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생물학
0 조회수 • 4:49 분 • April 30th, 2023
- 깨끗하고 마취된 유충을 머리를 위로 향하게 하여 유리 덮개 슬립 아래에 장착하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 커버 슬립을 부드럽게 밀어 유충을 굴리고 위치를 조정하여 관심 영역을 노출시킵니다. 컨포칼 이미징을 사용하여 유충 신경 세포를 찾습니다. 표적 신경 세포 중 하나에 있는 특정 축삭을 손상 부위로 식별합니다.
그런 다음 손상을 유도하기 위해 이미징에 사용되는 것보다 더 높은 출력으로 대상 축삭을 이광자 레이저에 노출시킵니다. 이광자 레이저는 주변 조직에 대한 손상을 최소화하면서 살아있는 조직 내의 손상을 관통하고 정확하게 국소화할 수 있는 능력 때문에 사용됩니다.
표적 뉴런에 손상이 있어 축삭절개술 또는 축삭돌기 절단이 발생하면 즉시 레이저 노출을 중지하십시오. 마지막으로, 손상된 뉴런을 이미지화하여 원하는 시점에서의 퇴화와 후속 재생을 확인합니다.
예시 프로토콜에서는 현미경 검사를 위해 유충을 장착하고, 유충 감각 뉴런에 손상을 유도하고, 신경 재생을 추적합니다.
- 유충을 마취하는 것으로 시작하십시오. 흄 후드에 60mm 유리 접시를 15cm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 티슈 페이퍼 한 장을 접어 유리 접시에 담습니다. 디 에틸 에테르를 첨가 한 후 포도 한천 플레이트를 조직에 놓습니다.
다음으로, 유리 슬라이드에 중앙에 할로카본 27 오일 한 방울을 떨어뜨리고 네 모서리 각각에 진공 그리스 한 점을 놓습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 유충 한 마리를 한천 플레이트로 옮기고 유리 접시를 덮어 유충을 마취합니다. 용암이 움직임을 멈추자마자 머리를 똑바로 세운 상태에서 조심스럽게 할로카본 오일로 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드 위에 덮개 슬립을 놓고 유충에 닿을 때까지 부드럽게 누릅니다.
다음으로, 부드러운 힘을 사용하여 커버 슬립을 밀어 절제할 세포를 이광자 레이저가 가장 쉽게 부딪힐 수 있는 위치로 굴립니다. 위치는 어떤 뉴런을 대상으로 하는지에 따라 달라집니다. 이제 이광자 현미경 스테이지에 어셈블리를 고정하고 40x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 관심 세포에 초점을 맞춥니다.
소프트웨어에서 스캔 모드로 전환하고 저장된 프로토콜을 로드합니다. 핀홀이 완전히 열려 있는지 확인하십시오. 그런 다음 라이브 모드에서 관심 영역의 좋은 이미지를 얻습니다.
그런 다음 자르기 버튼을 사용할 수 있도록 라이브 스캔을 중지합니다. 자르기 기능을 사용하여 스캔 창을 조정하여 예상 부상 부위에만 대상 영역의 초점을 맞춥니다. 그런 다음 새 이미징 창을 엽니다. 이제 스캔 속도를 줄이고 레이저 강도를 높입니다. 그런 다음 연속 버튼을 전환하여 스캔을 시작 및 중지합니다.주의 깊게 관찰하십시오. 형광이 급격히 증가하면 스캔을 종료하십시오.
그런 다음 원래 이미징 창으로 다시 전환하고 라이브 모드를 선택하고 초점을 조정하여 방금 대상으로 한 영역을 찾습니다.
- 성공적인 부상의 좋은 징후는 부상 부위에 작은 분화구, 고리 모양의 구조물 또는 국부적인 파편이 나타나는 것입니다. 레이저 출력이 너무 높으면 치명적일 수 있는 큰 손상 영역이 보입니다.
- 이제 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 부상당한 유충을 효모 페이스트가 있는 새 플레이트에 옮깁니다. 프로피온산에 적신 티슈와 함께 60mm 접시에 접시를 넣습니다. 그런 다음 플레이트를 배양 온도로 되돌립니다.
유충의 후속 이미징을 위해 저장된 컨포칼 설정을 사용하고 25x 대물렌즈로 z 스택 이미지를 수집합니다. 재생을 정량화할 수 있도록 정규화 지점을 포함해야 합니다.