화학적 건조: 주사 전자 현미경(SEM)을 위한 생물학적 시료 준비

0 조회수4:17 • April 30th, 2023

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- 먼저 고정된 샘플을 탈수 및 건조하여 기존 주사전자현미경(SEM)의 감소된 작동 압력에서 가스와 액체 상태의 물 제거로 인한 샘플 왜곡을 줄이는 것으로 시작합니다.

샘플을 탈수하려면 100% 에탄올에 도달할 때까지 물에 든 에탄올 농도를 증가시켜 세척하십시오. 그런 다음 샘플이 순수 건조제로 세척될 때까지 에탄올의 화학 건조제로 이 과정을 반복합니다. 샘플과 건조제를 증발 접시에 옮깁니다. 최소한의 추가 건조제로 덮고 흄 후드에서 밤새 말리십시오.

다음으로, 준비된 샘플을 탄소 접착 테이프를 사용하여 현미경 스터브 상단에 장착합니다. 마지막으로, 스텁의 가장자리에 은색 페인트를 바른 다음 스텁의 가장자리에서 각 샘플까지 적용하여 원치 않는 이미지 아티팩트를 초래할 수 있는 과도한 전자의 축적을 줄입니다.

이 실험에서는 초파리(Drosophila melanogaster)를 건조제 HMDS를 사용하여 SEM 분석을 준비합니다.

- Drosophila melanogaster를 준비하려면 마취된 파리를 섭씨 4도에서 2시간 동안 1ml의 고정제에 담가 완전히 잠겼는지 확인합니다.

유리 피펫을 사용하여 고정물을 제거합니다. 고정된 초파리 샘플을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 1ml의 0.1몰 인산염 완충액, pH 7.2를 사용하여 실온에서 10분 동안 3회 세척합니다. 유리 피펫을 사용하여 세척할 때마다 제거하고 샘플을 제거하지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 사용하여 10ml 용량의 마이크로분리 튜브에서 샘플을 탈수합니다. 유리 피펫을 사용하여 세척할 때마다 제거하고 샘플을 제거하지 않도록 주의하십시오. 샘플을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 100% 에탄올이 덮일 만큼만 담을 수 있도록 보관합니다.

HMDS를 사용하여 파리의 화학적 건조를 수행하려면 먼저 100% 에탄올 용액을 1:2 HMDS 용액과 100% 에탄올로 20분 동안 교체합니다. 그런 다음 용액을 20분 동안 HMDS와 100% 에탄올의 2:1 용액으로 교체합니다. 마지막으로 이 솔루션을 20분 동안 100% HMDS로 바꾼 다음 프로세스를 한 번 반복합니다.

1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브와 HMDS에 담긴 샘플을 일회용 알루미늄 칭량 접시에 옮깁니다. 100% HMDS를 샘플을 덮을 수 있을 만큼의 신선한 100% HMDS로 교체합니다. 알루미늄 접시 안의 샘플을 화학 흄 후드에 직접 넣고 상자와 같은 헐렁한 뚜껑으로 건조시켜 파편이 샘플에 떨어지는 것을 방지하고 12-24시간 동안 건조시킵니다.

Drosophila를 장착하려면 알루미늄 장착 스텁의 바닥에 라벨을 붙입니다. 정밀 핀셋을 사용하여 건조 된 파리를 해부 현미경 아래 스터브 상단에 고정 된 탄소 접착 탭의 원하는 위치에 놓습니다. 그루터기의 바깥쪽 가장자리 주위에 은색 전도성 접착제를 바르십시오.

이쑤시개를 사용하여 은색 페인트를 파리에 연결하여 전도성을 보장하고 페인트가 원하는 이미징 영역에 닿지 않도록 합니다. 스텁을 스텁 홀더 상자에 넣습니다. 그런 다음 열린 스텁 홀더 상자를 건조제에 넣고 은색 페인트를 최소 3시간 동안 건조시킵니다.

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