초파리 남성 부속샘 박리: 2차 세포를 분리하는 방법

- 해부 현미경과 혈청 보충 매체에서 겸자로 각 파리의 생식관을 제거합니다. 먼저, 생식관과 함께 했을 수 있는 소화관 부분을 제거합니다. 부속샘과 사정관을 분리하려면 고환, 사정구, 말단을 제거합니다. PBS에서 1-2분 동안 조직을 씻어 혈청을 제거합니다. 그런 다음 해리 솔루션으로 전송합니다.

땀샘 내부의 세포를 해리 용액에 노출시키려면, 집게로 각 땀샘의 중심을 잡고 한 쌍의 날카로운 집게로 땀샘을 잘라냅니다. 분비샘의 근위부와 사정관을 제거하여 짝짓기에 관여하는 단백질을 분비하는 역할을 하는 희귀한 2차 세포 집단을 포함하는 분비선의 말단부를 남깁니다. 마지막으로, 분해를 준비하기 위해 액세서리 글랜드 팁을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 프로토콜에서는 전사체 분석을 위해 2차 세포를 분리하기 위해 부속샘을 절개합니다.

- 절차를 시작하기 전에 글랜드를 다루기 위해 둥글고 넓은 200마이크로리터 팁을 자르고 화염을 일으키고 여러 1000마이크로리터 팁의 팁 구멍을 화염 근처에 1초 미만 동안 통과시켜 구멍을 좁힙니다. 그런 다음 흡입 속도에 따라 수정된 팁을 더 좁은 팁에서 더 넓은 팁으로 정렬합니다. 부속샘 박리의 경우, 얼음 위의 유리 접시에 20-25마리의 수컷 초파리를 놓고 집게와 해부 현미경을 사용하여 수컷 파리 한 마리의 생식관을 제거합니다.

고환과 사정구를 포함한 다른 모든 조직에서 부속샘 쌍을 제거하고 부속샘을 실온에서 혈청이 보충된 배지가 들어 있는 유리판으로 옮깁니다. 20쌍의 부속샘이 채취되면 PBS 접시에 땀샘을 실온에서 1-2분 동안 씻습니다. 세척이 끝나면 땀샘을 새로 준비된 해리 용액으로 옮기고 해부 현미경 아래에서 날카로운 집게를 사용하여 선엽의 중앙을 단단히 조입니다.

두 번째 겸자 한 쌍을 사용하여 날카로운 끝으로 조직을 잘라 부속샘의 근위부와 사정관을 2차 세포가 포함된 분비샘 부분과 분리합니다. 그런 다음 미리 젖은 화염의 둥근 너비 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 땀샘을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.