CFU(Colony Forming Units) 계수: 파리 몸체의 박테리아 정량화

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생물학

0 조회수 • 3:55 분 • April 30th, 2023

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- 먼저, 원하는 발달 단계에서 파리를 채취하여 멸균 튜브에 넣습니다. 내부 미생물총(microbiota)만 세려면 파리의 외부를 70% 에탄올에 담가 살균합니다. 내부 및 외부 미생물군을 모두 측정하려면 이 멸균 단계를 건너뜁니다. 다음으로, 세라믹 비드와 조직 균질기를 사용하여 소량의 박테리아 성장 매체에서 파리를 분쇄하거나 유봉을 사용하여 수동으로 파리를 분쇄합니다. 샘플 오염을 방지하기 위해 외부 소스에서 박테리아를 유입하지 않도록 주의해야 합니다.

이제 배양할 수 있는 박테리아를 포함하는 균질한 혼합물이 있어야 합니다. 액체 박테리아 매체를 사용하여 균질산염의 부피를 높입니다. 균질액의 연속 희석을 수행하고 박테리아에 적합한 고체 성장 배지에 이러한 희석액을 일정한 부피로 플레이트화합니다. 박테리아가 성장함에 따라 접시에 군체가 형성됩니다. 10개에서 100개의 콜로니 범위를 가진 희석액을 찾아 샘플의 콜로니 형성 단위(CFU)를 측정합니다.

예시 프로토콜에서는 무균 파리에 gnotobiotic 또는 defined bacterial culture를 접종하고 CFU를 수집 및 측정합니다.

- 필터 팁을 사용하여 하룻밤 사이에 자란 100마이크로리터를 멸균 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 각 배양액 200마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 생물 안전 캐비닛에서 샘플을 제거하고 원심 분리하여 박테리아를 펠릿화합니다. 1배, 2배, 4배 희석한 후 멀티웰 플레이트 판독 분광 광도계에서 광학 밀도 또는 OD600을 측정합니다.

OD600을 얻은 후 피펫 팁으로 상층액을 제거하고 새 mMRS를 사용하여 펠릿을 다시 현탁합니다. 희석된 박테리아 균주를 동일한 비율로 혼합하여 다종 칵테일을 만듭니다. 50마이크로리터의 칵테일을 멸균 식단과 탈이온화된 계란이 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 바이알 사이의 오염을 방지하기 위해 난자 이식 후 박테리아를 반드시 추가하십시오. 그런 다음 접종된 튜브를 인큐베이터에 넣습니다.

Colony Forming Units 또는 CFU를 측정하려면 125 마이크로리터의 세라믹 비드와 125 마이크로리터의 mMRS 육수가 들어 있는 1.7 밀리리터 마이크로분리 튜브에 5마리의 파리를 옮깁니다. 조직 균질화기를 사용하여 파리를 균질화합니다. 파리가 완전히 남아 있어서는 안 됩니다. 다음으로, 균질액을 875마이크로리터의 mMRS로 희석하고, 균질액을 5초 동안 와류화한 다음, 120마이크로리터를 마이크로타이터 플레이트의 첫 번째 웰에 피펫팅합니다.

첫 번째 웰에서 10마이크로리터를 제거하고 MRS 70마이크로리터가 들어 있는 두 번째 웰에 추가합니다. 두 번째 웰의 내용물을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 두 번째 웰에서 70마이크로리터의 MRS가 포함된 세 번째 웰로 10마이크로리터를 옮기고 철저히 혼합합니다. 각 희석액 10마이크로리터를 mMRS 플레이트에 옮깁니다. 접시를 약간 기울여 희석액을 한천 표면 아래로 몇 밀리미터 정도 펴고 접시를 옮기기 전에 액체를 건조시킵니다. 뚜렷한 개별 콜로니가 보이면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10-100개의 분리된 콜로니가 있는 희석액에서 계산합니다. 마지막으로 플라이당 CFU를 계산합니다.

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