광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정

개별 coli 세포의 굽힘 강성을 결정하기 위해, 먼저 박테리아를 대수 증식기까지 배양한 다음 화학적으로 처리된 커버슬립 표면에 부착시킵니다. 표면에 이미 부착된 세포가 더 성장하여 유연한 끝단이 형성되도록 합니다. 다음으로 유전체 비드를 흘려보내 비드를 포획하고, 이를 세포의 유연한 팁 쪽으로 굽힙니다.

절차의 마지막 단계는 광학 트랩으로 세포를 구부려 결과로 나타나는 강제 변위 데이터를 측정하는 것입니다. 세포의 굽힘 강성은 강제 변위 데이터에 대한 선형 피팅을 통해 계산할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 프린스턴 대학교의 Louis Sickler 통합 유전체학 연구소 및 물리학과의 Joshua Shere 교수 연구실 소속 Steven Wong입니다.

오늘은 개별 E. coli 세포를 구부리고 세포 강성을 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 사용하여 다양한 세포 내 구조가 박테리아 세포의 기계적 무결성에 어떻게 기여하는지 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, LB 배지에서 임의의 e coli 세포 3 mL를 대수 성장기까지 배양하십시오. 세포의 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.2에서 0.4 사이가 되면, 사상 성장을 유도하기 위해 배양액에 50 µg/mL의 cephalexin을 첨가하여 15분 동안 처리하십시오. 이 15분 동안 플로우 챔버를 제작하십시오.

두 조각의 양면테이프를 3 mm 간격으로 유리 슬라이드에 부착하고 그 위에 커버슬립을 테이프로 고정합니다. 테이프 조각 사이의 간격은 액체가 흐를 수 있는 채널을 형성합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 1% polyethaline 수용액 10 µL를 플로우 챔버에 흘려 넣어 커버슬립을 PEI로 코팅한 후 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 챔버의 한쪽 끝에 200 µL의 물을 흘려보내고 반대쪽 끝에서 진공으로 수집하여 세척합니다. cephalexin 존재 하에서 박테리아를 15분 동안 배양한 후, 마이크로 원심분리기를 사용하여 1 mL의 세포를 침전시키고 cephalexin이 포함된 200 µL의 LV에 재현탁합니다. 다음으로, 다시 마이크로 피펫을 한쪽 끝에 사용하고 반대쪽 끝에 진공을 걸어, 코팅된 커버슬립이 들어있는 챔버에 농축된 세포 배양액 50 µL를 흘려 넣고 3분 동안 배양합니다.

그런 다음 세팔렉신(cephalexin)이 첨가된 Vel B 50 µL로 세척합니다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해, 챔버를 37 °C에서 30분에서 1시간 동안 배양하여 부착된 세포를 성장시킨 후, 세포가 배양되는 동안 광학 트래핑 장치에 배치합니다. 0.5 µm 직경의 폴리스티렌 비드 3 µL를 증류수에 희석된 0.1% Polylysine에 30분 동안 배양하여 폴리라이신 코팅 비드를 준비합니다.

비드 배양이 완료되면, 마이크로 원심분리기로 원심분리 후 1 mL의 물에 다시 현탁시키는 과정을 세 번 반복하여 세척합니다. 그 다음 비드를 박테리아에 결합시키고 세포의 결합 강성을 측정하십시오. 이 프로토콜에서 가장 어려운 부분은 굽힘 강성을 측정하기에 적합한 세포를 찾고 식별하여 인식하는 것입니다. 여기서 적합한 세포란 고정단과 자유단이 명확하게 구분된 세포를 의미합니다.

현미경의 플로우 챔버에서 끝단이 확실하게 고정된 세포를 찾습니다. 일부 세포는 한쪽 끝만 부착되어 있어, 다른 쪽 끝에 가해지는 굽힘 힘으로 인해 세포가 굽어지지 않고 세포 전체가 회전할 수 있습니다. 적합한 세포를 찾으려면 조이스틱으로 제어되는 스테이지 이동을 통해 트랩으로 각 세포를 빠르게 굽혀 보십시오.

적절한 세포를 찾으면, cephalexin이 포함된 lb로 비드 용액을 2배 희석하고, 비드 용액 30 microliters를 플로우 챔버의 한쪽 끝에 피펫팅하여 넣은 뒤 반대쪽 끝에서 Kim wipe 티슈로 천천히 흘려보냅니다. 부유하는 비드를 광학 트랩으로 포착하여 세포의 자유단에 접촉시킵니다. 마이크로피펫과 Kim white 티슈를 사용하여 LB 내 50 microliters의 cephalexin으로 챔버를 다시 세척함으로써 부착되지 않은 비드들을 제거합니다. 다음으로, 맞춤 제작된 LabVIEW 프로그램을 실행하여 세포에 굴곡력을 가하고 강제 변위 데이터를 기록합니다.

먼저, 검출 레이저 빔 내에서 부착된 비드를 RA 스캐닝하여 3D PSD 전압 신호를 기록함으로써 검출기 응답을 보정합니다. 그런 다음 현미경 이미지에서 세포의 장축을 확인합니다. 세포의 장축을 확인한 후, 장축에 수직인 방향으로 세포를 단계적으로 이동시키면서 이동 거리와 광학 트랩 중심으로부터의 비드 변위를 기록합니다.

마지막으로, 이전에 측정한 트랩 강성을 사용하여 변위 값을 인가된 힘으로 변환하고 저장합니다. 여기서 파일로 저장되는 팁 변위와 힘은 단일 세포에 대한 강제 변위 데이터입니다. 이 직선의 기울기가 세포의 굽힘 강성입니다.

지금까지 e coli의 굽힘 강성을 광학 트랩과 결합하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 사용할 때는 고정된 끝단과 자유로운 끝단이 명확하게 구분되는 양호한 세포를 찾는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이상으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.