결과의 설정 ° C.에

metagenomic 도서관 대규모 화면

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

이전 경작하지 않고 미생물의 게놈 시퀀스의 연속 Metagenomic 라이브러리 아카이브 큰 조각. metagenomic 라이브러리를 생성하고 검사를위한 간소화된 절차를 생성하는 것은 미개한 미생물 assemblages의 유전과 신진 대사 특성에 효율적으로 높은 처리량을 수사 따라서 유용합니다. 여기, 주요 프로토콜은 우리가 정확하게 교대 로봇 계측과 (인간) 수동 개입에 따라 긴 프로세스를 설명하기위한 가장 유용한 형식입니다 제안 비디오에 제공됩니다. 첫째, 우리는 스물네 384 자 도서관 접시에서 중복 식민지를 포함할 수 있습니다 각각의 고밀도 macroarray의 점막에 라이브러리 클론을 지점으로 로봇을 고용. 자동화는 또한 매우 치밀한 공간 준비로 도서관 클론의 다수에 맞게 필요한 규모의 소형화에 의해뿐만 아니라 정확성과 속도에 대해이 절차를 위해 필수적입니다,하지만. 일단 생성, 우리는 다음 macroarray의 점막이 프로브 라벨, 멤브레인 하이브리드화, 및 신호 감지를위한 표준 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 관심있는 유전자에 대한 검사를 할 수있는 방법을 보여주었다. 우리는 비디오와 함께 온라인으로 제공되는 모든하는 상세한 서면 관련된 단계에 대한 설명과 필요한 자료와 절차의 시각 데모를 보완.

Metagenomic 도서관 대규모 화면

메타게놈 라이브러리는 사전 배양 없이도 미생물로부터 유래한 연속적인 게놈 서열의 거대 단편들을 보관합니다. ...을 생성하는 것은

여기서 우리의 목표는 이러한 메타게놈 라이브러리의 콜로니를 멤브레인 필터에 접종하는 것이며, 각 필터에는 10,000개의 콜로니를 수용할 수 있습니다. 현재 하고 있는 작업은 이 나일론 필터를 블록 위에 올려놓고 평평하게 펴는 것입니다. 필터는 약간의 액체에 잠겨 있는데, 이는 단순히 배양 배지인 luria broth입니다.그런 다음 연구자는 습윤 처리된 이 막을 로봇으로 옮길 것이며, 로봇은 이 막에 10,000개의 콜로니를 자동으로 접종하게 됩니다. 이러한 절차에는 로봇 공학이 필수적인데, 10,000개의 콜로니를 하나의 막에 점적할 수 있는 인내심이나 정확성을 가진 사람은 사실상 없기 때문입니다. 로봇은 매우 반복적이고 미세한 공간적 규모의 작업을 높은 정확도로 수행할 수 있게 함으로써 유전체 과학을 실제로 발전시킨 요소 중 하나입니다.현재 로봇이 이 3개의 84웰 플레이트를 처리하도록 설정하는 중입니다. 이 3개의 84웰 플레이트의 각 웰에는 메타게놈 라이브러리에서 유래한 개별 콜로니가 들어 있습니다. 현재 로봇은 멤브레인에 스폿팅하는 데 사용할 접종 바늘을 멸균하고 있습니다. 바늘은 70% ethanol을 포함하여 여러 가지 용액을 거치며 멸균되며, 그 후 접종 바늘이 모든 콜로니가 담긴 3 84웰 플레이트에 담기게 됩니다.현재 빛을 이용해 멸균 및 건조가 진행되고 있습니다. 접종 바늘이 건조되면 로봇을 통해 플레이트가 공급됩니다. 각 콜로니는 실제로 블롯팅되어 복제되며, 이는 대조군으로서 도움이 됩니다.따라서 하이브리다이제이션 신호를 나타내는 동일한 두 개의 콜로니를 찾는 것입니다. 모든 콜로니를 필터에 스팟팅한 후, 여기 보이는 아가로스 플레이트에 다시 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.각 콜로니가 성장하게 되며, 화면의 어레이에서 필터 위에 10,000개의 콜로니가 형성된 것을 볼 수 있습니다. 물론 이러한 각 콜로니에는 재조합 DNA, 즉 이 경우에는 메타게놈 DNA의 수많은 복제본이 포함되어 있습니다. 이것은 우리가 제작한 중북태평양 해양 유래 샘플입니다.Saltram이 다음에 수행할 작업은 해당 멤브레인을 일련의 용액으로 옮기는 것입니다. 처음으로 옮기는 용액은 수산화나트륨 기본 용액이며, 이는 콜로니를 용해시킵니다. 기본적으로 세포벽을 녹여 DNA를 유리시킴으로써 DNA가 필터에 접촉할 수 있게 합니다.따라서 여기서는 해당 콜로니 내 모든 박테리아의 세포벽이 용해되어 DNA가 유리되는 과정이 일어납니다. 수산화나트륨에서 5분간 처리한 후, 필터를 옮깁니다. 다음 단계에서 끓는 증기에 넣어야 하므로 잠시 대기시키는 곳입니다.이것은 용해 단계의 두 번째 과정입니다. 먼저, 세포들은 수산화나트륨의 강염기 용액과 계면활성제인 sodium doude sulfate로 처리되었습니다. 이제 해당 콜로니들에 100°C의 고온 증기열을 가합니다.해당 염기와 세제, 그리고 열의 조합으로 세포가 완전히 용해되며 DNA가 필터 위에 유리됩니다. 스팀 처리기에서 5분 후, 필터를 중화 용액으로 옮깁니다. 중화 용액은 기본적으로 모든 염기를 중화시키며, 그 후 필터를 건조시킵니다.이제 이것은 중화 용액이며, 필터를 중화 용액에 5분 동안 더 둡니다. 다음으로 필터를 블로팅 페이퍼로 옮겨 일반적으로 하룻밤 동안 건조시킵니다. 용해된 세포가 있는 멤브레인을 하룻밤 동안 건조시킨 후, Tris, EDTA 및 protease K 용액에 넣으며, protease K는 멤브레인에 있는 모든 단백질을 제거하기 위해 사용합니다.보시는 것처럼 멤브레인을 뒤집어 모든 콜로니가 Proteinase K로 코팅되도록 합니다. 이를 통해 많은 외부 세포 물질과 단백질이 분해됩니다. 37°C에서 Proteinase K로 30분간 배양한 후, 멤브레인을 용액에서 꺼내어 블로팅 페이퍼 위에서 하룻밤 동안 건조시킵니다. 그러면 다음 단계인 하이브리드화(hybridization)를 진행할 준비가 됩니다.제 이름은 Vin fm이며, Delong 연구소의 박사후 연구원입니다. 저는 MIT에서 매크로 어레이 기술을 사용하여 계통 발생 마커와 기능성 유전자를 스크리닝하고 있습니다.거대 어레이(macro array) 라이브러리가 어떻게 준비되었는지 살펴보았습니다. 이제 스크리닝을 수행하는 나머지 절차를 안내해 드리겠습니다. 여기 거대 어레이가 있습니다. 다음 단계로 넘어가기 전에, UV 가교 결합(cross-linking)을 통해 DNA를 막(membrane) 자체에 고정시켜야 합니다.UV strata linker를 사용하여 이를 처리하고, 기기에 넣은 뒤 autocross link로 설정하여 시작합니다. 가교 결합이 완료되면, 막을 두 개의 반쪽으로 자르는 것이 좋습니다. 이렇게 하는 이유는 이 막들이 하이브리다이제이션 튜브 내부에서 하이브리다이제이션되는데, 막을 반으로 자르면 막의 내부 표면 전체가 하이브리다이제이션 용액에 완전히 노출될 수 있기 때문입니다.막이 말리지 않고 튜브 내부에 완벽하게 자리 잡은 것을 볼 수 있습니다. 이렇게 해서 하이브리다이제이션 튜브 안에 막이 잘 안착되었습니다. 다음으로 하이브리다이제이션 버퍼를 추가하겠습니다.60°C로 예열된 다른 튜브에 들어 있는 프로브를 포함합니다. 이것이 제가 선호하는 하이브리다이제이션 온도입니다. 프로브를 넣기 전에, 아니 넣으면서 설명해 드리자면, 하이브리다이제이션 버퍼는 제조사에서 검출 키트와 함께 제공한 것입니다.블로킹 시약을 첨가한 하이브리다이제이션 버퍼를 사용합니다. 여기에는 인산 버퍼, SDS, 염화 마그네슘, 염화 나트륨 그리고 약간의 요소가 포함되어 있습니다. 좋습니다. 다음 단계는 하이브리다이제이션 버퍼, 멤브레인, 프로브가 들어있는 이 튜브를 하이브리다이제이션 오븐에 넣는 것입니다. 오븐은 60 °C로 설정했으며, 그대로 두고 하룻밤 동안 배양합니다.이상적으로 하룻밤 동안 배양한 후, 결합되지 않은 프로브를 제거하기 위해 멤브레인을 세척할 차례입니다. 하이브리드화 버퍼나 프로브의 준비 과정에는 유해 물질이 포함되어 있지 않으므로, 싱크대에 그대로 버려도 안전합니다.60°C에서 가온 중인 1차 세척 버퍼를 가져오겠습니다. 이 버퍼는 멤브레인을 하룻밤 동안 하이브리드화한 온도와 동일하게 적절히 가열되었습니다. 세척 과정 또한 동일한 온도에서 진행될 예정입니다.일반적으로 1차 세척 완충액을 사용하여 각 5~10분 정도씩 총 3회 세척을 수행합니다. 다시 말씀드리자면, 세척 완충액은 방사성 물질이나 알려진 유해 화학 물질을 포함하지 않으므로, 각 세척 주기 후에 싱크대에 그대로 버리시면 됩니다. 60°C의 1차 세척 완충액으로 3회 세척하였습니다.이제 멤브레인의 2차 세척 단계입니다. 이 과정은 멤브레인을 ECF 검출 시약에 노출시키기 위한 적절한 pH로 조절해 줍니다. 다음으로, 실온에서 2차 세척 버퍼를 사용하여 멤브레인을 세척합니다. 이때 핀셋을 사용하여 멤브레인을 꺼내거나, 매우 주의 깊게 장갑을 낀 손을 사용할 수도 있습니다. 다만, 손이나 장갑에 묻어 있을 수 있는 오염 물질로 인해 멤브레인이 오염되지 않도록 반드시 뒷면이나 가장자리 부분만 잡아야 합니다.막을 2차 세척 완충액이 들어 있고 상온으로 맞춰둔 용기로 옮겨야 합니다. 막을 평평하게 잘 펴서 놓아주십시오. 때로는 막이 서로 겹칠 수도 있으나, 이는 크게 중요하지 않습니다.이 특정 단계는 막의 pH를 평형화하는 과정임을 기억하십시오. 그 후 이를 인큐베이션합니다. 원하신다면 가볍게 쉐이킹(rocking)을 해주셔도 됩니다.그것이 특별히 유용하거나 해롭다고 생각하지 않았습니다. 그래서 다시 벤치 위에 5분에서 10분 정도 그대로 두었고, 그 후 2차 세척을 한 번 더 반복했습니다. 이렇게 하여 2차 세척의 두 번째 단계가 완료되었습니다.이제 검출을 위한 준비 단계입니다. 확장해 보겠습니다. 먼저 새라랩(saran wrap)을 펼쳐 준비합니다. 멤브레인을 새라랩 위에 놓고, 그 위에 검출 시약을 부은 다음 새라랩을 다시 덮어 접습니다. 이렇게 하면 검출 시약을 담을 수 있는 작은 파우치 형태가 만들어집니다.여기에 준비된 멤브레인이 있습니다. 여분의 세척 버퍼를 여러 장 겹쳐 놓은 마른 종이 타월 위로 배출한 후, 멤브레인을 Theran wrap 위에 펼쳐 놓습니다. 미리 혼합된 ECF 검출 시약이 준비되어 있을 것입니다.이들은 보통 냉동고에 수개월 동안 보관할 수 있으며, 단순히 시약을 멤브레인 위에 붓기만 하면 됩니다. 남은 부분은 랩으로 감싸서 접어 둡니다.끝단이나 가장자리를 안으로 접어 작은 주머니 형태를 만든 후, 알루미늄 호일로 검출 과정 전체를 감싸 보호합니다. 이 상태로 5~10분 정도 둡니다. 이제 첫 번째 백에서 검출 시약을 배출할 시간입니다.제가 랩의 일부를 벤치에 테이프로 고정해 둔 것을 보실 수 있을 것입니다. 랩 특유의 달라붙는 성질을 방지하기 위해 이 방법을 사용하면 매우 유용합니다. 다시 한번 말씀드리지만, 종이 타월 더미에 가볍게 두드려 수분을 제거한 후, 벤치에 미리 세팅해 둔 깨끗한 새 랩 위로 옮기는 것이 좋습니다.이제 검출 화학물질들이 대부분 제거되었습니다. 신호가 발현될 수 있도록 약 2시간 동안 멤브레인을 배양할 준비가 되었습니다. 2시간이 지났으며, 이제 멤브레인의 신호를 검출할 준비가 되었습니다. 이때 형광 스캐너를 사용하여 멤브레인을 스캔하며, 다시 한번 강조하지만 멤브레인의 가장자리 부분만 잡고 취급합니다.막과 유리 사이에 형성된 기포를 피펫으로 밀어내어 제거하는 것이 유용할 수 있습니다. 이제 스캔을 준비하겠습니다. 페이스 플레이트에서 막으로 덮여 있던 영역을 설정하고 4 및 73 nm에서 스캔합니다.따라서 완료된 스캔 이미지를 확대하면 이 이미지와 유사한 결과를 얻게 됩니다. 바로 여기에 신호가 있습니다. 서로 마주 보는 두 개의 점이 나타나면 그것이 양성 신호라는 표시입니다.여기에 첫 번째 예시가 있고, 여기에 두 번째 예시가 있습니다. 따라서 막의 어느 부분에 신호가 있는지 확인하면, 해당 특정 신호가 어떤 플레이트의 어느 웰에 해당하는지 역추적합니다. 이를 통해 스크리닝으로 식별하려던 특정 유전자를 어떤 fo smidt가 보유하고 있는지 알 수 있습니다.그리고 smid를 확인했다면, 원하는 대상을 찾을 수 있습니다. 한 가지 방법은 전체 smid 삽입물을 시퀀싱하여 관심 있는 유전자를 찾는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

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