유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

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- 주입된 배아가 G0 성체로 발달하면 모든 개별 파리를 적절한 밸런서 스톡으로 교차시켜 잠재적인 F1 CRISPR 편집 라인을 확장하고 게놈 변형의 유전을 추적할 수 있습니다. 그런 다음, 무작위로 선택된 F1 단일 수컷을 적절한 밸런서 암컷으로 교배하여 F1 수컷이 돌연변이에 양성인 경우 자손을 회복할 수 있습니다. 십자가가 잡히면 F1 수컷을 튜브로 옮겨 스크리닝합니다.

게놈 DNA를 추출하려면 추출 버퍼가 들어 있는 피펫 팁으로 파리를 찌그러뜨립니다. 조직이 분해되면 액체를 배출합니다. 추출 버퍼에는 샘플의 단백질을 소화하고 고열에 의해 비활성화되는 효소인 proteinase K가 포함되어 있습니다.

이제 DNA에 접근할 수 있으므로 PCR 스크리닝을 진행하십시오. 예를 들어, 새 염기서열을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용합니다. 변형이 있는 경우에만 두 번째 프라이머 결합과 PCR 산물이 증폭됩니다. 이 예에서는 branchless 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하는 transactivation sequence의 삽입을 위해 PCR에 의해 파리가 사육되고 스크리닝되는 것을 볼 수 있습니다.

- 이전에 guide RNA 발현 플라스미드와 치환 공여자가 모두 주입된 nos-Cas9 배아가 성체로 발달하면 cross G0는 표적 대립유전자에 적합한 라인에서 balancer 파리로 개별적으로 날아갑니다. 이산화탄소 패드에서 각 G0 교배의 F1 자손을 마취하고 실체 현미경으로 10-20명의 수컷을 무작위로 선택합니다. 개별적으로 선택된 각 수컷을 표적 대립유전자에 적합한 라인에서 밸런서 암컷으로 교차시킵니다.

F2 유충이 부화하면 각 교배에서 F1 아버지를 선택합니다. 완충액을 분배하지 않고 50마이크로리터의 찌그러짐 완충액이 들어 있는 피펫 팁으로 각 파리를 10-15초 동안 찌그러뜨려 게놈 DNA를 추출합니다. 그런 다음 남은 버퍼를 튜브에 분배하고 잘 섞습니다.

섭씨 37도에서 20-30분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 섭씨 95도의 열 블록에 1-2분 동안 넣어 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다. 10,000 회 g에서 5 분 동안 회전 한 후 추가 PCR 분석을 위해 제제를 섭씨 4도에서 보관하십시오.

primers forward 1 및 reverse 1을 사용하여 3단계 PCR 기반 screening을 수행하여 삽입 또는 교체의 존재 여부를 스크리닝합니다. forward 2 및 reverse 2 primer를 사용하여 PCR을 수행하여 3개의 prime region에서 삽입 또는 교체를 확인합니다. 프라이머 M13F를 사용하여 PCR을 수행하고 3을 역으로 하여 HDR의 종단을 확인합니다.

- 확인된 엔드아웃 HDR로 플라이 라인을 유지하고 F2 세대의 밸런스 스톡을 설정합니다. 밖으로 밸런서는 다른 염색체의 의도하지 않은 돌연변이를 제거하기 위해 다시 날아갑니다.

14:23

에서 상동 재조합 구문을 Recombineering 초파리

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Last updated: 25 July 2026