Name: 광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 배우세요 광학 트랩을 사용하여 E. coli 세포의 굽힘 강성을 측정하는 방법을. 세포를 배양하고 표면에 고정한 후 광학 트랩으로 힘을 가해 변위 데이터를 분석하면 세포 역학 특성을 정밀하게 파악할 수 있습니다.

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우리는 표면에 바인딩 세포에 Mingzhai Sun에서 유용한 조언을 인정합니다. 우리는 귀중한 토론 네드 윈그린 및 Zemer Gitai 감사드립니다. 이 연구는 보건 부여 P50GM07150 국립 연구소, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 보너스 PHY - 0844466과 알프레드 P. 슬로안 재단에 의해 지원되었다.

<ol><li> 지수 상 (OD가 = 0.2-0.4)로 Luria - Beltrani 국물 (LB) 매체 E. 대장균 세포를 성장. </li><li> filamentous 성장을 유도 15 분 세팔렉신 50 μg / ML과 보충 LB의 문화를 성장하고 원심 분리를 통해 5 번하여 문화를 집중. </li><li> 흐름 챔버로 물에 희석 1 % polyethylenimine을 흐르는하여 PEI - 코팅 coverslip을 확인하고, 5 분 부화 후 물로 씻으십시오. </li><li> 챔버에 집중 세포 배양을 흐름, 그리고 무소속의 세포를 제거하는 3 분 후 LB 및 세팔렉신 (50μg/mL)의 혼합물로 세탁. </li><li> 37 챔버를 품어 ° C가에 대한 연결된 세포 광학 트래핑 악기에 배치하기 전에기를 30 분 - 1 시간. </li><li> 30 분 물에 희석 0.1 % polylysine에서 0.5 - μm의 지름의 폴리스티렌 비즈 (뱅스 연구소)을 잠복기로 polylysine - 코팅 구슬을 만듭니다. 다음 비즈에게 3 번 씻은 후 물에 resuspend. </li><li> 세팔렉신 (50μg/mL)와 LB에 두 요소에 의해 비드 솔루션을 희석하고, 흐름 챔버로를 추가합니다. </li><li> 광학 부동 구슬을 함정과 세포의 자유로운 끝에 그것을 만져. (우리는 샘플의 움직임을 제어하는​​ 미친 도시 연구소 압전 단계를 사용합니다.) 적합한 전지 / 구슬 조합이 발견되면, 무소속의 구슬을 제거 LB (50μg/mL)에 세팔렉신와 챔버를 세척. </li><li> 셀 및 기록 힘 - 변위 데이터를 절곡 세력을 적용하는 맞춤 작성된 LabView 프로그램을 실행합니다. 프로그램 세부 정보 <ol class="lalpha"><li> 래스터는 감지 레이저 빔 및 녹화 3D PSD 전압 신호 내에 첨부된 비드를 검색하여 검출기 응답을 보정합니다. </li><li> 현미경 이미지의 세포 긴 축을 식별합니다. </li><li> 세포 긴 축에 직각 방향으로 단계에서 세포로 이동합니다. </li><li> 광학 트랩에서 거리 이동과 변위를 기록합니다. </li><li> 이전에 측정된 트랩 강성을 사용하여 강제로 적용 변위 변환 및 팁 변위 및 파일 강제 저장합니다. </li></ol></li></ol> 성공에 비밀 : 8 단계에서), 하나는 잘 정의된 붙어 끝에있는 세포를 찾을 수 있어야합니다. 일부 세포는 단지 다른 끝에 하나의 팁 및 굽힘 강제에 붙어있는 것은 전체 셀 pivoting보​​다는 굽힘 발생합니다. 적당한 쌍을은 조이스틱 제어 스테이지 모션을 사용하여 수동으로 신속하게 각각의 세포를 굽힘에 의해 발견됩니다. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1.이 그림은 하나의 세포에 대한 힘 - 변위 데이터를 보여줍니다. 이 라인의 경사가 세포의 굽힘 강성이다.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

이 문서의 비디오 제작은 이러한 연구에 사용되는 악기를 생산 매드 도시 연구소에 의해 후원되었다.

여기에 제시 프로토콜은 양적 세균 세포의 굽힘 특성을 측정하기 위해 설계되었습니다. 실험 설정은 filamentously 성장을 만들 수있는 막대 모양의 세포에 적용할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 E.의 굽힘 강성에 cytoskeletal 필라멘트의 효과를 조사하기 위해이 설정을 사용해야 대장균 세포. 이 같은 기술은 세포의 전반적인 굽힘 강성을 결정하는 압력, 셀 벽의 강성 및 기타 세포 구성 요소의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>cephalexin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polyethylenimine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polylysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>0.5-&amp;mu;m-직경 폴리스티렌 비드</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Nano-LP 시리즈 나노포지셔닝 시스템</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

우리는 filamentous 막대 모양의 박테리아의 굽힘 강성을 측정하기위한 프로토콜을 개발했습니다. 미군은 광학 트랩, 높은 강도 레이저가 현미경의 목표 렌즈에 의해 아주 작은 지점에 초점을 맞춘 때 형성 빛이 만든 미세한 입체적인 온천과 함께 적용됩니다. 세포를 구부 위해, 우리는 먼저 화학 처리 coverslip에 사는 박테리아를 바인딩합니다. 이러한 세포의 성장에 따라, 세포의 중간 coverslip에 바인딩 남아 있지만, 성장 끝나는이 구속 무료입니다. 마약 세팔렉신와 filamentous 성장을 유도함으로써, 우리는 다른 끝이 무소속과 굽힘 세력의 영향을 유지하면서 세포의 한쪽 끝을은 표면에 붙어어진 세포를 식별할 수 있습니다. 굽​​힘 힘이 그러면 성장 세포의 팁에 polylysine - 코팅 비드를 바인딩하여 광학 트랩과 함께 적용됩니다. 힘 및 비드의 변위 모두 기록되고 세포의 굽힘 강성이 관계의 기울기집니다.

우리는 세포 굽힘 강성을 측정 광학 트랩과 커버 - 미끄럼 방지 표면에 부착된 굽힘 filamentous 박테리아 세포에 대한 프로토콜을 제시한다.

우리는 필라멘트 형태의 막대 모양 박테리아의 굽힘 강성(bending rigidity)을 측정하는 프로토콜을 개발했습니다. 광학 집게(optical trap), 즉 미세한...

개별 coli 세포의 굽힘 강성을 결정하기 위해, 먼저 박테리아를 대수 증식기까지 배양한 다음 화학적으로 처리된 커버슬립 표면에 부착시킵니다. 표면에 이미 부착된 세포가 더 성장하여 유연한 끝단이 형성되도록 합니다. 다음으로 유전체 비드를 흘려보내 비드를 포획하고, 이를 세포의 유연한 팁 쪽으로 굽힙니다.절차의 마지막 단계는 광학 트랩으로 세포를 구부려 결과로 나타나는 강제 변위 데이터를 측정하는 것입니다. 세포의 굽힘 강성은 강제 변위 데이터에 대한 선형 피팅을 통해 계산할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 프린스턴 대학교의 Louis Sickler 통합 유전체학 연구소 및 물리학과의 Joshua Shere 교수 연구실 소속 Steven Wong입니다.오늘은 개별 E. coli 세포를 구부리고 세포 강성을 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 사용하여 다양한 세포 내 구조가 박테리아 세포의 기계적 무결성에 어떻게 기여하는지 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, LB 배지에서 임의의 e coli 세포 3 mL를 대수 성장기까지 배양하십시오. 세포의 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.2에서 0.4 사이가 되면, 사상 성장을 유도하기 위해 배양액에 50 µg/mL의 cephalexin을 첨가하여 15분 동안 처리하십시오. 이 15분 동안 플로우 챔버를 제작하십시오.두 조각의 양면테이프를 3 mm 간격으로 유리 슬라이드에 부착하고 그 위에 커버슬립을 테이프로 고정합니다. 테이프 조각 사이의 간격은 액체가 흐를 수 있는 채널을 형성합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 1% polyethaline 수용액 10 µL를 플로우 챔버에 흘려 넣어 커버슬립을 PEI로 코팅한 후 5분 동안 배양합니다.그런 다음 챔버의 한쪽 끝에 200 µL의 물을 흘려보내고 반대쪽 끝에서 진공으로 수집하여 세척합니다. cephalexin 존재 하에서 박테리아를 15분 동안 배양한 후, 마이크로 원심분리기를 사용하여 1 mL의 세포를 침전시키고 cephalexin이 포함된 200 µL의 LV에 재현탁합니다. 다음으로, 다시 마이크로 피펫을 한쪽 끝에 사용하고 반대쪽 끝에 진공을 걸어, 코팅된 커버슬립이 들어있는 챔버에 농축된 세포 배양액 50 µL를 흘려 넣고 3분 동안 배양합니다.그런 다음 세팔렉신(cephalexin)이 첨가된 Vel B 50 µL로 세척합니다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해, 챔버를 37 °C에서 30분에서 1시간 동안 배양하여 부착된 세포를 성장시킨 후, 세포가 배양되는 동안 광학 트래핑 장치에 배치합니다. 0.5 µm 직경의 폴리스티렌 비드 3 µL를 증류수에 희석된 0.1% Polylysine에 30분 동안 배양하여 폴리라이신 코팅 비드를 준비합니다.비드 배양이 완료되면, 마이크로 원심분리기로 원심분리 후 1 mL의 물에 다시 현탁시키는 과정을 세 번 반복하여 세척합니다. 그 다음 비드를 박테리아에 결합시키고 세포의 결합 강성을 측정하십시오. 이 프로토콜에서 가장 어려운 부분은 굽힘 강성을 측정하기에 적합한 세포를 찾고 식별하여 인식하는 것입니다. 여기서 적합한 세포란 고정단과 자유단이 명확하게 구분된 세포를 의미합니다.현미경의 플로우 챔버에서 끝단이 확실하게 고정된 세포를 찾습니다. 일부 세포는 한쪽 끝만 부착되어 있어, 다른 쪽 끝에 가해지는 굽힘 힘으로 인해 세포가 굽어지지 않고 세포 전체가 회전할 수 있습니다. 적합한 세포를 찾으려면 조이스틱으로 제어되는 스테이지 이동을 통해 트랩으로 각 세포를 빠르게 굽혀 보십시오.적절한 세포를 찾으면, cephalexin이 포함된 lb로 비드 용액을 2배 희석하고, 비드 용액 30 microliters를 플로우 챔버의 한쪽 끝에 피펫팅하여 넣은 뒤 반대쪽 끝에서 Kim wipe 티슈로 천천히 흘려보냅니다. 부유하는 비드를 광학 트랩으로 포착하여 세포의 자유단에 접촉시킵니다. 마이크로피펫과 Kim white 티슈를 사용하여 LB 내 50 microliters의 cephalexin으로 챔버를 다시 세척함으로써 부착되지 않은 비드들을 제거합니다. 다음으로, 맞춤 제작된 LabVIEW 프로그램을 실행하여 세포에 굴곡력을 가하고 강제 변위 데이터를 기록합니다.먼저, 검출 레이저 빔 내에서 부착된 비드를 RA 스캐닝하여 3D PSD 전압 신호를 기록함으로써 검출기 응답을 보정합니다. 그런 다음 현미경 이미지에서 세포의 장축을 확인합니다. 세포의 장축을 확인한 후, 장축에 수직인 방향으로 세포를 단계적으로 이동시키면서 이동 거리와 광학 트랩 중심으로부터의 비드 변위를 기록합니다.마지막으로, 이전에 측정한 트랩 강성을 사용하여 변위 값을 인가된 힘으로 변환하고 저장합니다. 여기서 파일로 저장되는 팁 변위와 힘은 단일 세포에 대한 강제 변위 데이터입니다. 이 직선의 기울기가 세포의 굽힘 강성입니다.지금까지 e coli의 굽힘 강성을 광학 트랩과 결합하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 사용할 때는 고정된 끝단과 자유로운 끝단이 명확하게 구분되는 양호한 세포를 찾는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이상으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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생물학

방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

선택된 유전체 미립자를 공기 중에 발사하고 안정적으로 포집하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

공기에서 유전체 미세 입자의 광학 트랩로드

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

배우세요 광학 트랩을 사용하여 E. coli 세포의 굽힘 강성을 측정하는 방법을. 세포를 배양하고 표면에 고정한 후 광학 트랩으로 힘을 가해 변위 데이터를 분석하면 세포 역학 특성을 정밀하게 파악할 수 있습니다.

광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정

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